Recuperação e purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli e remoção de endotoxina utilizando adsorção em leito expandido

The growing interest and applications of biotechnology products have increased the development of new processes for recovery and purification of proteins. The expanded bed adsorption (EBA) has emerged as a promising technique for this purpose. It combines into one operation the steps of clarification, concentration and purification of the target molecule. Hence, the method reduces the time and the cost of operation. In this context, this thesis aim was to evaluate the recovery and purification of 503 antigen of Leishmania i. chagasi expressed in E. coli M15 and endotoxin removal by EBA. In the first step of this study, batch experiments were carried out using two experimental designs to define the optimal adsorption and elution conditions of 503 antigen onto Streamline chelating resin. For adsorption assays, using expanded bed, it was used a column of 2.6 cm in diameter by 30.0 cm in height coupled to a peristaltic pump. In the second step of study, the removal of endotoxin during antigen recovery process was evaluated employing the non-ionic surfactant Triton X-114 in the washing step ALE. In the third step, we sought developing a mathematical model able to predict the 503 antigen breakthrough curves in expanded mode. The experimental design results to adsorption showed the pH 8.0 and the NaCl concentration of 2.4 M as the optimum adsorption condition. In the second design, the only significant factor for elution was the concentration of imidazole, which was taken at 600 mM. The adsorption isotherm of the 503 antigen showed a good fit to the Langmuir model (R = 0.98) and values for qmax (maximum adsorption capacity) and Kd (equilibrium constant) estimated were 1.95 mg/g and 0.34 mg/mL, respectively. Purification tests directly from unclarified feedstock showed a recovery of 59.2% of the target protein and a purification factor of 6.0. The addition of the non-ionic surfactant Triton X-114 to the washing step of EBA led to high levels (> 99%) of LPS removal initially present in the samples for all conditions tested. The mathematical model obtained to describe the 503 antigen breakthrough curves in Streamline Chelanting resin in expanded mode showed a good fit for both parameter estimation and validation steps. The validated model was used to optimize the efficiencies, achieving maximum values of the process and of the column efficiencies of 89.2% and 75.9%, respectively. Therefore, EBA is an efficient alternative for the recovery of the target protein and removal of endotoxin from an E. coli unclarified feedstock in just one step.

O crescente interesse e aplicações dos produtos biotecnológicos vêm aumentando o desenvolvimento de novos processos de recuperação e purificação de proteínas. A adsorção em leito expandido (ALE) tem se destacado como uma técnica promissora para essa finalidade, pois combina em uma única operação as etapas de clarificação, concentração e purificação da proteína alvo, reduzindo assim tempo e custos de operação. Neste contexto, o objetivo desta tese foi avaliar a recuperação e purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli M15 e a remoção de endotoxina por ALE. Na primeira etapa do trabalho foram realizados ensaios em taques agitados sob a forma de dois planejamentos experimentais, para definir as condições ótimas de adsorção e eluição do antígeno na resina Streamline chelating. Nos ensaios de adsorção usando o leito na forma expandida empregou-se uma coluna de 2,6 cm de diâmetro por 30,0 cm de altura, acoplada a uma bomba peristáltica. Na segunda etapa do trabalho, avaliou-se a remoção de endotoxina durante o processo de recuperação do antígeno, empregando o tensoativo nãoiônico triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Na terceira etapa, buscou-se elaborar um modelo matemático capaz de prever as curvas de ruptura do antígeno 503 em coluna na forma expandida. Os resultados do planejamento experimental para adsorção do antígeno 503 mostraram o pH 8,0 e a concentração de NaCl de 2,4 M como melhores condições de adsorção. No segundo planejamento, o único fator significativo para eluição foi a concentração de imidazol, definida em 600 mM. A isoterma de adsorção do antígeno 503 mostrou bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores de qmax (capacidade máxima de adsorção) e Kd (constante de equilíbrio) estimados foram de 1,95 mg/g e 0,34 mg/mL, respectivamente. Através dos testes de purificação diretamente do homogeneizado não clarificado obteve-se uma recuperação de 59,2% da proteína de interesse e um fator de purificação de 6,0. A adição do tensoativo não-iônico Triton X-114 à etapa de lavagem da ALE proporcionou altos valores (>99%) de remoção do LPS inicialmente presente nas amostras para todas as condições estudadas. O modelo matemático obtido para descrever a curva de ruptura do antígeno 503 na resina Streamline Chelanting em leito expandido apresentou bom ajuste aos dados experimentais, tanto para etapa de estimativa de parâmetros quanto para de validação. O modelo validado foi utilizado na otimização das eficiências, obtendo-se os valores máximos de eficiência do processo e eficiência da coluna de 89,2% e 75,9%, respectivamente. Portanto, ALE mostrou ser uma alternativa eficiente na recuperação da proteína-alvo e remoção de endotoxina a partir de um extrato de E. coli não clarificado em apenas uma etapa.