Evaluation of valosin containing protein (P97) as a cancer biomaker in canine lymphomas

Le lymphome est l'une des tumeurs les plus communes tant chez le chien que l’humain. Chaque année, un nombre important de chiens développe ce cancer agressif. La majorité décédant un an suivant le diagnostic. Le lymphome canin est maintenant identifié comme un excellent modèle de recherche pour la tumeur chez l'homme, particulièrement en ce qui concerne la biologie moléculaire de la maladie. En conséquence, la recherche sur le lymphome canin sera bénéfique non seulement pour les chiens mais aussi pour l’oncologie humaine. Parmi les méthodes diagnostiques de choix pour dépister de façon hâtive le lymphome se trouve la mesure de marqueurs tumoraux. Ceci a l’avantage d’être peu invasive, simple et peu dispendieuse. Ainsi, dans le but d’évaluer la protéine VCP (valosin containing protein) comme biomarqueur tumoral dans les lymphomes canins à cellules B et T, nous avons évalué la protéine VCP par immunobuvardage sur sérums et tissus tumoraux de chiens atteints et par immunohistochimie sur des tumeurs de haut grade, grade intermédiaire et bas grade. Pour mieux définir l’expression de VCP dans les cellules cancéreuses, nous avons également examiné par immunobuvardage les niveaux de VCP dans 3 lignées cellulaires: CLBL-1, CL-1, et 17-71. Il s’avère que les lymphomes à cellules B de haut grade avaient une élévation significative du taux de VCP comparé aux tumeurs de bas grade (P < 0,05). De même, une accumulation importante de VCP a également été détectée dans les lignées tumorales comparées aux cellules mononucléaires du sang périphérique (P < 0,05). D’autre part, le taux sérique de VCP est resté similaire à ceux des chiens normaux. Ces résultats suggèrent une corrélation entre le taux de VCP et le degré de malignité des lymphomes à cellules B. En conclusion, la protéine VCP doit faire l’objet d’une évaluation approfondie pour déterminer son utilité comme marqueur pronostique.

Anàlisi de la reincidència en agressors de parella

L'estudi busca establir les xifres de reincidència dels agressors de parella condemnats a presó, en el seu historial i després de la seva posada en llibertat. Es pretén augmentar el coneixement sobre la violència contra la parella (VCP), sobre les tipologies d'agressors de parella i sobre l'efecte d'intervencions i variables personals. Es descriu el perfil delictiu de 100 subjectes avaluats des del 2008 i el seguiment, durant una mitjana de 15 mesos, de 40 casos posats en llibertat. Es valora la capacitat del B-SAFER (una escala breu derivada de la SARA) per classificar segons tipologies i per predir la reincidència. Els resultats indiquen que els agressors a presó són poc especialitzats (un 45% limita la seva activitat delictiva a la VCP). Un 47% és reincident penitenciari i el 41% presenta detenció prèvia per VCP. El B-SAFER mostra una capacitat elevada per classificar tipològicament els agressors (eficàcia diagnòstica del 79% amb una puntuació 13). Després de la seva excarceració, el 17,5% ha reincidit (un 15% en VCP) i el 66% ho ha fet en un termini inferior a l'any. L'eficàcia diagnòstica del B-SAFER és del 70% (sensibilitat del 100%). El 21% dels antisocials/patològics davant el 12,5% dels normalitzats ha reincidit, amb una sobrerepresentació del subtipus antisocial/patològic entre els reincidents (71%). Les variables amb major valor predictiu són la justificació de la violència, l'edat en el primer ingrés a presó i el tractament. Un 57% dels reincidents no havia rebut tractament, i es dóna un 9% de reincidència entre els tractats davant el 50% en els no tractats. Recidivism in intimate partner violence (IPV) The research analyzes the criminal profile (criminal career and changeability) of offenders in custody because of IPV, and their recidivism after release. The influence of treatment and profiles are analyzed, as well as the ability to predict the risk of recidivism by the B-SAFER. Análisis de la reincidencia en agresores de pareja Se analiza el perfil delictivo (carrera y versatilidad) de los agresores de pareja que se encuentran en prisión y la reincidencia que presentan después de la excarcelación. Se valora la influencia del tratamiento y de las tipologías, así como la posibilidad de predecir el riesgo de reincidencia mediante el B-SAFER.

Análisis de la reincidencia en agresores de pareja

Se analiza el perfil delictivo (carrera y versatilidad) de los agresores de pareja que se encuentran en prisión y la reincidencia que presentan después de la excarcelación. Se valora la influencia del tratamiento y de las tipologías, así como la posibilidad de predecir el riesgo de reincidencia mediante el B-SAFER. L'estudi busca establir les xifres de reincidència dels agressors de parella condemnats a presó, en el seu historial i després de la seva posada en llibertat. Es pretén augmentar el coneixement sobre la violència contra la parella (VCP), sobre les tipologies d'agressors de parella i sobre l'efecte d'intervencions i variables personals. Es descriu el perfil delictiu de 100 subjectes avaluats des del 2008 i el seguiment, durant una mitjana de 15 mesos, de 40 casos posats en llibertat. Es valora la capacitat del B-SAFER (una escala breu derivada de la SARA) per classificar segons tipologies i per predir la reincidència. Els resultats indiquen que els agressors a presó són poc especialitzats (un 45% limita la seva activitat delictiva a la VCP). Un 47% és reincident penitenciari i el 41% presenta detenció prèvia per VCP. El B-SAFER mostra una capacitat elevada per classificar tipològicament els agressors (eficàcia diagnòstica del 79% amb una puntuació 13). Després de la seva excarceració, el 17,5% ha reincidit (un 15% en VCP) i el 66% ho ha fet en un termini inferior a l'any. L'eficàcia diagnòstica del B-SAFER és del 70% (sensibilitat del 100%). El 21% dels antisocials/patològics davant el 12,5% dels normalitzats ha reincidit, amb una sobrerepresentació del subtipus antisocial/patològic entre els reincidents (71%). Les variables amb major valor predictiu són la justificació de la violència, l'edat en el primer ingrés a presó i el tractament. Un 57% dels reincidents no havia rebut tractament, i es dóna un 9% de reincidència entre els tractats davant el 50% en els no tractats. The research analyzes the criminal profile (criminal career and changeability) of offenders in custody because of IPV, and their recidivism after release. The influence of treatment and profiles are analyzed, as well as the ability to predict the risk of recidivism by the B-SAFER.

Importance du stress oxydant dans le diabète secondaire à la fibrose kystique

Introduction : La fibrose kystique (FK) est une maladie génétique mortelle qui touche principalement les poumons et l’appareil digestif. Elle est causée par des mutations sur le gène codant la protéine du CFTR, un canal chlore exprimé à la surface des organes à sécrétions exocrines. Les fonctions principales du CFTR sont les suivantes: 1) la régulation de l’homéostasie ionique des sécrétions; 2) le maintien de la fluidité des sécrétions et; 3) le transport du glutathion. Le dysfonctionnement de la protéine du CFTR rend les sécrétions visqueuses et épaisses, avec des phénomènes obstructifs qui sont responsables de l’apparition de fibrose au sein des divers organes. Dans le poumon, l’accumulation du mucus épais rend difficile l’élimination des bactéries inhalées, ces dernières établissent alors des cycles d’infection qui endommagent les tissus pulmonaires à travers des processus inflammatoires. Dans le tube digestif, le mucus épais entrave l’absorption d’une quantité suffisante d’éléments nutritifs incluant les principaux antioxydants. L’infection et l’inflammation des poumons favorisent l’apparition d’un stress oxydant qui détruit davantage le tissu pulmonaire. Le déficit en glutathion, probablement lié au dysfonctionnement de la proteine du CFTR, et la malabsorption des antioxydants favorisent l’augmentation du stress oxydant. Une augmentation du stress oxydant a été démontrée au cours du diabète et les produits dérivés du stress oxydant ont été mis en évidence dans la pathogenèse des complications associées au diabète. Une augmentation du stress oxydant a également été montrée durant la FK, mais sans pour autant expliquer la survenue du diabète secondaire à la FK dont la prévalence augmente sans cesse. Objectifs : Notre étude consiste à évaluer l’impact du stress oxydant dans les anomalies du métabolisme du glucose durant la FK, et à étudier son rôle dans les mécanismes de sécrétion d’insuline induite par le glucose. Pour ce faire, nous avons déterminé l’impact de la peroxydation lipidique sur la tolérance au glucose et la défense antioxydante globale, in vivo, chez des patients FK présentant une altération du métabolisme du glucose. De plus, nous avons évalué le rôle du stress oxydatif sur la synthèse et la sécrétion d’insuline, in vitro, dans les cellules pancréatiques βTC-tet. Résultats : Dans l’étude in vivo, nous avons démontré que l’intolérance au glucose et le diabète étaient associés à une augmentation de la peroxydation lipidique, traduite par la hausse des niveaux sanguins de 4-hydroxynonenal lié aux protéines (HNE-P). La défense antioxydante évaluée par la mesure du glutathion sanguin démontre que les niveaux de glutathion oxydé restent également élevés avec l’intolérance au glucose. Dans l’étude in vitro, nos résultats ont mis en évidence que l’exposition de la cellule βTC-tet au stress oxydant: 1) induit un processus de peroxydation lipidique; 2) augmente la sécrétion basale d’insuline; 3) diminue la réponse de la sécrétion d’insuline induite par le glucose; et 4) n’affecte que légèrement la synthèse de novo de l’insuline. Nous avons aussi démontré que les cellules pancréatiques βTC-tet résistaient au stress oxydant en augmentant leur synthèse en glutathion tandis que la présence d’un antioxydant exogène pouvait restaurer la fonction sécrétoire de ces cellules. Conclusion : Le stress oxydant affecte le fonctionnement de la cellule pancréatique β de plusieurs manières : 1) il inhibe le métabolisme du glucose dont les dérivés sont nécessaires à la sécrétion d’insuline; 2) il active la voie de signalisation impliquant les gènes pro-inflammatoires et; 3) il affecte l’intégrité membranaire en induisant le processus de peroxydation lipidique.

Characterization of Tollip in the Interleulkin-1 Receptor/Toll Like Receptors signaling pathways

SUMMARY IL-1R and TLRs are key players in innate immunity and inflammation. Tollip was identified as a component of IL-1RI, TLR2 and TLR4 signaling complexes that activate NF-κB and MAP kinase pathways. Tollip was previously shown as a negative regulator of NF-κB and MAP Kinase activation. We have characterized the role of Tollip in IL-R/TLRs induced signaling by the analysis of the Tollip deficient mice. We showed that NF-κB and MAPK (p38, JNK, or ERK1/2) signaling appeared normal in Tollip deficient cells following stimulation with IL-1β, lipopolysaccharide (LPS), and other TLR ligands. Also IL-1β and TLRs ligands induced activation of immune cells was indistinguishable from wild-type cells. Strikingly, in Tollip deficient mice the production of the inflammatory cytokines, IL-6 or TNF-α was significantly reduced relative to control mice after treatment with physiological doses of IL-1β or LPS, whereas no difference was observed at high doses of stimulation with LPS or in LPS induced septic shock. Therefore, Tollip could be critical for regulation of optimal responses to IL-1β and LPS, in addition to its role as negative regulator of the signaling. We also studied the role of Tollip as an endocytic adaptor for IL-1R endocytosis. We could show that Il-1R is ubiquitinated after IL-1β stimulation, and that Tollip's CUE domain binds IL-1RI in an ubiquitin-dependent manner. We followed IL-1R internalization and Tollip localization by confocal microscopy. Consistent with a role for Tollip in sorting of ubiquitinated IL-1RI, a significant amount of Tollip was also localized at the late endosomal compartment. We could show that Tollip is required for efficient lysosomal targeting of ubiquitinated IL-1R1, In the absence of Tollip or in Tollip deficient cells reconstituted with a Tollip mutant (defective in ubiquitin binding) IL-1RI accumulates in enlarged late endosomes. In addition, Tollip was shown to interact with, another endocytic adapter, Toml, and both interact with IL-1RI. In conclusion, we showed that Tollip is required for IL-1β and LPS signaling for cytokine production. In addition we showed and that Tollip has a role as an endocytic adapter, necessary for efficient trafficking and lysosomal degradation of IL-1RI. Resumé Le récepteur à l'interleukine-1 (IL-1R) et les récepteurs "Toll-like" (TLRs) sont des acteurs cruciaux de la réponse immunitaire innée et de l'inflammation. La proteine Tollip a été identifiée comme étant un élément des complexes de signalisation, induits par les récepteurs IL-1RI, TLR-2 et TLR-4, qui mènent à l'activation de la voie des MAP kinases et de NF-κB. Dans de précédentes études, il a été montré que Tollip pouvait inhiber ces deux voies de signalisation. Nous avons voulu caractériser plus précisément le rôle de Tollip dans l'activation des voies de signalisation mitées par IL-1R/TLRs en utilisant une lignée murine déficiente pour la protéine Tollip. Ainsi, en absence de Tollip, les cascades d'activation de NF-κB et MAPK (p38, JNK, or ERK1/2) ne semblent pas affectées après stimulation avec IL-1β, lipopolysaccharide (LPS) ou d' autres ligands des TLR. La réponse des cellules du système immunitaire induite par la stimulation avec IL-1β et les ligands des TLR est également comparable entre les souris sauvages et les souris deficientes pour Tollip. Par contre, dans cette lignée murine, la production de cytokines proinflammatoires IL-6 et TNFα induite par la stimulation à dose physiologique de IL-1β or LPS, est réduite. Cependant, lors de stimulation à plus hautes doses de LPS ou pendant un choc septique induit par de LPS, cette réduction n'est pas observée. Ces résultats montrent que Tollip pourrait avoir un rôle déterminant dans l'activation optimale en réponse à l' IL-1β et au LPS qui s'ajoute à sa fonction inhibitrice des mêmes voies de signalisation. Nous avons aussi étudié le rôle de Tollip comme molécule adaptatatrice du mécanisme endocytique d'internalisation de l' IL-1RI. Ainsi, l' IL-1R est ubiquitiné après stimulation par l' IL-1β , permettant à Tollip de se lier au récepteur. Cette interaction est réalisée entre le domaine CUE de Tollip et l'IL-1R via l'ubiquitine. L'internalisation et la localisation intracellulaire de l'IL-1RI et de Tollip ont été observés par microscopie confocale. En accord avec le rôle de Tollip dans le triage et la recirculation des IL-1R ubiquitiné, une quantité importante de Tollip été détectée dans l' endosome tardif. Nous avons pu démontrer que Tollip était nécessaire pour diriger efficacement ubiquitiné vers les lysosomes. Dans des cellules déficientes pour Tollip, ou reconstituées avec un mutant de Tollip (MF/AA) incapable de lier l'ubiquitine, IL-1RI s'accumule dans des vesicules anormales de l'endosome tardif. Dans ce travail, nous avons pu confirmer et préciser la fonction de la protéine Tollip dans l' activation de la production de cytokines induites par l' IL-1p and le LPS lors de l'inflammation et découvrir son rôle d'adaptateur dans l' internalisation et l'endocytose de l' IL-1RI.

La spettroscopia di forza basata sull'AFM nello studio dello spazio conformazionale e dei processi aggregativi di proteine prioniche

Le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da aggregazione proteica, dipendente dalla perdita della usuale struttura fisiologica funzionale delle proteine coinvolte, a favore di conformazioni tossiche (patologiche). Il modello corrente descrive questi cambiamenti conformazionali come eventi rari e ritiene che non esista una sola conformazione patogena, ma che tali possibili conformazioni siano piuttosto eterogenee. La caratterizzazione di queste strutture è, di conseguenza, difficile con le tradizionali tecniche in bulk che permettono di studiare solo la conformazione media e non rendono possibile il riconoscimento delle caratteristiche dei conformeri individuali. Lo sviluppo delle tecniche di singola molecola ha permesso di studiare in modo approfondito le conformazioni possibili. In questo lavoro la spettroscopia di forza di singola molecola basata sull'AFM viene applicata a PrP (proteina responsabile delle encefalopatie spongiformi trasmissibili). Si studiano gli equilibri conformazionali del monomero e quelli di costrutti oligomerici, allo scopo di caratterizzare gli step iniziali dei processi aggregativi. Nel corso di questo lavoro di tesi è stato, in particolare, sviluppato un sistema di analisi dati, al fine di studiare in modo quantitativo le distribuzioni di eventi ottenute. Grazie a tale strumento è stato possibile riconoscere i segnali di unfolding della conformazione nativa del monomero e notare come essa sia presente anche in costrutti oligomerici, ad indicare come questo ripiegamento sia stabile anche in presenza di più monomeri ravvicinati. Si è osservato l'effetto del pH sulla stabilità di tale struttura, notando come pH acidi destabilizzino il ripiegamento nativo. Inoltre si è studiato il ruolo dell'orientazione dei monomeri nella formazione di strutture dimeriche. Monomeri e oligomeri di PrP sono stati descritti come proteine parzialmente strutturate il cui panorama energetico contiene molti minimi locali, dando origine a parecchie conformazioni transienti.

Association entre la dépression et les comportements reliés aux habitudes de vie et aux soins du diabète dans la population diabétique du Québec

Les personnes atteintes de diabète sont plus à risque de développer la dépression, un fardeau additionnel dans leurs activités quotidiennes. Notre étude auprès d’adultes diabétiques résidant au Québec vise à en déterminer les caractéristiques lorsque la dépression fait partie du tableau clinique. Hypothèse 1: Les adultes québécois atteints de diabète et de dépression (dépression majeure et mineure) seront plus prédisposés à avoir des indicateurs reliés aux habitudes de vie, aux soins du diabète et à l’efficacité personnelle vis-à-vis du contrôle du poids et de la quantité d’aliments consommés, moins favorables que les sujets diabétiques sans dépression. Hypothèse 2: Chez les Québécois atteints de diabète de type 2, l’association entre la dépression et l’obésité sera affectée par les indicateurs de la Variation Cyclique du Poids (VCP) et de l’efficacité personnelle. Hypothèse 3: Chez les Québécois atteints de diabète de type 2, ceux qui auront développé ou maintenu une dépression au cours de 12 mois, seront plus susceptibles de détériorer les indicateurs reliés à leurs habitudes de vie et à leur efficacité personnelle. Des personnes diabétiques au Québec ont été recrutées à l’aide d’un sondage téléphonique. Des adultes, hommes et femmes, âgés de 18 à 80 ans étaient éligibles à participer. La dépression était déterminée par le questionnaire PHQ-9 « Patient Health Questionnaire-9 ». Au total, 3 221 individus ont été contactés au départ de l’étude; 2 003 ont participé à l’étude (93% type 2)et 1 234 ont participé au suivi de 12 mois. La prévalence de dépression mineure et majeure était de 10,9% et 8,7%, respectivement. Cinquante-trois pourcent des sujets avec dépression majeure avaient deux ou trois indicateurs malsains (tabagisme, inactivité ou obésité), 33% des sujets avaient une dépression mineure et 21% des sujets étaient non déprimés. Les résultats des analyses de régression logistique ont révélé que les sujets dépressifs étaient plus susceptibles d’être de sexe féminin, moins instruits, non mariés,sédentaires, fumeurs, percevaient plus souvent avoir une faible maîtrise du contrôle de la quantité d’aliments ingérés et tendaient davantage à mesurer leur glycémie au moins une fois par jour (p<0,05). Chez les patients avec le diabète de type 2, l’association entre la dépression et l’obésité a été affectée par les variables de la VCP et d’efficacité personnelle. Une année après le début de l’étude, 11,5% des sujets ont développé une dépression et 10% ont maintenu leur état dépressif. Les sujets ayant développé une dépression ou persisté dans leur état de dépression étaient plus susceptibles d’avoir été inactifs au début de l’étude ou d’être restés inactifs au suivi de 12 mois, et d’avoir maintenu une perception d’un faible contrôle de leur poids corporel et de la quantité d’aliments ingérés. Cependant, les changements de statut de dépression n’étaient pas associés à des changements de l’indice de masse corporelle. En conclusion, l’inactivité physique et une faible efficacité personnelle sont des facteurs importants dans le développement et la persistance de la dépression chez les patients diabétiques et méritent d’être considérés dans le traitement.

Caratterizzazione mediante HPLC-MS di modifiche post-trasduzionali di proteine istoniche

Gli istoni sono proteine basiche che possono essere classificate in varie classi: H1, H2A, H2B, H3 e H4. Queste proteine formano l’ottamero proteico attorno al quale si avvolge il DNA per formare il nucleosoma che è l’unità fondamentale della cromatina. A livello delle code N-terminali, gli istoni possono essere soggetti a numerose modifiche posttraduzionali quali acetilazioni, metilazioni, fosforilazioni, ADP-ribosilazioni e ubiquitinazioni. Queste modifiche portano alla formazione di diversi siti di riconoscimento per diversi complessi enzimatici coinvolti in importanti processi come la riparazione e la replicazione del DNA e l’assemblaggio della cromatina. La più importante e la più studiata di queste modifiche è l’acetilazione che avviene a livello dei residui amminici della catena laterale dell’amminoacido lisina. I livelli corretti di acetilazione delle proteine istoniche sono mantenuti dall’attività combinata di due enzimi: istone acetil transferasi (HAT) e istone deacetilasi (HDAC). Gli enzimi appartenenti a questa famiglia possono essere suddivisi in varie classi a seconda delle loro diverse caratteristiche, quali la localizzazione cellulare, la dimensione, l’omologia strutturale e il meccanismo d’azione. Recentemente è stato osservato che livelli aberranti di HDAC sono coinvolti nella carcinogenesi; per questo motivo numerosi gruppi di ricerca sono interessati alla progettazione e alla sintesi di composti che siano in grado di inibire questa classe enzimatica. L’inibizione delle HDAC può infatti provocare arresto della crescita cellulare, apoptosi o morte cellulare. Per questo motivo la ricerca farmaceutica in campo antitumorale è mirata alla sintesi di inibitori selettivi verso le diverse classi di HDAC per sviluppare farmaci meno tossici e per cercare di comprendere con maggiore chiarezza il ruolo biologico di questi enzimi. Il potenziale antitumorale degli inibitori delle HDAC deriva infatti dalla loro capacità di interferire con diversi processi cellulari, generalmente non più controllati nelle cellule neoplastiche. Nella maggior parte dei casi l’attività antitumorale risiede nella capacità di attivare programmi di differenziamento, di inibire la progressione del ciclo cellulare e di indurre apoptosi. Inoltre sembra essere molto importante anche la capacità di attivare la risposta immunitaria e l’inibizione dell’angiogenesi. Gli inibitori delle HDAC possono essere a loro volta classificati in base alla struttura chimica, alla loro origine (naturale o sintetica), e alla loro capacità di inibire selettivamente le HDAC appartenenti a classi diverse. Non è ancora chiaro se la selettività di queste molecole verso una specifica classe di HDAC sia importante per ottenere un effetto antitumorale, ma sicuramente inibitori selettivi possono essere molto utili per investigare e chiarire il ruolo delle HDAC nei processi cellulari che portano all’insorgenza del tumore. Nel primo capitolo di questa tesi quindi è riportata un’introduzione sull’importanza delle proteine istoniche non solo da un punto di vista strutturale ma anche funzionale per il destino cellulare. Nel secondo capitolo è riportato lo stato dell’arte dell’analisi delle proteine istoniche che comprende sia i metodi tradizionali come il microsequenziamento e l’utilizzo di anticorpi, sia metodi più innovativi (RP-LC, HILIC, HPCE) ideati per poter essere accoppiati ad analisi mediante spettrometria di massa. Questa tecnica consente infatti di ottenere importanti e precise informazioni che possono aiutare sia a identificare gli istoni come proteine che a individuare i siti coinvolti nelle modifiche post-traduzionali. Nel capitolo 3 è riportata la prima parte del lavoro sperimentale di questa tesi volto alla caratterizzazione delle proteine istoniche mediante tecniche cromatografiche accoppiate alla spettrometria di massa. Nella prima fase del lavoro è stato messo a punto un nuovo metodo cromatografico HPLC che ha consentito di ottenere una buona separazione, alla linea di base, delle otto classi istoniche (H1-1, H1-2, H2A-1, H2A-2, H2B, H3-1, H3-2 e H4). La separazione HPLC delle proteine istoniche ha permesso di poter eseguire analisi accurate di spettrometria di massa mediante accoppiamento con un analizzatore a trappola ionica tramite la sorgente electrospray (ESI). E’ stato così possibile identificare e quantificare tutte le isoforme istoniche, che differiscono per il tipo e il numero di modifiche post-traduzionali alle quali sono soggette, previa estrazione da colture cellulari di HT29 (cancro del colon). Un’analisi così dettagliata delle isoforme non può essere ottenuta con i metodi immunologici e permette di eseguire un’indagine molto accurata delle modifiche delle proteine istoniche correlandole ai diversi stadi della progressione del ciclo e alla morte cellulare. Il metodo messo a punto è stato convalidato mediante analisi comparative che prevedono la stessa separazione cromatografica ma accoppiata a uno spettrometro di massa avente sorgente ESI e analizzatore Q-TOF, dotato di maggiore sensibilità e risoluzione. Successivamente, per identificare quali sono gli specifici amminoacidi coinvolti nelle diverse modifiche post-traduzionali, l’istone H4 è stato sottoposto a digestione enzimatica e successiva analisi mediante tecniche MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS. Queste analisi hanno permesso di identificare le specifiche lisine acetilate della coda N-terminale e la sequenza temporale di acetilazione delle lisine stesse. Nel quarto capitolo sono invece riportati gli studi di inibizione, mirati a caratterizzare le modifiche a carico delle proteine istoniche indotte da inibitori delle HDAC, dotati di diverso profilo di potenza e selettività. Dapprima Il metodo messo a punto per l’analisi delle proteine istoniche è stato applicato all’analisi di istoni estratti da cellule HT29 trattate con due noti inibitori delle HDAC, valproato e butirrato, somministrati alle cellule a dosi diverse, che corrispondono alle dosi con cui sono stati testati in vivo, per convalidare il metodo per studi di inibizione di composti incogniti. Successivamente, lo studio è proseguito con lo scopo di evidenziare effetti legati alla diversa potenza e selettività degli inibitori. Le cellule sono state trattate con due inibitori più potenti, SAHA e MS275, alla stessa concentrazione. In entrambi i casi il metodo messo a punto ha permesso di evidenziare l’aumento dei livelli di acetilazione indotto dal trattamento con gli inibitori; ha inoltre messo in luce differenti livelli di acetilazione. Ad esempio il SAHA, potente inibitore di tutte le classi di HDAC, ha prodotto un’estesa iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MS275 selettivo per la classe I di HDAC, ha prodotto modifiche molto più blande. E’ stato quindi deciso di applicare questo metodo per studiare la dose e la tempo-dipendenza dell’effetto di quattro diversi inibitori delle HDAC (SAHA, MS275, MC1855 e MC1568) sulle modifiche post-traduzionali di istoni estratti da cellule HT29. Questi inibitori differiscono oltre che per la struttura chimica anche per il profilo di selettività nei confronti delle HDAC appartenenti alle diverse classi. Sono stati condotti quindi studi di dose-dipendenza che hanno consentito di ottenere i valori di IC50 (concentrazione capace di ridurre della metà la quantità relativa dell’istone meno acetilato) caratteristici per ogni inibitore nei confronti di tutte le classi istoniche. E’ stata inoltre calcolata la percentuale massima di inibizione per ogni inibitore. Infine sono stati eseguiti studi di tempo-dipendenza. I risultati ottenuti da questi studi hanno permesso di correlare i livelli di acetilazione delle varie classi istoniche con la selettività d’azione e la struttura chimica degli inibitori somministrati alle cellule. In particolare, SAHA e MC1855, inibitori delle HDAC di classi I e II a struttura idrossamica, hanno causato l’iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MC1568 (inibitore selettivo per HDAC di classe II) ha prodotto l’iperacetilazione solo di H4. Inoltre la potenza e la selettività degli inibitori nel provocare un aumento dei livelli di acetilazione a livello delle distinte classi istoniche è stata correlata al destino biologico della cellula, tramite studi di vitalità cellulare. E’ stato osservato che il SAHA e MC1855, inibitori potenti e non selettivi, somministrati alla coltura HT29 a dose 50 μM producono morte cellulare, mentre MS275 alla stessa dose produce accumulo citostatico in G1/G0. MC1568, invece, non produce effetti significatici sul ciclo cellulare. Questo studio ha perciò dimostrato che l’analisi tramite HPLC-ESI-MS delle proteine istoniche permette di caratterizzare finemente la potenza e la selettività di nuovi composti inibitori delle HDAC, prevedendone l’effetto sul ciclo cellulare. In maggiore dettaglio è risultato che l’iperacetilazione di H4 non è in grado di provocare modifiche significative sul ciclo cellulare. Questo metodo, insieme alle analisi MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS che permettono di individuare l’ordine di acetilazione delle lisine della coda N-terminale, potrà fornire importanti informazioni sugli inibitori delle HDAC e potrà essere applicato per delineare la potenza, la selettività e il meccanismo di azione di nuovi potenziali inibitori di questa classe enzimatica in colture cellulari tumorali.

Studio della diversa espressione di proteine del siero nelle anguille (Anguilla anguilla) gialle ed argentine mediante analisi proteomica

L’anguilla europea (Anguilla anguilla) è una specie eurialina catadroma, la cui area di riproduzione si trova a grande distanza dall’areale di distribuzione. Presenta un ciclo biologico piuttosto complesso caratterizzato da due metamorfosi: la prima, tipicamente larvale permette al “leptocefalo”, forma larvale marina tipica degli anguilliformi, di trasformarsi in anguilla “ceca”; la seconda, invece, trasforma l’anguilla “gialla” in “argentina” attraverso un processo definito di “argentinizzazione” nel quale si delineano preadattamenti alla maturazione sessuale che sarà completa durante la migrazione riproduttiva verso il Mar dei Sargassi. L’”argentinizzazione” innesca modificazioni fisiologiche (regressione del tratto digestivo), e morfologiche (aumento della massa corporea, ispessimento della pelle, modificazione dell’occhio e nuova pigmentazione). Il colore bruno verdastro con ventre giallo è prerogativa delle anguille in fase trofica, cioè quelle gialle, sessualmente immature. Quelle argentine presentano, invece, una colorazione più scura sul dorso e argenteo sul ventre. Inoltre le anguille argentine vanno incontro a cambiamenti ormonali per adattarsi all’ambiente marino, compiere la lunga migrazione e riprodursi. Per avere a disposizione risorse energetiche anche senza nutrirsi per molti mesi, devono accumulare grandi riserve di cui il 60% è destinato per lo sviluppo delle gonadi. Tuttavia i processi metabolici che consentono alle anguille argentine di effettuare lunghe migrazioni mantenendo un’alta efficienza del nuoto e nel contempo utilizzando limitate risorse, non sono sufficientemente conosciuti. Per fornire nuove informazioni, questo lavoro di tesi ha indagato se vi sia una modificazione del quadro proteico del siero delle anguille argentine rispetto alle gialle, e quali proteine eventualmente risultino sovra- o sotto- espresse in ciascuna delle due fasi del ciclo biologico. A tale fine si è applicata una tecnica innovativa, quale l’analisi proteomica, che permette di identificare in modo sistematico le proteine all’interno di un substrato biologico come iin questo caso il siero. Le anguille gialle ed argentine prese in esame sono state prelevate nelle Valli di Comacchio (FE). La valutazione quantitativa delle proteine, separate tramite elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilamide, si è fondata sull’analisi delle immagini attraverso specifici programmi (Proteomweaver). A tale proposito, si sono confrontati i gel di anguilla gialla ed argentina individuando gli spot corrispondenti alle proteine e quantificandoli. Gli spot differenzialmente espressi sono stati prelevati per essere poi identificati tramite spettrometria di massa (MS/MS), arrivando al riconoscimento di diverse proteine. Tra queste, sono state identificate due diverse isoforme di apolipoproteina, l’una più espressa nell’anguilla gialla, l’altra nell’argentina; tali proteine svolgono un ruolo importante nella facilitazione del trasporto lipidico e nell’assorbimento dei lipidi associato anche con la crescita degli ovociti. Il treno di spot relativo alla transferrina è decisamente più evidente nelle anguille argentine, il che potrebbe essere correlato al ruolo del ferro nell’emoglobina, mirato ad un maggiore apporto di ossigeno ai tessuti durante la lunga migrazione riproduttiva di questi animali. Lo studio è del tutto nuovo e al momento non sono disponibili sufficienti informazioni al contorno per trarre più ampie conclusioni; tuttavia esso merita di essere proseguito per contribuire alla comprensione degli eventi di metamorfosi in questa specie dal ciclo vitale complesso e in gran parte sconosciuto.

Dispositivi per la diagnostica basati su biomembrana lipidica artificiale

Il presente elaborato ha lo scopo di descrivere le principali caratteristiche e applicazioni delle biomembrane lipidiche artificiali utilizzate nel campo biochimico e biomedico. Nel Capitolo 1. viene presentata una panoramica generale della membrana cellulare, descrivendo la sua struttura a “mosaico fluido” e i principali componenti che la costituiscono, cioè i lipidi e le proteine transmembrana. Viene quindi descritto uno dei ruoli fondamentali della membrana cellulare, ovvero il trasporto di soluti all’interno e all’esterno della cellula. Vengono schematizzate le tipologie di trasporto, attivo e passivo, e la funzione dei canali ionici, un particolare tipo di proteina transmembrana che permette il passaggio selettivo di ioni dall'esterno all'interno della cellula o viceversa. Il Capitolo 2. si focalizza sui principali modelli di biomembrane lipidiche artificiali. Infatti, a seconda del tipo di metodo e di materiale utilizzato, è possibile ottenere dei prototipi che differiscono per caratteristiche e funzionalità. Verranno illustrate le membrane lipidiche nere (BLM), i doppi strati lipidici (bilayer) con supporto solido (SLB), i bilayer lipidici ibridi e i doppi strati con ammortizzatore polimerico. Per ognuna di queste biomembrane artificiali verranno analizzati i metodi di formazione e gli utilizzi in campo biomedico. Verranno poi descritti i metodi di incorporazione delle proteine nel doppio strato lipidico e le tecniche per stabilizzare il bilayer e realizzare una piattaforma sensoriale. Nel Capitolo 3 verranno presentate le principali applicazioni che utilizzano membrane artificiali, sia per lo studio dei principali processi cellulari di membrana e screening dei farmaci sia per la realizzazione di piattaforme sensorizzate. Infine nel Capitolo 4. si considereranno le innovazioni attese nel campo delle biomembrane artificiali anticipando le loro potenziali applicazioni future. Infatti, le prospettive in questo campo sono molto promettenti soprattutto per quel che riguarda lo screening di nuovi farmaci.

Evoluzione della qualita delle carni avicole durante la conservazione refrigerata

Il presente lavoro di tesi ha avuto lo scopo di valutare l’influenza della marinatura su alcuni aspetti microbiologici e chimico-fisici correlati alla qualità della carne di petto di pollo confezionata sottovuoto durante un periodo di stoccaggio di 14 giorni in condizioni refrigerate. Dalle analisi microbiologiche, è emerso che, nonostante l’aumento di pH dovuto all’azione alcalinizzante del bicarbonato, la shelf-life del prodotto marinato è rimasta invariata rispetto al gruppo di controllo non-marinato ed è stata pari a circa 14 giorni. Dal punto di vista tecnologico, gli ingredienti funzionali aggiunti nella soluzione di marinatura hanno consentito di ottenere livelli di perdite di cottura nel prodotto finito simili a quelli delle carni non-marinate durante tutto il periodo di conservazione. Ciò è riconducibile al notevole aumento della solubilità delle proteine miofibrillari determinato dall’effetto sinergico di cloruro di sodio e bicarbonato. Tuttavia, i prodotti marinati hanno mostrato maggiori perdite di liquido nelle confezioni e questo aspetto può condizionare negativamente la propensione all’acquisto da parte del consumatore. Gli effetti rilevati sul colore non costituiscono invece un elemento determinante nella scelta dei prodotti avicoli confezionati sottovuoto. Infine, è stato escluso qualsiasi effetto negativo della marinatura nei confronti della stabilità ossidativa dei lipidi. I risultati ottenuti in questo lavoro di tesi hanno pertanto dimostrato che è possibile realizzare un prodotto marinato a base di carne di petto di pollo stabile durante la conservazione offrendo così al consumatore un alimento con caratteristiche sensoriali di succulenza e tenerezza superiori e con una maggiore facilità d’uso. Restano da ottimizzare alcuni aspetti legati alla presentazione del prodotto soprattutto in relazione alla presenza di liquido nelle confezioni.

Validación de una técnica para la evaluación estructurada del riesgo de violencia contra la pareja: Un avance en Córdoba sobre la práctica profesional basada en la evidencia.

EL PROBLEMA A raíz del reconocimiento de la violencia contra la mujer como un problema de salud pública, en las últimas dos décadas ha ocurrido una notable transformación de la respuesta a esta problemática en todos los sectores de la sociedad, incluyendo el sistema de justicia penal, los servicios sociales, el sistema sanitario y la opinión pública. La aproximación sanitaria y epidemiológica a la violencia contra la mujer, y específicamente la que ocurre en el seno de las relaciones de pareja (violencia contra la pareja o VCP), resalta el papel de la prevención y la importancia de valorar el riesgo de violencia para orientar las estrategias de intervención que los profesionales y técnicos administrarán a fin de evitar daños y peligros, a veces letales, sobre la víctima. Aunque la VCP es un tema prioritario en las políticas públicas de Córdoba, aun permanece el interrogante de cómo funcionan en la población local las técnicas estructuradas de evaluación del riesgo que han demostrado eficacia en la predicción del fenómeno a partir de la identificación y la intervención sobre los factores de riesgo que incrementan la probabilidad de su aparición. El RVD-Bcn es una de estas técnicas y fue desarrollada a fin de incrementar la precisión de los pronósticos y de orientar las decisiones profesionales relativas a la intervención con la víctima. HIPÓTESIS El RVD-Bcn administrado en mujeres de Córdoba será una herramienta útil para evaluar de forma objetiva, replicable y válida el riesgo de violencia que una mujer pueda tener, en un momento dado, por parte de su pareja actual o anterior y favorecerá la toma de decisiones de los profesionales para la gestión de cada caso en función de los niveles de riesgo y las necesidades identificadas. OBJETIVOS General: Poner a disposición de la comunidad profesional que trabaja en contextos sociosanitarios de Córdoba un instrumento validado empíricamente en población local para asistir a los profesionales en su toma de decisiones relativas al riesgo de VCP y a la gestión de los casos. Específicos: Identificar niveles de riesgo de violencia en las mujeres participantes, evaluar la fiabilidad y validez predictiva del RVD_Bcn sobre la VCP, establecer puntos de corte que equilibren los niveles de sensibilidad y especificidad diagnósticos y establecer recomendaciones para su uso en la gestión de los casos de VCP. METODOLOGÍA Estudio longitudinal y multicéntrico. Mediante una entrevista estructurada se administrará un cuestionario de datos sociodemográficos y de la situación de pareja y familiar y el RVD-Bcn a una muestra de 500 mujeres mayores de 18 años consultantes en servicios sociosanitarios de Córdoba. Se realizarán dos entrevistas de seguimiento al cabo de los 3 y 6 meses para recoger información sobre los sucesos violentos que la mujer haya podido sufrir durante ese período. Se realizarán análisis psicométricos de fiabilidad y validez predictiva de la herramienta mediante técnicas de regresión logística y el trazado de curvas ROC. RESULTADOS ESPERADOS Las herramientas de evaluación del riesgo de VCP han demostrado eficacia predictiva similar (en promedio d= .40) en diferentes poblaciones y contextos (Hanson, Helmus & Bourgon, 2007). Es esperable que el RVD-Bcn demuestre una capacidad predictiva similar a la obtenida en la muestra original. IMPORTANCIA DEL PROYECTO El uso de protocolos estructurados para la valoración profesional del riesgo de violencia incrementa la capacidad predictiva en los pronósticos profesionales, reduce la tasa de falsos positivos y falsos negativos, mejora la eficacia de las medidas preventivas al adecuarlas a los niveles de riesgo estimados y a las necesidades detectadas en cada caso individualizado, y mejora la comunicación entre profesionales. Este estudio representa un primer esfuerzo en Córdoba de aproximación empírica a la evaluación estructurada del riesgo en casos de VCP y sus resultados serán útiles para indicar los lineamientos de investigación futura.

Modello stocastico per la plasticità sinaptica

Nel sistema nervoso centrale i neuroni comunicano l'uno con l'altro attraverso le connessioni sinaptiche e sono soggetti a centinaia di stimoli, ma hanno la capacità di distinguerli l'uno dall'altro. L'abilità delle sinapsi di interpretare questi cambiamenti morfologici e biochimici è detta \textit{plasticità sinaptica} e l'obiettivo di questa tesi è proprio studiare un modello per le dinamiche di questo affascinante processo, da un punto di vista prima deterministico e poi stocastico. Infatti le reazioni che inducono la plasticità sinaptica sono ben approssimate da equazioni differenziali non lineari, ma nel caso di poche molecole bisogna tener conto delle fluttuazioni e quindi sono necessari dei metodi di analisi stocastici. Nel primo capitolo, dopo aver introdotto gli aspetti fondamentali del sistema biochimico coinvolto e dopo aver accennato ai diversi studi che hanno approcciato l'argomento, viene illustrato il modello basato sull'aggregazione delle proteine (PADP) volto a spiegare la plasticità sinaptica. Con il secondo capitolo si introducono i concetti matematici che stanno alla base dei processi stocastici, strumenti utili per studiare e descrivere la dinamica dei sistemi biochimici. Il terzo capitolo introduce una giustificazione matematica riguardo la modellizzazione in campo medio e vede una prima trattazione del modello, con relativa applicazione, sui moscerini. Successivamente si applica il modello di cui sopra ai mammiferi e se ne studia nel dettaglio la dinamica del sistema e la dipendenza dai parametri di soglia che portano alle varie transizioni di fase che coinvolgono le proteine. Infine si è voluto osservare questo sistema da un punto di vista stocastico inserendo il rumore di Wiener per poi confrontare i risultati con quelli ottenuti dall'approccio deterministico.

Valutazione delle proteine in tartare di pesce trattate ad alte pressioni

Il presente elaborato ha avuto lo scopo di valutare l’effetto dell’applicazione delle alte pressioni idrostatiche (HHP) sulla solubilità delle proteine sarcoplasmatiche e totali di tartare di cefalo e mazzancolla, valutandone il cambiamento durante la conservazione refrigerata protratta per 35 giorni o fino al raggiungimento di 7 Log UFC/g di batteri mesofili totali. In seguito allo scongelamento, cefali e mazzancolle sono stati ridotti in frammenti e confezionati sottovuoto. Successivamente, i prodotti confezionati ottenuti da ciascuna delle due materie prime considerate, sono stati suddivisi in quattro gruppi sperimentali: uno non trattato mentre gli altri sottoposti ad HHP alla pressione di 400, 500 e 600 MPa. Trascorsi 1, 6, 9, 14, 21, 28 e 35 giorni dall’applicazione del trattamento è stata determinata la solubilità delle proteine sarcoplasmatiche e totali. L’applicazione delle HHP su tartare di cefalo e mazzancolla consente di allungarne notevolmente la shelf-life microbica, soprattutto con trattamenti a pressioni elevate (600 MPa). Tuttavia, è stato osservato un notevole effetto negativo sulla solubilità delle frazioni sarcoplasmatiche e totali, molto presumibilmente associato ai fenomeni di ossidazione. Dal confronto fra le due matrici considerate (cefalo e mazzancolla), emerge che la solubilità delle proteine sarcoplasmatiche e miofibrillari dei macinati di mazzancolla è meno influenzata dal trattamento con HHP e quindi si adatta meglio all’impiego di questa tecnologia; al contrario i macinati di cefalo hanno presentato una riduzione notevole della funzionalità proteica. In generale, è stato confermato che i prodotti ittici dotati di un tenore di lipidi ed emepigmenti molto ridotto, come i crostacei (es. mazzancolla), sono più adatti ad essere sottoposti a trattamento con le HHP che ne rallenta i fenomeni degradativi durante la successiva fase di conservazione refrigerata.