Zur Struktur und Funktion der Typ-3-Kupferproteine sowie der Lichtsammlerkomplexe LHCI und LHCII

In der vorliegenden Arbeit wurden die bioinformatischen Methoden der Homologie-Modellierung und Molekularen Modellierung dazu benutzt, die dreidimensionalen Strukturen verschiedenster Proteine vorherzusagen und zu analysieren. Experimentelle Befunde aus Laborversuchen wurden dazu benutzt, die Genauigkeit der Homologie-Modelle zu erhöhen. Die Ergebnisse aus den Modellierungen wurden wiederum dazu benutzt, um neue experimentelle Versuche vorzuschlagen. Anhand der erstellten Modelle und bekannten Kristallstrukturen aus der Protein-Datenbank PDB wurde die Struktur-Funktionsbeziehung verschiedener Tyrosinasen untersucht. Dazu gehörten sowohl die Tyrosinase des Bakteriums Streptomyces als auch die Tyrosinase der Hausmaus. Aus den vergleichenden Strukturanalysen der Tyrosinasen resultierten Mechanismen für die Monophenolhydroxylase-Aktivität der Tyrosinasen sowie für den Import der Kupferionen ins aktive Zentrum. Es konnte der Beweis geführt werden, daß die Blockade des CuA-Zentrums tatsächlich der Grund für die unterschiedliche Aktivität von Tyrosinasen und Catecholoxidasen ist. Zum ersten Mal konnte mit der Maus-Tyrosinase ein vollständiges Strukturmodell einer Säugetier-Tyrosinase erstellt werden, das dazu in der Lage ist, die Mechanismen bekannter Albino-Mutationen auf molekularer Ebene zu erklären. Die auf der Basis des ermittelten 3D-Modells gewonnenen Erkenntnisse über die Wichtigkeit bestimmter Aminosäuren für die Funktion wurde durch gerichtete Mutagenese an der rekombinant hergestellten Maus-Tyrosinase getestet und bestätigt. Weiterhin wurde die Struktur der Tyrosinase des Krebses Palinurus elephas durch eine niedrigaufgelöste 3D-Rekonstruktion aus elektronenmikroskopischen Bildern aufgeklärt. Der zweite große Themenkomplex umfasst die Strukturanalyse der Lichtsammlerkomplexe LHCI-730 und LHCII. Im Falle des LHCII konnte der Oligomerisierungszustand der LHCMoleküle mit diskreten Konformationen des N-Terminus korreliert werden. Auch hier kam eine Kombination von Homologie-Modellierung und einer experimentellen Methode, der Elektronen-Spin-Resonanz-Messung, zum Einsatz. Die Änderung des Oligomerisierungszustands des LHCII kontrolliert den Energiezufluß zu den Photosystemen PS I und PS II. Des Weiteren wurde ein vollständiges Modell des LHCI-730 erstellt, um die Auswirkungen gerichteter Mutagenese auf das Dimerisierungsverhalten zu untersuchen. Auf Basis dieses Modells wurden die Wechselwirkungen zwischen den Monomeren Lhca1 und Lhca4 evaluiert und potentielle Bindungspartner identifiziert.

In vitro reconstitution of the photosystem I light-harvesting complex LHCI-730: Heterodimerization is required for antenna pigment organization

Here we describe the in vitro reconstitution of photosystem I light-harvesting complexes with pigments and proteins (Lhca1 and Lhca4) obtained by overexpression of tomato Lhca genes in Escherichia coli. Using Lhca1 and Lhca4 individually for reconstitution results in monomeric pigment-proteins, whereas a combination thereof yields a dimeric complex. Interactions of the apoproteins is highly specific, as reconstitution of either of the two constituent proteins in combination with a light-harvesting protein of photosystem II does not result in dimerization. The reconstituted Lhca1/4, but not complexes obtained with either Lhca1 or Lhca4 alone, closely resembles the native LHCI-730 dimer from tomato leaves with regard to spectroscopic properties, pigment composition, and stoichiometry. Monomeric complexes of Lhca1 or Lhca4 possess lower pigment/protein ratios, indicating that interactions of the two subunits not only facilitates pigment reorganization but also recruitment of additional pigments. In addition to higher averages of chlorophyll a/b ratios in monomeric complexes than in LHCI-730, comparative fluorescence and CD spectra demonstrate that heterodimerization involves preferential ligation of more chlorophyll b.

高等植物PSI颗粒的分离提纯及其光破坏机理的初步探讨

从菠菜叶绿体中分离提纯PSI颗粒及其捕光天线色素蛋白复合物LHCI，对其光谱特性进行分析。对PSI颗粒中色素和蛋白的光破坏进程，并对外加组氨酸、Triton，以及温度对PSI颗粒光破坏的影响等进行了比较系统的研究，以探讨PSI光破坏的机理。其主要结果如下： 1. 对PSI颗粒和LHCI色素蛋白复合物的荧光光谱的研究，发现PSI中Chlb所吸收的光能主要传递给LHCI中的“长波组分”（吸收波长大于P700的Chla）。 2. 在PSI颗粒光破坏进程的研究中发现，Chla中吸收波长较长的组分首先发生光破坏;位于PSI颗粒外围的LHCI上的Chlb，也容易受到光破坏;Car先于Chlb发生光破坏。在光照处理过程中，PSI的天线色素蛋白复合物LHCI多肽降解程度大于反应中心多肽组分（PsaA，PsaB）的降解，其中LHCI-680首先由于光破坏而发生降解。PsaD也是容易受到光破坏而发生降解的一个多肽。另外，还发现在长时间光照后有蛋白聚合现象发生。 3. 在PSI颗粒中外加单线态氧的淬灭剂组氨酸，分析不同光强光照处理过程中组氨酸对PSI颗粒中色素和多肽光破坏的保护作用，发现外加组氨酸对强光照（2300μEm-2s-1）引起的叶绿素光吸收减少和CD信号减弱的有效抑制表现出一个明显的延迟期，但对强光诱导的荧光产量下降的效应却能立即表现出来;在强光照前期和弱光照（300μEm-2s-1）条件下，组氨酸不能抑制PSI颗粒的光吸收下降。另外，外加组氨酸除了对反应中心多肽有光保护作用以外，对PSI中其它多肽也有显著的保护作用。 4. 用不同浓度的Triton处理PSI颗粒，发现较低浓度的Triton可以增大叶绿素的光吸收和PSI颗粒的荧光产量，而不对PSI颗粒的多肽组成造成影响;当Triton浓度达到一定的程度时，虽然不会影响PSI颗粒的多肽组成，但是会使其光吸收减少，荧光产量下降;而当Triton浓度过高时，PSI颗粒的多肽会发生降解现象，同时其光吸收和荧光产量也迅速下降。Triton浓度较低时，PSI颗粒光破坏的程度随Triton浓度的增大而增大，当Triton浓度增大到一定的程度时，PSI颗粒的光破坏程度同Triton浓度不再呈明显的正相关。 5. 对PSI颗粒进行不同温度的热处理，其结果表明：温度较低（20 ℃～40 ℃）的热处理对PSI颗粒的多肽和叶绿素光吸收的影响程度很小，照光后不同温度热处理过的PSI颗粒光吸收减少和多肽降解的程度相近;温度较高（50 ℃～60 ℃）的热处理会对PSI颗粒的结构产生影响，使之稳定性减小，对光处理更敏感;温度更高（大于70 ℃）的热处理会破坏PSI颗粒的结构，引起多肽组分的降解。另外，不同的多肽对热处理的敏感性显著不同。 6. 低温（4 ℃）和常温（20 ℃）下PSI颗粒光破坏的比较发现，室温下PSI颗粒的光破坏程度明显大于低温下光破坏的程度，表明光处理过程中温度会影响到PSI颗粒光破坏的程度。 通过上述的研究结果，分析了PSI颗粒光破坏过程中色素和蛋白的变化及其外界因子的影响，对PSI颗粒光破坏的机制进行了初步的探讨。

小麦光系统I的分离纯化及其光合特性的研究

从不同基因型的小麦京411和小偃54中分离纯化了PSI颗粒并研究了PSI颗粒的一些光合特性： 1. 测定了两种基因型小麦PSI颗粒的室温吸收光谱、低温荧光光谱，并进行了SDS-PAGE多肽分析。吸收光谱显示了红区680nm和蓝区439nm的两个最大吸收峰，低温荧光光谱显示了PSI特征的位于735nm左右的发射峰，同时SDS-PAGE也显示我们的制备物包括PsaA、PsaB、LHCI以及一些其它小分子量蛋白亚基。这些都表明我们从不同基因型小麦中获得了比较理想的PSI颗粒制备物。 2. 测定了京411类囊体膜和PSI颗粒的脂类组成和脂肪酸成分，发现PSI颗粒中也存在着类囊体膜中的五种膜脂，即：MGDG、DGDG、PG、SQDG、PC，但PSI颗粒的MGDG含量比类囊体膜高，而DGDG含量较类囊体低。PSI颗粒和类囊体膜的脂肪酸组成也有差异。 3. 运用光谱学手段，研究两种基因型小麦PSI颗粒光破坏过程的异同。发现在经过强光破坏后，两种小麦PSI颗粒都发生叶绿素漂白现象，在各种状态叶绿素中，683nm状态的Chl a对强光最为敏感，受到光破坏的程度最大，而649nm Chl b和667nm Chl a分子变化较小。结合吸收光谱和低温荧光光谱我们提出了PSI中可能存在的能量传递途径。比较两种小麦PSI颗粒光破坏在低温荧光光谱上的不同，我们初步认为，小偃54可能通过将能量较多地分配给予长波长Chl而一定程度的避免过多能量向P700反应中心传递，从而起到对P700的保护作用。 4. 研究了不同表面活性剂SDS和Triton X-100对PSI颗粒色素结合状态和能量传递的影响。发现表面活性剂对色素状态和PSI中的能量传递都有很大的影响。并且Triton X-100的作用较SDS强烈。紫外荧光显示PSI蛋白结构也发生了显著变化。

高温和光照对光系统I结构与功能的影响

光合膜上包含有捕光并将光能转化为化学能所必需的四类跨膜蛋白复合体，即PSII、PSI、Cytb6f和ATP合成酶，其中PSI利用吸收的光能诱导电子从膜内侧的PC传递至相对一侧的铁氧还蛋白，被还原的铁氧还蛋白在FNR（Fd-NADP+氧化还原酶）的作用下生成NADPH，因此关于PSI的研究是光合作用研究领域中的重大问题。为了进一步阐明PSI的结构和功能，本论文分别研究了热对PSI的影响和光诱导的PSI核心复合物（CPI）的积累过程： 1.以菠菜PSI颗粒为材料研究了热处理对PSI复合物的降解和失活作用; 2.以衣藻叶绿素暗合成突变体y-1为材料研究了类囊体膜形成过程（即光诱导的转绿过程）中PSI中CPI的变化。另外，由于膜脂在光合作用中具有重要的功能，本论文还研究了y-1突变体转绿过程中光合膜脂、脂肪酸的变化。 一．应用光谱学、氧电极和变性电泳等技术研究了高温(25oC~80oC)对PSI结构和功能的影响，主要结果如下： 1． 在热处理过程中，683nm组分（主要归属于LHCI）的吸收峰强度有显著的下降并发生峰位蓝移现象，显示该组分对热处理最敏感，首先遭到破坏。 2． 77K荧光显示随着处理温度的升高，728 nm处的峰强和峰位均发生了明显的变化，F728-F720和F680的比率下降，说明热处理抑制了LHCI 680向LHCI 730以及反应中心的能量传递。 3． SDS-PAGE显示PSI核心蛋白PsaA/B亚基以及LHCI亚基在热处理情况下发生了不同程度的降解和聚合。为了能够显著地观察到热处理对PSI多肽降解的影响，实验采用了更高的温度处理方法，结果显示，90oC、100oC时PsaA/B亚基完全降解，而LHCI亚基仍有少量存在，说明PSI核心蛋白PsaA/B比LHCI亚基具有更高的热敏感性。 4． 推测热处理情况下可能发生的机制是，捕光天线首先从PSI反应中心分离，随后发生了反应中心光化学反应的抑制，直至最后多肽的严重降解。 5． 利用红外光谱技术（FT-IR）对PSI蛋白二级结构的研究显示，PSI颗粒在60oC以上时发生了明显的蛋白构象变化,且随着温度的升高蛋白构象的变化越来越大，表明PSI蛋白具有较高的热稳定性和热变性温度，PSI蛋白酰胺I带(1700~1600 cm-1)二级结构的解析表明热处理过程中二级结构的主要变化是α-helical的下降和β-sheet的增加。 6． 利用CD光谱技术研究了热处理对PSI色素微环境的影响，结果表明热处理破坏了PSI色素蛋白复合物中色素的蛋白微环境，归属于LHCI的Chlb（645 nm处组分）在较低的温度处理条件下(25~60oC)蛋白微环境即发生破坏;随着处理温度的升高（70和80 oC），478 nm处（主要归属于LHCI的Chlb）和498 nm（归属于类胡萝卜素）处的CD信号强度快速下降，说明在高温条件下LHCI比核心复合物更敏感。 7． 研究发现，PSI的摄氧活性随着处理温度的升高而显著下降，70oC时几乎完全失去摄氧能力，表明70oC时PSI复合物受到了严重的破坏，这可能是由于热处理过程中色素的蛋白微环境以及蛋白结构尤其是PSI核心蛋白PsaA/B中跨膜α-helix的构象发生了严重的变化。 二．主要运用温和电泳和蛋白印迹技术检测了暗培养4天(脱绿)的y-1突变体在光照诱发的转绿过程中PSI的核心色素蛋白复合物（CPI）及其叶绿素脱辅基蛋白PsaA/B的变化。 1． 暗培养4天的衣藻脱绿细胞中，PSI的主要色素蛋白复合物-CPI完全缺失，然而核心多肽PsaA/B仍有一定量的积累，同时检测不到P700的含量。 2． 当脱绿的y-1细胞转移至光照下时，伴随着叶绿素的合成，色素蛋白复合物CPI和PsaA/B脱辅基蛋白的合成也逐渐达到正常水平，说明叶绿素和PsaA/B蛋白进行组装并形成了具有功能的PSI反应中心,P700含量也得到了恢复。 3． 实验证明了光照是形成光合系统色素蛋白复合物的重要前提。同时发现，叶绿体基因编码的PSI核心多肽PsaA/B能够在暗条件下合成。而根据资料(Berends et al.,1987)报道，在豌豆、大麦的黄化体中不能合成PsaA/B蛋白，这可能是由于在脱绿的y-1细胞中叶绿体仍然具有相对完整的大小和形状，而在叶绿体的被膜上定位着多种与光合作用相关的酶系统。 三. 利用薄层层析及气相色谱分析技术对转绿期间y-1突变体光合膜脂和脂肪酸组成的含量变化进行了分析。结果表明： 1． 光照能够促进各种脂的积累并影响脂的组成，同时有利于脂肪酸脱饱和酶的激活。MGDG中脂肪酸不饱和程度明显升高，表现为16:0及18:1的下降，以及16:4，18：2和18:3（9，12，15）等的升高，说明光照促进了MGDG sn-2位的16:0脱饱和为16:4以及sn-1位的18：1脱饱和为18:3，也说明MGDG是脂肪酸脱饱和的重要底物。 2． 已有的资料（Ohnishi和Yamada，1980;1983）指出PG及其sn-2位的16:1（3t）的合成是光依赖的，而本实验中，在衣藻的黄化细胞中含有相当量的PG及其特有的16:1（3t）（22.80%），且转绿过程中变化并不十分显著。这可能是由于黄化的y-1细胞中叶绿体的形状并没有发生很大变化，说明叶绿体被膜上的相应酶系统才是PG合成的必需因素。 3． 相比于脱绿的y-1细胞，光照12小时后，各种脂中18：2的百分含量有显著的增加，这来源于18：2是脂肪酸脱饱和的重要中间产物。

高温和衰老对光合膜结构与功能影响的研究

本部分研究以菠菜和水稻为材料，比较系统的研究了高温对类囊体膜、PSII颗粒、PSII外周捕光天线LHCII、PSII核心复合物和PSII反应中心等不同层次膜蛋白结构与功能的影响，以探讨高温对光合膜蛋白的伤害机理。其主要结果如下： 1．类囊体膜结构与功能的完整性对于维持PSII的结构与功能在高温胁迫下的稳定性具有重要作用。当类囊体膜的完整性受到破坏，当与PSI有关的一系列保护机制失去作用时，PSII对高温胁迫的敏感性会大大加强。 2．虽然PSI的功能在高温下保持相对稳定，但PSI的结构在高温胁迫下并不稳定。本文的研究发现LHCI对高温非常敏感，在中度高温胁迫下就开始降解，但PSI的核心在高温下比较稳定，所以PSI介导的电子传递活性仍然维持在较高水平。 3．高温胁迫会对PSII的结构和功能产生多重破坏。这个过程首先应该是放氧复合体的失活：其次是反应中心的可逆失活;接下来可能是核心天线CP43和CP47的失活导致捕光天线同反应中心的能量传递受阻;再下来是QA到QR电子传递的受阻、反应中心的不可逆失活、捕光效率下降等过程;最后是大范围色素蛋白的变性和失活，PSII的结构和功能遭到彻底破坏。 4．高湿胁迫下Fo显著升高，Fo的升高的原因可能源于少量捕光天线同反应中心的分离和反应中心的失活。 5．高等植物体的类囊体膜中存在多种Chla和Chlb的光谱吸收形式。这些代表不同的光谱吸收形式的组分在高温胁迫下表现出不同程度的降解，其中C678 和C684组分降解最快。这些不同的光谱吸收形式组分可能以不同的比例存在于每一种色素蛋白复合物中。 6．LHCII的结构与功能对于维持PSII结构与功能的热稳定性具有重要作用，LHCII完全缺失的水稻突变体VG28及分离纯化的PSII核心复介物都人大增强了对高温的敏感性。但一种LHCII减少的水稻突变体249-Mutant,反而增加了PSII的热稳定性，进一步的研究表明，类囊体膜中 LHCII本身含量的多少对PSII热稳定性的影响不足决定性的，关键性因素可能主要取决于 LHCII含量改变而引起的膜脂组成和膜脂不饱和程度的改变，以及由膜脂变化引起的PSII放氧复合体结构与功能的变化。 7．本研究首次发现，高温可以促使分离纯化的LHCII的红区吸收光谱发生显著红移，而680nm处的荧光发射降低，长波长荧光组分大大增强。绿胶电泳表明中度高温胁迫能够诱导LHCII产生寡聚体，这种寡聚体可能在调节能量耗散方面具有重要生理意义：而严重高温胁迫下LHCII倾向于聚合产生大分子的非活性聚集体。 8．分离纯化的反应中心对高温非常敏感，各种色素的结构和功能在轻度高温胁迫下就开始受到破坏和抑制，各种色素变性和降解的顺序由快到慢是：P680>Pheo>Chla>β-Car。反应中心的多肽组分在高温胁迫下显著减少，Dl和D2减少的原因可能归因于高温胁迫导致大分子聚合物的产生，D2的减少显著快于D1的减少。

表面活性剂存在下的光系统I的光合特性

本文主要研究了在非离子表面活性剂－辛基硫代葡萄糖苷（OTG）处理条件下菠菜叶绿体中光系统I（PSI）颗粒的光合特性，主要的研究结果如下： 1. 在所研究的OTG浓度范围内（0.01～13%，w/v），OTG对PSI的电子传递活性有显著的促进作用。而与此相对照，阴离子表面活性剂－十二烷基硫酸钠（SDS）对PSI的活性具有抑制作用。 2. OTG对PSI在SDS和高温（70℃）处理后失去的电子传递活性具有恢复作用。 3. OTG对PSI的色素结合状态和能量传递都有很大的影响，影响程度和影响方式与OTG的浓度有关。在其临界胶束浓度（cmc）以上的一定浓度范围内，OTG处理会导致PSI捕光天线色素蛋白复合体（LHCI）的解离;而更大浓度的OTG会使PSI中产生自由色素。

光系统I及其亚组分的分离纯化与光破坏特性的研究

光系统I（photosystem I，PSI）是光合膜上参与光合作用原初反应过程的主要膜蛋白超分子复合体之一。高等植物的PSI是由核心复合体（14个亚基）和捕光色素蛋白复合体I（light-harvesting complex I, LHCI，含4个Lhca蛋白）组成的超分子复合体，它的主要功能是调节光诱导的从囊腔侧的质体兰素（plastocyanin，PC）向基质侧的铁氧还蛋白（ferredoxin，Fd）的电子传递。研究PSI的结构与功能对于揭示植物光合作用高效吸能、传能的分子机理具有重要意义。在本文中，我们首先建立了分离制备PSI及其亚组分的方法（Qin et al., 2007），并在此基础上对PSI在强光破坏的过程中结构与功能的变化进行了比较深入的研究。本论文的主要研究结果如下： 1．快速、高效分离纯化PSI及其亚组分方法的建立。 国际上传统的PSI分离方法（Bassi and Simpson, 1987; Croce et al., 1998; Påsllon et al.1995; Schmid et al. 2002），耗时长较长（分离PSI颗粒一般需要多于20h的蔗糖超速离心过程，而分离PSI的亚组分则需要25-60h的蔗糖超速离心过程）、得率较低，这不便于PSI方面的研究，为此我们首先改进了传统的分离纯化方法。新方法以高等植物菠菜叶片作为原材料，使用Triton X-100作为增溶剂，通过差速离心技术获得的粗制品，然后使用十二烷基麦芽糖苷(n-Dodecyl β-D-maltoside, DDM)增溶PSI粗制品，之后采用100,000×g，垂直转头（Beckman VTi 50）0.1-1 mol/L蔗糖梯度离心3h获得纯度较高的PSI颗粒。然后使用DDM和3-(N, N-Dimethylpalmitylammonio) propanesulfonate （zw 3-16）两种增溶剂处理PSI，后经100,000×g，垂直转头（Beckman VTi 50）蔗糖梯度离心4h获得纯度较高的PSI core、LHCI-680、LHCI-730复合体。采用吸收光谱、荧光光谱技术研究了各样品的基本光谱学特性，采用HPLC分析了各样品的色素组成，结果显示平均每个Lhca蛋白结合1.5-1.6黄体素，1.0紫黄质, 0.8-1.1 β-胡萝卜素，该方法制备的LHCI比传统方法制备的LHCI减少了类胡萝卜素的丢失。这一工作为以后结构与功能的研究工作奠定了良好的基础。 2．PSI复合体及其亚组分的特性研究。 PSI颗粒具有一定的适应环境酸碱变化的能力，在我们的试验条件下PSI颗粒在pH 5-10相对稳定。PSI、LHCI很难通过加入Mg2+、Ca2+、Na+阳离子聚集沉淀。经绿胶鉴定我们制备的LHCI-680、LHCI-730是二聚体形式;而把PSI绿胶后再进行第二向十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳，结果发现在稍强烈的绿胶增溶条件下，LHCI-730是以二聚体的形式存在，但是LHCI-680却是以单体的形式出现。这说明LHCI形成的二聚体，尤其是LHCI-680，较容易受到增溶处理而分离成单体形式，解释了以生化分离手段得到的LHCI-680的聚集形式是单体还是二聚体这个目前国际上还有有争议的问题。 3．PSI、LHCI光破坏的基本特点。 采用白光（2500 μmol•m-2•s-1）照射PSI颗粒，通过SDS-PAGE及室温吸收光谱检测光照过程中PSI复合体的变化，结果表明：去氧处理能够大大延缓PSI的光破坏，而PSI脱辅基蛋白不会发生光破坏，这说明PSI发生的光破坏可能与Chl与O2的相互作用有关。采用白光（1000 μmol•m-2•s-1、300 μmol•m-2•s-1）处理LHCI-680、LHCI-730，发现LHCI-680被破坏的速度明显快于LHCI-730被破坏的速度，这是首次在体外分离的水平上揭示了不同LHCI光破坏方面的差异。LHCI-680与LHCI-730在光破坏方面的差异可能与两种天线蛋白结合的类胡萝卜素的种类和数量不同有关，还可能与二者结合的长波长Chl的情况有关，但是具体的原因还有待于进一步的研究。 4．结合不同的捕光色素蛋白复合体（light-harvesting complex，LHC）对PSI光破坏的影响。 为了研究结合不同的捕光天线对PSI光破坏的影响，我们制备了PSI-LHCII、PSI、PSI core三种复合体。使用白光（2500 μmol•m-2•s-1）照射这三种复合体，并通过测定各复合体在光破坏过程中蛋白亚基、吸收光谱、PSI活性及P700含量的变化，对比三者光破坏的速度，结果发现PSI-LHCII在这三种复合体中光破坏速度最快，而PSI和PSI core两种复合体光破坏速度基本一致。我们推测在光照过程中部分光系统II捕光Chl a/b蛋白复合体II（light-harvesting complex II，LHCII）能够向PSI core传递能量，另外PSI-LHCII绿胶分析的结果表明发生了LHCII三聚体向单体的转变，这种强光下发生的LHCII聚合形式的转化可能是高光强下调节光能捕获的一种机制，由于植物体内具有较完整的保护系统，体内PSI-LHCII的光破坏可能与体外情况不同;另外LHCI与PSI core的解离可能发生在强光照射的早期，具有保护PSI core减少光破坏的积极作用。该部分的研究首次观察了结合不同的捕光天线对PSI光破坏的影响。

磷脂酰甘油对光系统I的调控作用

磷脂酰甘油(PG)是光系统I(PSI)中唯一的磷脂，也是PSI重要的组成部分。在本工作中，我们通过改变PSI中PG的含量(体外重组至PG脂质体或专一性磷脂酶降解)，研究了PG对PSI的调控作用。主要结果如下： 1. 外加PG导致PSI色素的结合状态和激子相互作用发生改变。吸收光谱中，Chl a特征峰蓝移且吸收降低。低温荧光光谱中，680nm处的峰逐渐明显，F730-735 /F680的比值下降，LHCI-730激发峰蓝移。可视CD光谱中Chl a、Chl b蓝移，它们的相互作用增强;类胡萝卜素分子发生红移。 2. PSI的重组引起了PSI蛋白质结构的改变，即蛋白的α-螺旋结构增加而无序结构含量减少。同时，PSI蛋白质内部的色氨酸残基处于更极性的环境。 3. PG对PSI的电子传递的影响具有浓度效应。低浓度时可以促进PSI的电子传递活性，而在相对较高浓度时抑制PSI的电子传递。 4. PLA2的处理导致PSI中PG的缺失，抑制了PSI反应中心P700的暗还原反应，即延长了其还原所用的时间。P700的暗还原反应存在快相和慢相两相反应。PG的缺失降低了这两相反应的反应速率，抑制了电子从质体蓝素(PC)到P700+的传递。

褐藻两个光系统的色素-蛋白质复合物的分离及特性研究

以褐藻裙带菜(Undaria pinnatifida)、萱藻(Scytosiphon lomentarius)、海蒿子(Sargassum confusum)、叉开网地藻(Dictyopteris divaricata)、海带(Laminaria japonica)、囊藻(Colpomenia sinuosa)、鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、水云(Ectocarpus confervoides)为材料，对其色素-蛋白质复合物的分离技术及其特性进行了系统研究。通过对裙带菜色素-蛋白质复合物分离技术及其影响因素的研究，确立了褐藻的PAGE分离方法。采用Tris-Gly电泳分离系统，以非离子去污剂DMG或DIG为增溶剂(DMG: Chl=20: 1, DIG: Chl=50: 1, 4 ℃增溶1 h)，10%的分离胶浓度，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为30: 0.8,从裙带菜中成功地分离出8条含色素的蛋白质复合物带。采用Anderson命名系统，以高等植物菠菜为参照，将其命名为CPIa, CPI, CPa, LHC_1, LHC_2, LHC_3, LHC_4和LHC_5。游离色素较少。通过对三种褐藻的色素-蛋白质复合物的表观分子量测定、光谱学研究以及对裙带菜色素-蛋白质复合物的多肽组成分析，揭示了褐藻各种色素-蛋白质复合物的特征。CPIa是褐藻分子量较大的PSI复合物，为墨角藻黄素-叶绿素 a/c-蛋白质复合物。CPI是褐藻的PSI核心复合物，为P700-叶绿素 a-蛋白质复合物。CPa是褐藻的PSII复合物，为墨角藻黄素-叶绿素 a/c-蛋白质复合物。其余5条为捕光色素-蛋白质复合物，LHC_1和LHC_3是墨角藻黄素-叶绿素 a/c-蛋白质复合物，LHC_2, LHC_4和LHC_5是叶绿素 a/c-蛋白质复合物。根据裙带菜色素-蛋白质复合物的多肽分析结果并与高等植物比较，提出褐藻PSI和PSII的结构模型。褐藻PSI和PSII的反应中心多肽与高等植物相同，捕光复合物明显区别。褐藻LHCI和LHCII的多肽组成相同，都是由单一的20 kDa多肽组成。褐藻叶状体、叶绿体、类囊体膜和PSI复合物的77 K 荧光发射光谱具有特异性，缺少高等植物PSI特征的730 nm 荧光峰。叶状体的77 K 荧光发射光谱按荧光主峰的波长分为两种类型，一种类型的荧光主峰在690 nm，另一种类型的在705-720 nm。三种褐藻PSI复合物的77 K 荧光发射光谱相同，有两个分别们于680 nm和715 nm 的发射峰。褐藻的77 K 荧光特异是由PSI的结构决定的。根据褐藻PSI复合物的荧光特性以及去污剂增溶动力学分析结果，推动F715来自褐藻核心色素-蛋白质复合物，F680来源于PSI复合物中的捕光复合物。褐藻PSI复合物中缺少高等植物发射730 nm 荧光的LHCIb复合物的能量传递模型。

管藻目绿藻 PSI 和 PSII 结构特异性研究

测定了管藻目绿藻刺松藻和假根羽藻的叶状体、叶绿体及类囊体膜的吸收光谱和低温荧光光谱，并同软丝藻等5种非管藻目绿藻和菠菜进行了比较。证实绿藻普遍缺少作为高等植物 PSI 标志的 730nm 的低温长波荧光，其长波发射峰在 710 ～ 715nm 以及 695nm 荧光也不明显。采用和的 PAGE 法从刺松藻、假根羽藻、软丝藻和菠菜中分别得到 11 种、11 种、7 种和 9 种色素蛋白复合物，并测定了各复合物的分子量、Chl a/b、叶绿素的分布、多肽组成和结构关系，以及吸收光谱、低温荧光发射和激发光谱等各种光谱特性。刺松藻和假根羽藻的 CPIa_(1-2) 复合物的荧光发射主峰分别在 698、690 和 685nm，软丝藻 CPIa 在 715nm，菠菜 CPIa_(1-2) 分别在 729 和 722nm。两种管藻目绿藻的 LHCI 与 CII 的结合程度较菠菜和软丝藻更紧密，其 CPI 复合物中仍含有一定量的，710 ～ 715nm 荧光呈隐现状态。用二次 PAGE 法将刺松藻和假根羽藻的 CPIa 和 CIP 再分离，得到 PSI 的捕光复合 LHCI，为管藻黄素-Chl a/b-蛋白复合物， Chl a/b=1.2，含有 27.5、26.2、26 和 24.5kDa 四种多肽，77K 荧光峰在 682 ～ 683nm。LHCI 没有发射高等植物 730nm 荧光的相应组分是管藻目绿藻缺少 730nm 荧光的主要原因。核心复合物 CCI 含有 67 和 56kDa 两种多肽，与软丝藻和菠菜相似，但 3 种藻类核心复合物的 77K 荧光峰在 715nm，而菠菜在 720nm。刺松藻和假根羽藻有 LHCI 存在时，715nm 荧光峰不明显，随着 LHCI 的解离，荧光逐渐显现。刺松藻 PSI 中与 CCI 结合最紧密的是 LHCI 的 27.5 和 24.5kDa 多肽，两个 26 kDa 多肽的结合较为松散。用差速离心法对刺松藻、假根羽藻、软丝藻及菠菜的 PSI 颗粒进行了初步的分离。PSI 粗提物的 77K 长波荧光发射峰分别在 710、712、713 和 730nm，与 PAGE 法得到的结果相符。刺松藻和假根羽藻的 PSII 核心复合物 CPa 与菠菜相同，都含有两个 33kDa 核心多肽及 40 ～ 47 kDa 的内天线蛋白。从两种管藻目绿藻中首次分离到 6 种 LHCII 捕光复合物，其中 LHCP_(1-3)，四种都是管藻黄素- Chl a/b-蛋白复合物， Chl a/b=0.7 ～ 0.9。刺松藻和假根羽藻中含量最高、最稳定的捕光复合物是分子量最大的 LHCP_1 由 34.4、31.5、29.5、28.1 和 26.5kDa 多肽构成，其中 34.4 和 31.5kDa 多肽在菠菜和软丝藻中没有对应组分。LHCP_1 再分离结果表明，分子量较小的捕光复合物都是 LHCP_1 的组成部分，但分子量最小的 Fca_1 和 Fca_2 与其它复合物的关系尚不确定。31.5 和 29.5 kDa 多肽是 LHCP_1 的核心，34.4、28.1 和 26.5kDa 多肽位于外侧；整个 LHCP_1 以 28.1 和 26.5kDa 多肽与 CCII 紧密结合，构成 PSII。根据刺松藻和假根羽藻光系统结构及其特异性的研究结果，提出了一个管藻目绿藻 PSI 和 PSII 色素蛋白复合物结构关系模型，并与高等植物的模型做了比较。讨论了光合作用两个光系统结构和特性的进化过程，指出 730nm 低温荧光峰不能作为管藻目乃至非管藻目绿藻 PSI 的表征。管藻目绿藻同杂色藻类在这方面有相似性。

Bedeutung N- und C-terminaler Aminosäuren für die Monomer- und Dimerbildung von Lichtsammelproteinen des Photosystems I

Der LHCI-730 ist ein heterodimerer, Chlorophyll a/b-bindender Lichtsammelkomplex (LHC) des Photosystem I in höheren Pflanzen. Mit Hilfe rekombinanter, modifizierter Proteine wurde untersucht, welche terminalen Bereiche der Untereinheiten Lhca1 und Lhca4 für die Bildung von monomeren und dimeren Lichtsammelproteinen relevant sind. Durch PCR-Mutagenese modifizierte Apoproteine wurden in vitro mit Gesamtpigmentextrakt rekonstituiert und auf ihre Fähigkeit mono- bzw. dimere LHCs zu bilden untersucht.Für die Monomerbildung sind der extrinsische N-Terminus und die der amphipathischen vierten Helix folgenden Aminosäuren beider Proteine für die Faltung stabiler monomerer Pigmentproteinkomplexe nicht notwendig. Die Aminosäuren, mit deren Deletion die Monomerbildung an N- und C-Terminus verhindert wurde, verfügten über geladene (Glu, Asp), aromatische (Trp) oder neutrale Seitenketten (Leu).Die Untersuchungen zur Dimerbildung des LHCI-730 zeigten, daß am N-Terminus des Lhca1 nur bis zu einer Entfernung von drei Aminosäuren (Trp) eine Assemblierung der Untereinheiten möglich ist. Nur Phe (anstatt Trp) war in Substitutionsexperimenten im Vollängenprotein in der Lage, Dimere zu bilden. Das Ausbleiben der Dimerbildung der bis einschließlich zum Trp-39 und Ile-168 verkürzten Deletionsmutanten des Lhca4 ist vermutlich auf die Instabilität dieser Lhca4-Mutanten zurückzuführen. Die Deletion von Trp-185 am C-Terminus des Lhca1 führt zu einem Ausbleiben der Dimerbildung, die aber offensichtlich durch weitere, zuvor schon deletierte Aminosäuren beeinträchtigt wurde.

Untersuchung der Pigment- und Proteinzusammensetzung der peripheren Lichtsammelantenne des Photosystem I

Die Lichtsammelantenne des PSI (LHCI) ist hinsichtlich ihrer Protein- und Pigmentzusammensetzung weniger gut untersucht als die des PSII. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb zunächst die Isolation von nativen LHCI-Subkomplexen optimiert und deren Pigmentzusammensetzung untersucht. Zusätzlich wurde die Pigmentbindung analysiert sowie das Pigment/Protein-Verhältnis bestimmt. Die Analyse der Proteinzusammensetzung des LHCI erfolgte mittels einer Kombination aus ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese mit Westernblotanalysen mit Lhca-Protein-spezifischen Antikörpern und massenspektrometrischen Untersuchungen. Dabei stellte sich heraus, dass der LHCI mehr Proteine bzw. Proteinisoformen enthält als bisher vermutet. So gelang durch die massenspektrometrischen Untersuchungen die Identifizierung zweier bisher noch nicht nachgewiesener Lhca-Proteine. Bei diesen handelt es sich um eine Isoform des Lhca4 und ein zusätzliches Lhca-Protein, das Tomaten-Homolog des Lhca5 von Arabidopsis thaliana. Außerdem wurden in 1D-Gelen Isoformen von Lhca-Proteinen mit unterschiedlichem elektrophoretischen Verhalten beobachtet. In 2D-Gelen trat zusätzlich eine große Anzahl an Isoformen mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten auf. Es ist zu vermuten, dass zumindest ein Teil dieser Isoformen physiologischen Ursprungs ist, und z.B. durch differentielle Prozessierung oder posttranslationale Modifikationen verursacht wird, wenn auch die Spotvielfalt in 2D-Gelen wohl eher auf die Probenaufbereitung zurückzuführen ist. Mittels in vitro-Rekonstitution mit anschließenden biochemischen Untersuchungen und Fluoreszenzmessungen wurde nachgewiesen, dass Lhca5 ein funktioneller LHC mit spezifischen Pigmentbindungseigenschaften ist. Außerdem zeigten in vitro-Dimerisierungsexperimente eine Interaktion zwischen Lhca1 und Lhca5, wodurch dessen Zugehörigkeit zur Antenne des PSI gestützt wird. In vitro-Dimerisierungsexperimente mit Lhca2 und Lhca3 führten dagegen nicht zur Bildung von Dimeren. Dies zeigt, dass die Interaktion in potentiellen Homo- oder Heterodimeren aus Lhca2 und/oder Lhca3 schwächer ist als die zwischen Lhca1 und Lhca4 oder Lhca5. Die beobachtete Proteinheterogenität deutet daraufhin, dass die Antenne des PSI eine komplexere Zusammensetzung hat als bisher angenommen. Für die Integration „neuer“ LHC in den PSI-LHCI-Holokomplex werden zwei Modelle vorgeschlagen: geht man von einer festen Anzahl von LHCI-Monomeren aus, so kann sie durch den Austausch einzelner LHC-Monomere erreicht werden. Als zweites Szenario ist die Bindung zusätzlicher LHC vorstellbar, die entweder indirekt über bereits vorhandene LHC oder direkt über PSI-Kernuntereinheiten mit dem PSI interagieren. In Hinblick auf die Pigmentbindung der nativen LHCI-Subfraktionen konnte gezeigt werden, dass sie Pigmente in einer spezifischen Stöchiometrie und Anzahl binden, und sich vom LHCIIb vor allem durch eine verstärkte Bindung von Chlorophyll a, eine geringere Anzahl von Carotinoiden und die Bindung von ß-Carotin an Stelle von Neoxanthin unterscheiden. Der Vergleich von nativem LHCI mit rekonstituierten Lhca-Proteinen ergab, dass Lhca-Proteine Pigmente in einer spezifischen Stöchiometrie binden, und dass sie Carotinoidbindungsstellen mit flexiblen Bindungseigenschaften besitzen. Auch über die Umwandlung des an die einzelnen Lhca-Proteine gebundenen Violaxanthins (Vio) im Xanthophyllzyklus war nur wenig bekannt. Deshalb wurden mit Hilfe eines in vitro-Deepoxidationssystems sowohl native als auch rekonstituierte LHCI hinsichtlich ihrer Deepoxidationseigenschaften untersucht und der Deepoxidationsgrad von in vivo deepoxidierten Pigment-Protein-Komplexen bestimmt. Aus den Deepoxidationsexperimenten konnte abgeleitet werden, dass in den verschiedenen Lhca-Proteinen unterschiedliche Carotinoidbindungsstellen besetzt sind. Außerdem bestätigten diese Experimente, dass der Xanthophyllzyklus auch im LHCI auftritt, wobei jedoch ein niedrigerer Deepoxidationsgrad erreicht wird als bei LHCII. Dies konnte durch in vitro-Deepoxidationsversuchen auf eine geringere Deepoxidierbarkeit des von Lhca1 und Lhca2 gebundenen Vio zurückgeführt werden. Damit scheint Vio in diesen Lhca-Proteinen eher eine strukturelle Rolle zu übernehmen. Eine photoprotektive Funktion von Zeaxanthin im PSI wäre folglich auf Lhca3 und Lhca4 beschränkt. Damit enthält jede LHCI-Subfraktion ein LHC-Monomer mit langwelliger Fluoreszenz, das möglicherweise am Lichtschutz beteiligt ist. Insgesamt zeigten die Untersuchungen der Pigmentbindung, der Deepoxidierung und der Fluoreszenzeigenschaften, dass sich die verschiedenen Lhca-Proteine in einem oder mehreren dieser Parameter unterscheiden. Dies lässt vermuten, dass schon durch leichte Veränderungen in der Proteinzusammensetzung des LHCI eine Anpassung an unterschiedliche Licht-verhältnisse erreicht werden kann.

Ursachen der unterschiedlichen Oligomerisierung von Lichtsammelproteinen

Die verschiedenen Lichtsammelproteine (Lhc-Proteine) höherer Pflanzen unterscheiden sich im Oligomerisierungsverhalten. Im Photosystem II existieren 6 Lhc-Proteine, die entweder die monomeren Lichtsammelkomplexe (LHC) CP24 (Lhcb6), CP26 (Lhcb5) und CP29 (Lhcb4) oder den trimeren LHCII (Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3) bilden. Im Photosystem I sind laut Kristallstruktur vier Lhc-Proteine lokalisiert, die als Heterodimere organisiert vorliegen. Der schwerpunktmäßig untersuchte LHCI-730 setzt sich aus Lhca1 und Lhca4 zusammen, während der LHCI-680 aus Lhca2 und Lhca3 besteht. Das Ziel der Arbeit bestand in der Identifizierung der für das unterschiedliche Oligomerisierungsverhalten verantwortlichen Proteinbereiche und Aminosäuren. Die für diese Arbeit generierten Consensussequenzalignments verschiedener Lhca- und Lhcb-Proteine vieler Arten unterstützen die Folgerungen aus Strukturdaten und anderen Sequenzalignments, dass den LHCs eine gemeinsame Monomerstruktur zu Grunde liegt. Die Helices 1 und 3 weisen weitgehend sehr hohe Sequenzidentitäten auf, während die N- und C-Termini, die zwei Schleifenregionen und die Helix 2 nur schwach konserviert sind. Falls die Bereiche mit hoher Sequenzübereinstimmung für das Zustandekommen ähnlicher monomerer LHC-Strukturen verantwortlich sind, könnten in den schwach konservierten Domänen die Ursachen für das unterschiedliche Oligomerisierungsverhalten lokalisiert sein. Aufgrund dessen wurden die schwach konservierten Domänen des monomerisierenden Lhcb4, des mit dem Lhca1 dimerisierenden Lhca4 und des Trimere bildenden Lhcb1 gegen die entsprechenden Domänen der anderen Proteine ausgetauscht und bezüglich ihres Oligomerisierungsverhaltens untersucht. Im Lhca4 konnten mit der Helix 2 und der stromalen Schleife zwei für eine Heterodimerisierung essentielle Domänen gefunden werden. Im Lhcb1 waren neben dem N-Terminus auch die 2. Helix und die stromale Schleifendomäne unentbehrlich für eine Trimerisierung. Zusätzlich waren Dimerisierung und Trimerisierung bei Austausch der luminalen Schleife beeinträchtigt. Ein geringer Beitrag zur Lhcb1-Trimerisierung konnte auch für den C-Terminus belegt werden. Ein zusätzliches Ziel der Arbeit sollte der Transfer der Oligomerisierungseigenschaften durch umfangreichen Domänentausch von einem auf ein anderes Protein sein. Der Transfer der Fähigkeit zur Dimerbildung durch Substitution gegen essentielle Lhca4-Domänen (50% luminale Schleife, 100% Helix 2 und 100% stromale Schleife) gelang beim Lhcb4, nicht aber beim Lhcb1. Der Transfer der Trimerisierungsfähigkeit auf Lhca4 und Lhcb4 scheiterte. Eine Lhca1-Mutante mit allen für eine Dimerisierung essentiellen Lhca4-Domänen, die durch Interaktion einzelner Moleküle untereinander multimere LHCs bilden sollte, war bereits in ihrer Monomerbildung beeinträchtigt. Eine Übertragung der Oligomerisierungsfähigkeit auf andere Proteine durch massiven Domänentransfer gestaltete sich somit schwierig, da vermutlich im mutierten Protein immer noch ursprüngliche Tertiärstrukturanteile enthalten waren, die nicht mit den transferierten Proteinbestandteilen kompatibel sind. Bei zukünftigen Experimenten zur Klärung der Transferierbarkeit der Oligomerisierungseigenschaft sollten deswegen neben dem unberücksichtigten 1. Teil der luminalen Schleife auch wenig konservierte Aminosäuren in der 1. und 3. Helix Beachtung finden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die LHCI-730-Dimerisierung im Detail zu untersuchen. Mutationsanalysen bestätigten den von früheren Untersuchungen bekannten Einfluss des Isoleucins 103 und Histidins 99. Letzteres geht möglicherweise durch sein gebundenes Chlorophyll eine Interaktion mit dem Lhca1 ein. Das Phenylalanin 95 stellte sich ebenfalls als ein wichtiger Interaktionspartner heraus und könnte in Wechselwirkung mit einem zwischen Lhca1 und Lhca4 lokalisierten Phosphatidylglycerin treten. Das ebenfalls an der Dimerbildung beteiligte Serin 88 des Lhca4 könnte auf Grund der räumlichen Nähe bei Modellierungen direkt mit dem am C-Terminus des Lhca1 lokalisierten Glycin 190 interagieren. Darüber hinaus wurde ein in der luminalen Lhca4-Schleife lokalisiertes Phenylalanin 84 als Interaktionspartner des Tryptophans 185 im C-Terminus von Lhca1 identifiziert. Der simultane Austausch des Isoleucins 109 und Lysins 110 in der stromalen Schleife des Lhca4, konnte deren Einfluss auf die Dimerisierung belegen. Nachdem bislang an der Dimerbildung beteiligte Aminosäuren am N- und C-Terminus des Lhca1 und Lhca4 identifiziert werden konnten, wurden in dieser Arbeit viele an einer Dimerbildung beteiligten Proteinbereiche und Aminosäuren in der Helix 2 und den Schleifenregionen des Lhca4 identifiziert. Um alle an der Lhca1-Lhca4-Interaktion beteiligten Aminosäuren aufzuklären, müssten durch Mutationsanalysen die in der stromalen Lhca4-Schleife vermuteten Interaktionspartner des für die Dimerisierung wichtigen Tryptophans 4 am N-Terminus von Lhca1 identifiziert, und die in der Helix 3 des Lhca1 vermuteten Interaktionspartner der Helix 2 des Lhca4 ermittelt werden.

Photophysical investigation of light-harvesting systems for solar-to-fuel conversion

In recent years, an increasing attention has been given to the optimization of the performances of new supramolecular systems, as antennas for light collection. In such background, the aim of this thesis was the study of multichromophoric architectures capable of performing such basic action. A synthetic antenna should consist of a structure with large UV-Vis absorption cross-section, panchromatic absorption, fixed orientation of the components and suitable energy gradients between them, in order to funnel absorbed energy towards a specific site, through fast energy-transfer processes. Among the systems investigated in this thesis, three suitable classes of compounds can be identified: 1) transition metal-based multichromophoric arrays, as models for antenna construction, 2) free-base trans-A2B-phenylcorroles, as self-assembling systems to make effective mimics of the photosynthetic system, and 3) a natural harvester, the Photosystem I, immobilized on the photoanode of a solar-to-fuel conversion device. The discussion starts with the description of the photophysical properties of dinuclear quinonoid organometallic systems, able to fulfil some of the above mentioned absorption requirements, displaying in some cases panchromatic absorption. The investigation is extended to the efficient energy transfer processes occurring in supramolecular architectures, suitably organized around rigid organic scaffolds, such as spiro-bifluorene and triptycene. Furthermore, the photophysical characterization of three trans-A2B-phenylcorroles with different substituents on the meso-phenyl ring is introduced, revealing the tendency of such macrocycles to self-organize into dimers, by mimicking natural self-aggregates antenna systems. In the end, the photophysical analysis moved towards the natural super-complex PSI-LHCI, immobilized on the hematite surface of the photoanode of a bio-hybrid dye-sensitized solar cell. The importance of the entire work is related to the need for a deep understanding of the energy transfer mechanisms occurring in supramolecules, to gain insights and improve the strategies for governing the directionality of the energy flow in the construction of well-performing antenna systems.