Sinalização celular e a resposta a estrogénios do epitélio mamário

Estrogens, such as 17β-estradiol (E2) are essential for normal growth and differentiation of the mammary gland. There are two estrogen receptors (ERs), ERα and ERβ which are ligand activated transcription factors. ERα stimulates proliferation and is the single most powerful predictor of breast cancer prognosis and since 70% of breast cancers express ERα, strategies to block this receptor are the primary breast cancer treatment. Unlike ERα, the role of ERβ in breast cancer and its potential as alternative therapeutic target remains controversial, mainly due to the lack of correlation between results obtained in vitro and epidemiological studies. The aim of this thesis was to increase our understanding of the molecular and cellular mechanisms of estrogen signaling in normal and cancerous cells, in different cellular contexts and with focus on ERβ. In Paper I we characterized the effect of the flavone PD098059 - which is a commonly used MEK1 inhibitor - on activation of transcription by ERα and ERβ. We found that the estrogenic effect of PD098059 is dose dependent in concentrations ranging from 1 – 10 μM and that activation of transcription by ER is suppressed by the inhibitory effect of PD98059 on MEK1 at concentrations above 50 μM. In agreement with its flavone nature, PD098059 had a much stronger effect on ERβ than on ERα transcriptional activity. Therefore, use of this compound for the study of signalling events in cells expressing ER should be carefully considered. In Paper II we assessed the effect of ERβ agonists in vivo and administered under different conditions in vitro. In basal conditions, ERβ induced apoptosis; however, in vivo ERβ agonists stimulated proliferation and inhibited apoptosis. In vivo effects were reproduced in culture, by activation of MAPK/ERK½ pathway with epidermal growth factor or basement membrane extract. In addition, insulin signalling and PI3-K/AKT activation was necessary for stimulation of proliferation. These results suggest that the cellular context modulates ERβ activity. Manuscript presents preliminary work aimed at the set-up of a methodological strategy to isolate ERs and to identify interacting proteins in different cellular contexts and which could modulate the bi-phased effects of ERβ in cell growth. In conclusion, the studies presented in this thesis contribute to clarify the apparent contradictory information regarding ERβ function in normal and cancerous mammary epithelium and suggest that the cellular context should be considered when ERβ effects are studied.

Comportamento in vitro de formulações lipossomais de um aminoglicosídeo com actividade anti-parasitária: citotoxicidade e interacção lipossoma-célula

Os sistemas de veiculação de fármacos, presentemente, apresentam-se como uma alternativa viável às terapias convencionais. De entre os diversos sistemas de transporte passíveis de associar substâncias farmacologicamente activas, destacam-se os de base lipídica, em particular, os lipossomas, os quais constituem um dos sistemas mais estudados e com maior sucesso, comprovado pelo número de produtos em fase clínica ou já aprovados para utilização em humanos. Os lipossomas são estruturas constituídas por membranas lipídicas organizadas em bicamadas, fechadas e concêntricas, que permitem a encapsulação de moléculas hidrofílicas no espaço interno aquoso e hidrofóbicas na bicamada lipídica. No presente trabalho, foram desenvolvidas metodologias com vista à encapsulação em lipossomas do aminoglicosídeo, a Paromomicina (PRM). Este fármaco está indicado para o tratamento de doenças infecciosas nomeadamente parasitárias e bacterianas. Algumas das principais desvantagens resultantes da sua utilização em clínica são, o reduzido tempo de circulação na corrente sanguínea, rápida excreção renal e consequentemente insuficiente concentração intracelular do fármaco. Como forma de ultrapassar algumas das desvantagens apresentadas, foram desenvolvidas formulações lipossomais de PRM com vista a melhorar o desempenho deste antibiótico. Para tal, foram preparadas e caracterizadas diversas formulações lipossomais de PRM com vista à selecção daquelas que apresentem maiores valores de eficácia de encapsulação (E.E.), e superior estabilidade. Com as formulações seleccionadas foram realizados estudos in vitro de interacção lipossoma-célula, utilizando uma linha celular humana monocítica leucémica, THP-1. De entre as formulações desenvolvidas e seleccionadas para os estudos in vitro de a formulação DPPC:DPPG, foi uma das que apresentou uma E.E. superior a 80% e valores de internalização celular superiores a 90%.

Interacção Parasita-Hospedeiro e susceptibilidade de Leishmania infantum a fármacos

RESUMO As leishmanioses são doenças causadas por um protozoário intracelular pertencente à ordem Kinetoplastida, da família Trypanosomatidae, do género Leishmania. Os parasitas são transmitidos aos hospedeiros vertebrados por dípteros pertencentes à sub-família Phlebotominae. Devido à inexistência de vacinas a quimioterapêutica continua a representar o único mecanismo de prevenção e controlo. Os fármacos de primeira linha para o tratamento da leishmaniose visceral continuam a ser os antimoniais pentavalentes e a anfotericina B (AMB). A AMB lipossómica está a ser cada vez mais utilizada como 1ª linha. O conhecimento do(s) mecanismo(s) utilizados pelos parasitas, responsáveis pela resistência, é fundamental de modo a permitir o desenvolvimento de novos fármacos anti-Leishmania que possam substituir e/ou complementar os fármacos existentes, de uma forma eficaz assim como contribuir para o desenvolvimento de metodologias para avaliar e monitorizar a resistência. Espera-se do modelo animal a reprodução da infecção na Natureza. Os modelos canino e murino têm ajudado na compreensão dos mecanismos responsáveis pela patogénese e pela resposta imunitária à infecção por Leishmania. Sendo o cão o principal hospedeiro da infecção por L. infantum e o principal reservatório doméstico da leishmaniose visceral humana, procedeu-se à caracterização da evolução da infecção experimental em canídeos de raça Beagle através da análise clínica, hematológica, histopatológica, parasitária, assim com através da resposta imunitária desenvolvida. As alterações hematológicas observadas foram as associadas à leishmaniose visceral: anemia, leucopenia, trombocitopenia com aumento das proteínas totais e da fracção gama-globulina, e diminuição da albumina. Histologicamente observou-se nos órgãos viscerais uma reacção inflamatória crónica, acompanhada por vezes da formação de granulomas ricos em macrófagos. Apesar de todos os animais terem ficado infectados (confirmado pela presença do parasita nos vários tecidos e órgãos recolhidos na necrópsia), os únicos sinais clínicos observados transitoriamente foram adenopatia e alopécia. As técnicas moleculares foram significativamente mais eficazes na detecção do parasita do que os métodos parasitológicos convencionais. As amostras não invasivas (sangue periférico e conjuntiva) mostraram ser significativamente menos eficazes na detecção de leishmanias. No nosso modelo experimental não se observou a supressão da resposta celular ao antigénio parasitário e confirmou-se que, apesar de não protectora, a resposta humoral específica é pronunciada e precoce. A bipolarização da resposta imunitária Th1 ou Th2, amplamente descrita nas infecções experimentais por L. major no modelo murino, não foram observadas neste estudo. O facto dos animais não evidenciarem doença apesar do elevado parasitismo nos órgãos viscerais poderá estar relacionado com a expressão simultânea de citocinas de ambos os tipos Th1 e Treg, no baço, fígado, gânglio, medula óssea e sangue periférico. Neste estudo também se caracterizou o efeito da saliva do vector Phlebotomus perniciosus na infecção experimental de murganhos BALB/c com estirpes de L. infantum selvagem e tratada com AMB, inoculadas por via intradérmica. A visceralização da infecção ocorreu após a utilização da via de administração do inóculo que mais se assemelha ao que ocorre na Natureza. Apesar da disseminação dos parasitas nos animais co-inoculados com extracto de uma glândula salivar ter sido anterior à do grupo inoculado apenas com parasitas, não se detectaram diferenças significativas na carga parasitária, entre os três grupos, ao longo do período de observação pelo que, embora a saliva do vector esteja descrita como responsável pela exacerbação da infecção, tal não foi observado no nosso estudo. O aumento de expressão de citocinas esteve relacionado com o aumento do parasitismo mas, tal como no modelo canino, não se observou bipolarização da resposta imunitária. Os animais dos três grupos infectados parecem ter desenvolvido nos diferentes órgãos uma resposta mista dos tipos Th1 e Th2/Treg. Contudo, verificou-se a predominância da expressão Th1 (TNF-α), no fim do período de observação, o que pode estar relacionado com a resolução da infecção. Por outro lado, a presença de parasitas na pele dos animais inoculados com a estirpe L. infantum tratada com AMB permite colocar a hipótese da existência de parasitas resistentes na Natureza e destes poderem ser transmitidos. Após se ter verificado que a estirpe de L. infantum tratada com AMB tinha a capacidade de infectar e visceralizar no modelo murino, analisou-se o seu comportamento em dois dos principais vectores de L. infantum, Lutzomyia longipalpis e P. perniciosus. Os parasitas tratados com AMB apresentaram uma menor capacidade de permanecerem no interior do vector assim como um desenvolvimento mais lento apontando para uma menor capacidade de transmissão das estirpes resistentes a este fármaco, pelo que o tratamento com AMB poderá ser favorável à prevenção e controlo através da interrupção do ciclo de vida do parasita. De modo a determinar in vitro a susceptibilidade de Leishmania aos diferentes fármacos utilizados na terapêutica da leishmaniose humana e canina (Glucantime®, Fungizone®, miltefosine e alopurinol) comparou-se o sistema de promastigotas axénicos com o sistema amatigota-macrófago. Verificou-se que, para as estirpes estudadas, os resultados de ambos os sistemas não apresentavam diferenças significativas sendo a utilização do primeiro mais vantajosa ao ser menos moroso e de mais fácil execução. Seleccionaram-se estirpes quimio-resistentes in vitro, por exposição prolongada a doses crescentes de AMB, tendo-se verificado que os parasitas tratados, apresentaram uma menor susceptibilidade do que os não tratados à acção dos fármacos estudados, com excepção do alopurinol. A diminuição da susceptibilidade das estirpes aos fármacos utilizados poderá facilitar a dispersão de parasitas multiresistentes. Sendo a apoptose um dos mecanismos utilizados pelos parasitas para evitar a indução de uma resposta imune por acção de compostos anti- Leishmania, determinou-se o número de amastigotas apoptóticos assim como a produção de TNF-α e IL-10 pelos macrófagos tratados. Concluiu-se que os compostos conseguiram suprimir a produção de IL-10, inibidora da activação dos macrófagos, contudo nem a produção da citocina pro-inflamatória TNF- α nem a apoptose pareceram ser os principais mecanismos responsáveis à sobrevivência dos parasitas ao contacto com os fármacos.

Síntese de muropéptidos bacterianos para estudos de interacção com a vancomicina

A vancomicina é um membro da família dos antibióticos glicopeptídicos considerado de último recurso no tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-positivas. A fim de encontrar novos agentes para combater a resistência bacteriana é importante compreender os detalhes do mecanismo de acção de antibióticos glicopeptídicos. Estes antibióticos evitam a formação de peptidoglicano (PGN), o principal componente da parede celular bacteriana, o qual é constituído por uma cadeia alternada de N-acetil-glucosamina (GlucNAc) e ácido N-acetil-murâmico (MurNAc) ligados entre si poruma ligação glicosídica β(1→4), e estas cadeias ligam-se entre si por pequenas cadeias peptídicas. Está bem estabelecido que a substituição do último aminoácido da cadeia peptídica ligada à unidade MurNAc altera a interacção das bactérias com os antibióticos glicopéptidicos. Até agora, os estudos de interacção foram limitados ao uso de dipéptidos e tripéptidos N-protegidos. De modo a clarificar a forma como as diferentes composições da unidade peptídica e da unidade de carbohidratodos muropéptidos bacterianos afectam o reconhecimento pela vancomicina, desenvolvemos neste estudo a síntese de uma pequena biblioteca de muropeptidos e péptidos para futuros testes de interação molecular. A unidade MurNAc foi sintetizada por duas vias diferentes, envolvendo diferentes grupos protectores do grupo amina, o acetilo e o aliloxicarbonilo. O derivado de MurNAc 8 foi preparado em 7 passos, com 3% de rendimento pela via envolvendo a GlucNAc. Para a síntese das cadeias peptídicas utilizou-se a técnica de síntese de péptidos em fase sólida (SPFS). Os péptidos e muropéptidos foram sintetizados utilizando como terminal de D-Ala, Gly e D-Ser por SPFS com sucesso. Os estudos preliminares de interacção entre a vancomicina e a unidade MurNAc sugerem uma possível alteração conformacional da vancomicina na presença de MurNAc, pelo que de futuro as interações entre estas duas estruturas e os muropéptidos sintetizados deverão ser investigadas.

Efecto de un prebiótico PCL (Pared Celular de Levadura) -Glucano, sobre el comportamiento productivo de pollos de engorde.

Se realizó un experimento para evaluar el efecto de un prebiótico derivado de paredes celulares de levadura (PCL-Glucano) sobre el comportamiento productivo de pollos de engorde. Se utilizaron 245 aves de un día de edad (estirpe Cobb 500), los cuales fueron distribuidos mediante un diseño completamente al azar en cinco tratamientos con siete repeticiones por tratamiento. Y siete aves por repetición. Los tratamientos evaluados fueron: T1: concentrado comercial (CC), T2: CC + antibiótico (Ribofloxacina al 10%), T3:0.1% de prebiótico PCL-Glucano (1000 mgkg -1 de alimento), T4: 0.15% de prebiótico PCL-Glucano (1500 mgkg -1 de alimento) y T5:0.20% de prebiótico PCL-Glucano (2000 mgkg -1 de alimento); las variables evaluadas fueron peso vivo, ganancia de peso, consumo de alimento y conversión alimenticia. Se realizaron mediciones a los 21, 35 y 42 d. Se encontró que los mayores pesos vivos (2347 y 2307 g), ganancias de pesos finales (2,316 y 2,275 g) y mejor conversión alimenticia (1.82 y 1.84) se obtuvieronconT2 y T5, sin diferencias estadísticas entre sí, pero fueron significativamente (P<0.05) superiores a T1, T3 y T4. El análisis financiero demostró que el mejor tratamiento fue T5, superando a T2 en U$ 0.21, en relación al costo utilidad del uso de los tratamientos. En conclusión la utilización de PCL-Glucano a razón de 0.20% en el concentrado de inicio y concentrado final para pollos de engorde, es una alternativa viable biológicamente y financieramente, para reemplazar el uso de antibióticos como aditivos en la alimentación de pollos de engorde.

Desmistificando a convergência : o caso da radiodifusão no celular

Analisa as implicações técnicas, sociais e legais da oferta, por operadoras de telefonia celular, de serviço de acesso a conteúdo produzido por emissoras de radiodifusão e outras produtoras, nas modalidades transmissão ao vivo (streaming) e descarga de conteúdo sob-demanda (ou download de vídeo on-demand).

Radiação das antenas do serviço móvel celular e seu tratamento na legislação brasileira e de outros países

Consultoria Legislativa - Área XIV - Comunicação Social, Informática, Telecomunicações, Sistema Postal, Ciência e Tecnologia.

Los errores conceptuales y las ideas previas del alumnado de ciencias en el ámbito de la enseñanza de la biología celular. Propuestas alternativas para el cambio conceptual.

Este trabajo se ha centrado en el estudio de los errores conceptuales en las ciencias biológicas, pudiendo así, si fuera posible, buscarle una posible solución para erradicarlos o, por lo menos, que las preconcepciones de los alumnos coincidan con las teorías científicas. Además, promueve reflexionar sobre los problemas vinculados con la enseñanza de la Biología celular.

Terapia celular para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer: angiogénesis terapéutica inducida por células microencapsuladas secretoras del factor de crecimiento del endotelio vascular

197 p. (Bibliogr. 189-197)

Análise da viabilidade celular de um monobiofilme de Streptococcus mutans após exposição a colutórios bucais presentes no mercado brasileiro

Este estudo tem como propósito analisar a eficácia de diferentes formulações de antissépticos bucais presentes no mercado brasileiro sobre um monobiofilme de Streptococcus mutans (ATCC 25175). O experimento foi realizado expondo as amostras às formulações por 1 minuto. Os biofilmes foram desenvolvidos semeando as cepas em tubos de ensaio contendo meio de cultura TSB acrescido de 1% de sacarose por 7 dias, com trocas de meio a cada 48 horas. A amostra foi dividida em grupos: monobiofilme tratado com solução contendo clorexidina (controle positivo); monobiofilme tratado com solução contendo óleos essenciais; monobiofilme tratado com solução contendo triclosan; biofilme tratado com solução contendo triclosan acrescido de cloreto de zinco; monobiofilme tratado com solução contendo cloreto de cetilpiridínio; monobiofilme tratado com solução salina fisiológica estéril (controle negativo). Para a análise do efeito pós antibiotico, as cepas foram removidas e plaqueadas imediatamente após a exposição e após 2 horas de crescimento em meio TSB. A média do crescimento bacteriano foi convertida em unidades formadoras de colônia (UFC) para análise. Para analizar a capacidade de recolonização as cepas foram inoculadas em TSB acrescido de sacarose por 48hs. os valores submetidos à análise estatística pelo teste t-student e ANOVA com modificação de Tukey e Dunnett. Os resultados nos permitem concluir que: todos os grupos tratados com antissépticos apresentaram redução das concentrações de microrganismos viáveis em relação ao controle negativo, nos dois tempos analizados. As formulações contendo triclosan e óleos essenciais não apresentaram diferença nem relação ao controle positivo e nem entre eles mesmos, também nos dois tempos. As formulações de antissépticos, contendo clorexidina, óleos essenciais, triclosan podem alterar a capacidade de recolonização do monobiofilme, neste modelo.

A mobilidade eletroforética e o perfil de potencial da membrana celular

O objetivo do presente trabalho foi estudar o comportamento dos potenciais superficiais e do perfil de potencial atraves da membrana de eritr ocito em func ao da forca i onica e das cargas superficiais, usando um modelo que leva em conta as cargas el etricas do glicoc alix e das proteınas citoplasm aticas, al em das cargas superficiais da bicamada lipıdica e os efeitos dos eletr olitos divalentes. Programas especıficos em linguagem C foram elaborados para o c alculo desses potenciais, tomando como dados num ericos resultados experimentais de medidas de mobilidade eletrofor etica de eritr ocitos para diferentes valores de forca i onica. Neste c alculo, o metodo para tratamento dos dados eletrofor eticos indicado por Hsu et al.[57] foi incluıdo em nosso modelo. A equac ao de Poisson-Boltzmann nao linear foi resolvida por computac ao num erica, usando o metodo de Runge-Kutta de quarta ordem, obtendo-se os perfis de potencial. Os resultados mostraram que a estimativa da densidade de carga el etrica na superfıcie de c elulas usando a equac ao cl assica de Helmholtz-Smoluchowski conduz a valores que nao conseguem refletir as forcas que regem o comportamento eletrofor etico das mesmas. O presente modelo gerou valores de potenciais superficiais e perfis de potencial para a membrana do eritr ocito bem distintos daqueles obtidos anteriormente para um modelo descrito por uma equac ao de Poisson-Boltzmann linear. Nossos resultados confirmam que a avaliac ao de parametros el etricos superficiais da membrana de eritr ocito, envolvendo dados oriundos de eletroforese, deve incluir c alculos hidrodin amicos al em de eletroest aticos, como sugerido por Hsu et al. [57].

Revisiones en biología celular y molecular

Desde la perspectiva de este año 2010, el presente libro podría ser considerado como una segunda etapa del camino emprendido por los editores en el bienio 1999-2000. Por aquel entonces propusimos a los alumnos de nuestro curso de doctorado “Bases y mecanismos de la diferenciación”, un enfoque por aquel entonces novedoso a la hora de desarrollar la docencia de tercer ciclo. La novedad propuesta a los alumnos consistió en la adaptación de los tradicionales trabajos de los cursos de doctorado a la redacción de un capítulo de libro, destinado a cubrir el vacío que existía en el mercado editorial por aquella época en cuanto a libros de diferenciación se refería. Pero con este enfoque de la docencia teníamos previsto algo más complejo. No pretendíamos tan solo implicar a los alumnos en profundizar en un tema de su interés relacionado con la diferenciación, sino también ayudarles y guiarles en la redacción de un documento científico con los conocimientos adquiridos, iniciándoles en las búsquedas bibliográficas, la selección de textos, la corrección de estilo, etc. En definitiva, implicarles de alguna manera más activa en su docencia, y que su papel no fuese meramente pasivo de oyentes de conferencias. En aquellos momentos se empezaba a hablar del espíritu reformador de Bolonia, y quisimos experimentar algunos de los aspectos que en él se propugnaban con un número reducido de alumnos muy bien preparados.

Quantificação das células estreladas ativadas / miofibroblastos e análise da apoptose das células do fígado durante a terapia celular na fibrose hepática em ratos

A fibrose hepática é o resultado de uma resposta cicatrizante frente a repetidas lesões no fígado, e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de proteínas da matriz extracelular (MEC) no parênquima hepático, incluindo colágeno, fibronectina, elastina, laminina e proteoglicanos, com a participação de diferentes populações celulares do fígado. As principais células responsáveis pela síntese de proteínas da MEC na fibrose hepática são as células estreladas hepáticas ativadas e os miofibroblastos, que surgem após estímulo inflamatório e são caracterizadas pela expressão de alfa-actina de músculo liso (α-SMA). Sabe-se que durante a progressão da fibrose hepática, ocorre a morte de hepatócitos e sua substituição por células fibrogênicas α-SMA+. A apoptose dessas células fibrogênicas é de grande relevância para a regressão da fibrose e regeneração hepática. Nos últimos anos, a terapia com células tronco de medula óssea tem sido utilizada para estimular a regeneração hepática em diferentes modelos experimentais e protocolos clínicos. A fração mononuclear da medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas e células-tronco mesenquimais. O objetivo deste estudo foi analisar a expressão de α-SMA e o processo de apoptose de células hepáticas durante a fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) e após o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO). Os fígados foram coletados de ratos dos seguintes grupos: normal, 14 dias de LDB, 21 dias de LDB e animais que receberam CMMO após 14 dias de LDB, e foram analisados após 7 dias (totalizando 21 dias de LDB). Para quantificar a expressão de α-SMA por células fibrogênicas nos grupos experimentais, foi realizada imunoperoxidase para α-SMA, seguida de morfometria no programa Image Pro Plus. Para analisar a apoptose nas células hepáticas, foi realizada imunoperoxidase e Western Blotting (WB) para caspase-3 (proteína apoptótica) e imunofluorescência com dupla-marcação para caspase-3 e α-SMA, seguida de observação em microscópio confocal. Os resultados da quantificação de α-SMA por morfometria mostraram que a expressão de α-SMA aumentou significativamente 14 e 21 dias após a LDB. Entretanto, essa expressão diminuiu significativamente no grupo tratado com CMMO, que apresentou parênquima hepático mais preservado em relação ao grupo com 21 dias de LDB. Os resultados de imunoperoxidase, WB e microscopia confocal para expressão de caspase-3 demonstraram que essa proteína diminuiu nos animais fibróticos com 14 e 21 dias de LDB com relação ao grupo normal, e estava significativamente elevada no grupo tratado com CMMO. A análise por microscopia confocal demonstrou que algumas células coexpressaram α-SMA e caspase-3 nos animais tratados com CMMO, sugerindo a morte de células fibrogênicas e remodelamento do parênquima hepático.

Modulação da expressão dos componentes da matriz extracelular e a modulação celular na regeneração da fratura óssea padronizada em tíbia de ratos

O propósito do presente trabalho foi investigar a participação da proliferação celular e da expressão dos componentes da matriz extracelular na cascata de eventos do processo de reparo da fratura óssea, empregando as técnicas histológica, imunohistoquímica e morfométrica, em um modelo experimental padronizado para a indução da lesão na tíbia de ratos a partir do método empregado por Yuehuei e Friedman7. É importante padronizar um modelo de indução da fratura, para posterior investigação da participação das células e dos componentes da matriz extracelular no processo de reparo da fratura, considerando que o tempo de consolidação depende significantemente da natureza e do tipo da lesão produzida. Quarenta (n = 40) ratos Wistar foram submetidos a fratura . Os animais foram avaliados em oito (n = 8) grupos de cinco (n = 5) animais, cada grupo emperimental com 12, 24, 48, 72, 96, 144, 192 e 240 horas após a fratura (12h até 10 dias). As fraturas foram classificadas de acordo com o sistema de classificação internacional de fratura de Muller100, AO (Associação para Osteosíntese). Foram encontradas fraturas simples em 86% do total, sendo 68% de fraturas transversas e 18% de fraturas obliquas, 14% do total de fraturas foram complexas, sendo 8% de fraturas irregulares e 6% de fraturas segmentares. Esses resultados demonstram que o aparelho permite padronizar radiológicamente o tipo de fratura, caracterizado pela linha que separa os fragmentos ósseos. Os resultados qualitativos dos componentes da matriz extracelular para TGF-β, VEGF, colágeno I e II, osteopontina, proteoglicanos, fibras do sistema elástico com a coloração de resorcina funcsina de Weigert, e para proliferação celular pelo PCNA, assim como os resultados morfométricos, sugerem que a modulação da expressão dos componentes da matriz extracelular e a proliferação celular durante o processo de reparo da fratura não é homogênea para todos os componentes teciduais, dependendo significantemente das tensões locais geradas pelo tipo da linha de fratura que pode ser determinante no tempo de regeneração do osso e na qualidade da restauração das propriedades biomecânica. Nossos achados podem contribuir para melhor compreensão da reparo de fratura óssea e para novas abordagens terapêuticas que considerem as propriedades biomecânicas do tecido ósseo em reparo nas suas diferentes etapas

Análise proteômica comparativa dos componentes da superfície celular e do secretoma de Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, infecção fúngica oportunista com altas taxas de mortalidade afetando, principalmente, pacientes com neutropenia profunda e prolongada. Durante o processo de invasão e disseminação características desta infecção sistêmica, os conídios do fungo inalados e não eliminados pelas células do sistema imune inato diferenciam-se em hifas que, por sua vez, são angioinvasivas. Pouco se conhece sobre as moléculas da parede celular envolvidas na patogênese do A. fumigatus e/ou secretadas por este patógeno. Neste contexto, este trabalho procura ampliar o entendimento desta doença através do estudo de proteínas diferencialmente expressas na superfície de A. fumigatus durante a morfogênese. Foi utilizada uma abordagem proteômica e foram estudados extratos de superfície de células de A. fumigatus em diferentes estágios durante o processo de filamentação. Estas células foram denominadas, de acordo com o tempo de cultivo e a morfologia, como: TG6h (tubo germinativo), H12h ou H72h (hifas). As proteínas de superfície celular foram extraídas, a partir de células intactas, por tratamento brando com o agente redutor DTT (ditiotreitol). Observou-se que o perfil funcional das proteínas expressas por H12h e H72h foi similar, com exceção de proteínas relacionadas à resposta ao estresse, enquanto o perfil para TG6h apresentou diferenças significativas para vários grupos funcionais de proteínas quando comparado às hifas. Desta forma, foram realizados experimentos de proteômica diferencial entre tubo germinativo (TG6h) e a hifa madura (H72h), pela técnica de DIGE (differential gel electrophoresis). Os resultados revelaram que entre as proteínas diferencialmente expressas, aquelas relacionadas às vias de biossíntese e outras denominadas multifuncionais encontraram-se superexpressas em TG6h. Em relação às proteínas de resposta a estresse, observou-se que algumas HSPs eram mais expressas neste morfotipo, enquanto a MnSOD, relativa à resposta ao estresse oxidativo, era mais abundante na hifa. Com exceção da PhiA, integrante da parede celular, as proteínas identificadas como diferencialmente expressas na superfície do A. fumigatus não possuem sinal para secreção identificável, enquadrando-se nas proteínas atípicas de superfície. Foi verificada a integridade da membrana celular após tratamento com DTT, bem como a marcação por biotina das proteínas extraídas, o que comprovou sua localização superficial na célula fúngica. Hipóteses de que estas proteínas sejam endereçadas à parede celular por via secretória alternativa sustentam estes dados. Estas evidências foram confirmadas pelo fato de não terem sido encontradas as mesmas proteínas da superfície na análise do secretoma do A. fumigatus. Além disso, todas as proteínas caracterizadas no secretoma apresentavam sinal de secreção determinado pelo FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). A análise do secretoma foi realizada utilizando-se a cepa selvagem AF293 e a mutante ∆prtT, mutante para um fator de transcrição que atua na regulação da secreção de proteases. Os resultados revelam a ALP1 como expressa na cepa selvagem, assim como outras proteases importantes para virulência e desenvolvimento da célula fúngica, estando suprimidas quando o gene prtT foi deletado.