Feeding rates affect heat shock protein levels in liver of larval white sturgeon (Acipenser transmontanus)

A two-week trial was conducted to study the effect of feeding rates on heat shock protein levels in larval white sturgeon. The larvae (30 day post hatch, 230 mg initial body weight) were fed a commercial feed (12.6% moisture, 49.5% crude protein. 20.7% Crude fat, and 8.6% ash) at 5, 15. or 25% body weight per clay (BW d(-1)). Liver heat shock proteins (Hsp) were measured before and after the larvae were subjected to a heat shock from 18 to 26 degrees C at 1 degrees C/15 min and maintained at 26 degrees C for 4 h thereafter. Before heat shock, larvae fed 5% BW d(-1) had significantly (P<0.05) lower final body weight, RNA/DNA ratio, whole body lipid and protein content, and Hsp60 and Hsp70 levels but higher protein efficiency ratio, and whole body moisture content than larvae fed the two higher feeding rates. Heat shock significantly induced Hsp60 and Hsp70 levels in the liver of all fish but they were lower in larvae fed the 5% than those fed 15 and 25% BW d(-1). Hsp70 level increased much more than Hsp60 after the heat shock Suggesting that Hsp70 is a more sensitive biomarker under our experimental conditions. (c) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

TRIM5α基因的分子进化及AIDS 免疫治疗相关腺病毒载体的构建

本文包括两方面的研究工作。第一部分对TRIM5α基因在灵长类动物中的分 子进化进行了详尽的研究，希望能从分子进化的角度认识该基因在灵长类动物抵 抗病毒感染尤其是在限制HIV-1 感染过程中所起的作用，并希望能够从中寻找适 合用于AIDS 基因治疗的基因。第二部分构建了艾滋病治疗性DC 疫苗相关的腺 病毒载体，包括表达HIV-1 gp120 基因、表达HIV-1 gp41 基因、表达HSP70 基 因以及仅表达绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒，为利用HIV-1 抗原刺激的DC 免 疫治疗AIDS 的研究奠定了基础。 在长期的HIV-1 和AIDS 研究中，人们发现很多种旧大陆猴不能被HIV-1 感 染，而旧大陆猴中的平顶猴却对HIV-1 有易感性，并且对SIV 的感染也表现出较 其它旧大陆猴更为严重的症状，TRIM5α基因的发现解释了这一“历史之谜”。人 们发现旧大陆猴的TRIM5α基因具有很强的抗HIV-1 的功能，是旧大陆猴抵抗 HIV-1 感染必须的免疫因子；并且进一步证明TRIM5α是灵长类动物中普遍存在 的、具有抗多种逆转录病毒功能的天然免疫因子。我们通过对TRIM5α基因在灵 长类动物中的分子进化研究发现，证明该基因在进化过程中表现出很强的达尔文 正向选择作用，尤其是其负责识别逆转录病毒衣壳蛋白的SPRY 结构域。TRIM5 α基因表现出的正向选择很可能是灵长类动物在长期的进化过程中反复被病毒 感染的选择压力造成的，这也从另一个方面证明TRIM5α基因是一个普遍存在的、 具有抗病毒功能的天然免疫因子。对不同灵长类动物的TRIM5α基因序列分析发 现，该基因的序列变化很大，这可能是不同灵长类动物被HIV-1 感染后表现不同 症状的原因；基于密码子的中性检测证明，TRIM5α基因SPRY 结构域上第347、 354、552 位氨基酸表现出很强的正向选择，说明这些位点可能与其抗病毒功能 关系紧密。另外，我们发现平顶猴的TRIM5α基因与CypA 基因以一种新的方式 融合，这种融合方式不同于鹰猴中该基因与CypA 基因的融合，而且与具有较强抗HIV-1 功能的恒河猴的TRIM5α基因比较，平顶猴的TRIM5α基因在几个与其 抗病毒功能紧密相关的位点上的氨基酸也发生了变化，这可能是其被HIV-1 和 SIV 感染后表现出较其它旧大陆猴更为严重症状的原因。 将经过HIV-1 抗原刺激的DC 回输到HIV-1 感染者体内可以诱导产生较强的 抗HIV-1 细胞免疫反应，这种免疫反应理论上可以治疗AIDS，而且对HARRT 治 疗能够产生很好的协同作用；HSP70 蛋白可以提高DC 对抗原的加工和呈递。为 了检测经HIV-1 抗原刺激的DC 免疫治疗AIDS 的实际效果，同时检验通过HSP70 增强DC 对HIV-1 抗原的加工和呈递功能，发现并解决这一治疗方案存在的问题， 我们首先从HIV-1 的基因组及带有HSP70 基因的质粒上克隆了gp120、gp41 和 HSP70 基因，测序及序列分析证明所克隆的基因没有发生影响表达的突变。然后 我们分别构建了表达有关基因的重组腺病毒载体。在荧光显微镜下可以观察到感 染后的细胞内绿色荧光蛋白报告基因的表达，证明成功构建了四种重组腺病毒， 而PCR 扩增也证明在其中三种重组腺病毒的基因组上确实分别带有gp120、gp41、 HSP70 基因。同时我们还构建了不表达外源基因的重组腺病毒，作为未来实验中 的对照载体。未来的研究工作包括目的基因表达检测，重组腺病毒感染DC 及腺 病毒感染DC 功能分析等。

转座子Minos介导的果蝇转基因平台构建及水稻高表达启动子的克隆 任娟 指

本实验室果蝇研究工作，主要集中在黑腹果蝇的新基因起源的研究。新基因起源的分子机制主要包括：外显子重排、基因复制、基因逆转座、移动元件介导、基因水平转移、基因从头起源、基因的断裂融合。为了阐述这些新基因的产生和它们所带来的物种适应性，我们对这些新近起源的基因进行了功能研究。但是，仅仅限于新基因所在物种的功能研究并不能完全解释新基因产生的进化原因，我们需要了解它是否能够给没有该基因的果蝇物种带来一定的适应性。例如一些生殖相关新基因，如果我们将它们转入没有该基因的果蝇，那是否能够给该果蝇带来生殖能力的提高？无论结果如何，这都为我们研究新基因的起源提供一个重要线索。由此，黑腹果蝇以外的其它果蝇物种中实现转基因成为该研究的重要技术环节。但是，实验室目前的转基因系统仅限于P转座子介导的黑腹果蝇转基因系统，因而我们需要建立一种新的转基因平台。而转座子Minos打破物种范围的转基因特性，以及它的转座特点为我们提供了选择。转座子Minos是从果蝇D. hydei中克隆出来长约1.8kb的Ⅱ型转座子，Tc1家族转座元件成员。Minos的转座机制与大部分转座子一样，在宿主基因组里面实行着剪切和粘贴的运作机制。Minos在转座时，偏向插入TA位点并且主要集中于内含子区域，这样可以减少对插入位置基因的影响。此外，Minos在黑腹果蝇中的转座效率约30%，并且拥有一套成熟的选择标记。因此，Minos成为我们解决非黑腹果蝇转基因技术难题的首选。 在本文的工作中，我们采用由希腊Savakis教授（希腊分子生物学与生物技术研究所）提供的Minos转基因系统，完成果蝇的转基因实验。在这套转基因系统中，非自主的转座子Minos和转座酶基因被克隆到了不同载体当中。其中Minos转座子序列中插入了由3xP3眼睛特异表达的启动子介导表达的eGFP报告基因，而转座酶基因则由热激蛋白hsp70启动子调控表达。实验过程中，我们在果蝇D. melanogaster 和D. yakuba的胚胎中分别同时显微注射入含有转座子和转座酶本实验室果蝇研究工作，主要集中在黑腹果蝇的新基因起源的研究。新基因起源的分子机制主要包括：外显子重排、基因复制、基因逆转座、移动元件介导、基因水平转移、基因从头起源、基因的断裂融合。为了阐述这些新基因的产生和它们所带来的物种适应性，我们对这些新近起源的基因进行了功能研究。但是，仅仅限于新基因所在物种的功能研究并不能完全解释新基因产生的进化原因，我们需要了解它是否能够给没有该基因的果蝇物种带来一定的适应性。例如一些生殖相关新基因，如果我们将它们转入没有该基因的果蝇，那是否能够给该果蝇带来生殖能力的提高？无论结果如何，这都为我们研究新基因的起源提供一个重要线索。由此，黑腹果蝇以外的其它果蝇物种中实现转基因成为该研究的重要技术环节。但是，实验室目前的转基因系统仅限于P转座子介导的黑腹果蝇转基因系统，因而我们需要建立一种新的转基因平台。而转座子Minos打破物种范围的转基因特性，以及它的转座特点为我们提供了选择。转座子Minos是从果蝇D. hydei中克隆出来长约1.8kb的Ⅱ型转座子，Tc1家族转座元件成员。Minos的转座机制与大部分转座子一样，在宿主基因组里面实行着剪切和粘贴的运作机制。Minos在转座时，偏向插入TA位点并且主要集中于内含子区域，这样可以减少对插入位置基因的影响。此外，Minos在黑腹果蝇中的转座效率约30%，并且拥有一套成熟的选择标记。因此，Minos成为我们解决非黑腹果蝇转基因技术难题的首选。 在本文的工作中，我们采用由希腊Savakis教授（希腊分子生物学与生物技术研究所）提供的Minos转基因系统，完成果蝇的转基因实验。在这套转基因系统中，非自主的转座子Minos和转座酶基因被克隆到了不同载体当中。其中Minos转座子序列中插入了由3xP3眼睛特异表达的启动子介导表达的eGFP报告基因，而转座酶基因则由热激蛋白hsp70启动子调控表达。实验过程中，我们在果蝇D. melanogaster 和D. yakuba的胚胎中分别同时显微注射入含有转座子和转座酶所在的质粒。转座酶在37度条件诱导下进行表达，协助Minos完成转座过程。在转基因果蝇的阳性筛选中，我们利用眼睛特异表达的绿色荧光蛋作为选择标记。并且，我们通过PCR实验进一步验证了转基因果蝇的真实性。本研究中，我们对转基因实验条件进行了初步优化。我们通过对黑腹果蝇白眼突变品系W1118和D. yakuba注射后胚胎进行保湿，对D. yakuba注射胚胎进行非退壳处理。在改进条件下W1118和D. yakuba的存活率分别为10%和3%左右。通过筛选转基因阳性果蝇，我们得出Minos在W1118和D. yakuba中的转座效率分别在32%和20%左右。我们的实验结果再一次证实了Minos在果蝇D. melanogaster中可行性。同时，该工作也初步完成了在果蝇D. yakuba 中的第一次Minos介导的转基因实验，为新基因的跨物种功能研究奠定了实验基础。在未来的工作计划中，我们将采用Minos转基因系统，把实验室目前研究的黑腹果蝇新基因导入其它物种果蝇进行功能研究。 水稻是一种重要的世界粮食作物，世界上过半的人口以水稻为主食。水稻相对别的粮食作物来讲具有较小的基因组，并且拥有较好的基因组注释，是一种理想的单子叶模式生物。植物转基因技术的发展推动着水稻功能基因组学的研究，目前水稻的转基因技术主要依赖于土壤细菌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）T-DNA介导的外源基因染色体插入。在自然状态下，农杆菌的T-DNA位于Ti致瘤质粒当中。它包括了一些转座元件和一些帮助T-DNA转座的毒性蛋白基因和调节基因。由于Ti质粒上的T-DNA太长，并且没有太多的酶切位点，因此自然状态的T-DNA不适合进行转基因实验。为了方便T-DNA的实际应用，研究人员创立了双载体转基因系统。T-DNA转座区被分离到出Ti载体，并且装载到另外一个适合实验操作的质粒当中，而毒性蛋白表达基因等则保留在Ti质粒上。因此，在进行T-DNA介导的转基因实验时，需要同时存在T-DNA载体和Ti质粒。 本文以“水稻注释计划数据库RAP-DB”的表达数据为参考，选择了60个高表达基因的启动子区域进行克隆。通过对T-DNA载体pCAMBIA1301 进行改造，去掉其原来的35S启动子，将预测的基因启动子克隆到该载体中并与报告基 摘要 因GUS 基因融合。通过分子克隆实验，我们得到了45个高表达基因的启动子载体。最终，为了测试这45个启动子的启动效率，我们会将它们转化到水稻愈伤组织中通过启动子融合的GUS基于表达情况来判断我们启动子的启动效率。

土壤低浓度PAHs胁迫下赤子爱胜蚓差异表达基因初步筛选

为探索土壤低浓度多环芳烃污染的生态毒性及其对土壤生物的致毒机理，本论文初步研究了菲、芘、荧蒽和苯并[a]芘等四种多环芳烃人工土壤污染在0.1mg.kg-1~10.0mg.kg-1浓度水平对赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）产卵量、体重变化、排卵激素annetocin基因和翻译控制肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein, TCTP）转录水平的影响，发现在相同的低浓度水平下，只有苯并[a]芘对蚯蚓annetocin前体基因和TCTP基因的表达有显著影响，故其对生物体的生殖风险和致癌风险可能最大。另一方面，低浓度苯并[a]芘对蚯蚓体重和产茧量并无显著影响，这表明基因表达水平作为污染生态监测指标比宏观观测指标更灵敏。 为进一步研究土壤PAHs污染的生态毒性效应，在上述研究基础上，我们采用SSH-PCR的方法构建了人工土壤1.0mg.kg-1苯并[a]芘胁迫下的蚯蚓与对照组蚯蚓之间的消减cDNA文库，随机挑取上调文库301个克隆及下调文库283个克隆进行测序，与NCBI蛋白数据库比对结果表明，其中有391个克隆与已知的75种蛋白质基因显著匹配（期望值< 10-5），其余克隆匹配不显著（期望值> 10-5）或找不到匹配蛋白。显著匹配的基因序列包括：一相解毒酶细胞色素P450，二相解毒酶谷胱甘肽硫转移酶，蛋白质合成所需的核糖体蛋白亚基，参与新合成肽链折叠的热休克蛋白，线粒体基因组编码的呼吸链复合酶体亚基，过氧化物还原蛋白，铁蛋白，钙结合蛋白，半胱氨酸蛋白酶等。表明低浓度苯并[a]芘胁迫引起蚯蚓的生理变化是非常复杂的，涉及污染物降解与解毒、抗氧化保护、能量代谢、蛋白质合成、金属离子调节与蛋白质降解等过程。 Real-time PCR检测验证消减文库中部分差异基因对不同剂量BaP胁迫响应结果表明，各检验基因序列受1.0 mg∙kg-1 BaP 胁迫影响均与消减结果一致，且影响程度均高于0.1 mg∙kg-1浓度水平的BaP；其中，在0.1 mg∙kg-1 BaP胁迫下，过氧化物还原酶PRDX和类似Cyp2R1的P450基因表达未见明显变化。其余的HSP70、HSP90、rpL10、COXⅡ、SCBP、Ferritin等基因在0.1 mg∙kg-1 BaP胁迫组蚯蚓中均有检测到预期表达变化，说明虽然从消减文库中获得的基因在一定的污染物浓度范围内均表现浓度效应，但各个基因对污染物的响应浓度不尽相同。 Real-time PCR检测消减文库中部分差异基因对不同PAHs胁迫响应结果表明，1.0 mg∙kg-1 浓度水平的荧蒽、菲、芘和苯并[a]芘对差异表达基因的影响不尽相同，主要有以下三种情况：(1)广谱响应型：蚯蚓线粒体编码的亚基COXⅡ、可溶性钙结合蛋白、铁蛋白等基因对荧蒽、菲、芘及苯并[a]芘的胁迫均有相似的响应；(2)随芳烃环数而变化型：热休克蛋白HSP70和过氧化物还原酶PRDX表现出响应程度随胁迫多环芳烃的环数增加而提高的现象；(3)仅在苯并[a]芘中有响应型：核糖体蛋白亚基L10和细胞色素P450（类似Cyp2R1）基因，在1.0 mg∙kg-1浓度条件下，它们仅受BaP诱导表达，而芘、菲和荧蒽却没有显示诱导作用。 上述结果表明，在土壤中的低浓度的多环芳烃污染胁迫对蚯蚓的影响是多方面的，这些影响至少涉及能量代谢、污染物降解与解毒、蛋白质合成与修复、信号转导、细胞凋亡、排卵生殖、个体发育等多方面的生理功能。目前蚯蚓基因组还未有完整测序，本文论述的多个差异表达基因是首次在蚯蚓中发现的，这些新发现的基因序列在为低浓度PAHs的生态毒性机理研究提供依据的同时，也为以蚯蚓为模式生物的土壤污染生物监测提供了备选的生物分子标记。另一方面，由于蚯蚓基因组未完整测序，本研究构建的消减文库中仍不少未知功能基因，其功能与调控有待进一步研究。

动物生物标志物在土壤污染生态学研究中的应用

应用陆栖无脊椎动物的生物标志物对土壤生态系统中污染物的暴露和效应进行评价日益受到重视 ,并取得了显著的研究进展 .文中介绍了溶酶体、胁迫蛋白和金属硫蛋白 (MTs) 3种主要生物标志物 .体腔细胞内溶酶体膜稳定性用中性红保持时间 (NRR)进行检测 ;胁迫蛋白类多采其中的Hsp70和Hsp6 0 ;金属硫蛋白不同同分异构体的定量分析可用于反映不同的金属污染胁迫 .对 3种生物标志物机理、特性、检测实例以及在污染土壤生态毒理诊断中的应用前景进行了评述 .

Cloning, sequencing and expression analysis of cDNA encoding a constitutive heat shock protein 70 (HSC70) in Fenneropenaeus chinensis

The cDNA encoding hsc70 of Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis was cloned from hepatopancreas by RT-PCR based on its EST sequence. The full length cDNA of 2090 bp contained an open reading frame of 1956 nucleotides and partial 5'- and 3'-untranslated region(5'- and 3'-UTR). PCR amplification and sequencing analysis showed the existence of introns in the region of 1-547 bp, but they did not exist in the region of 548-2090 bp of hsc70 cDNA. When the deduced 652 amino acid sequence of HSC70 was compared with the members of HSP70 family from other organisms, the results showed 85.9% similarity with HSC71 from Oncorhynchus mykiss and HSC70 from Homo sapiens. It also exhibited 85.8% similarity with HSP70 from Mus musculu and 85.4% with HSC70 from Manduca sexta. Expression analysis showed that hsc70 mRNA was espressed constitutively in hepatopancreas, muscle, eyestalks, haemocytes, heart, ovary, intestine and gills in Fenneropenaeus chinensis. No difference could be detected on hsc70 mRNA level in muscle between heat-shocked and control animals.

The cDNA cloning and mRNA expression of heat shock protein 70 gene in the haemocytes of bay scallop (Argopecten irradians, Lamarck 1819) responding to bacteria challenge and naphthalin stress

Heat shock protein 70 (HSP70) is an important member of the heat shock protein superfamily, and it plays a key role in the process of protecting cells, facilitating the folding of nascent peptides and responding to stress. The cDNA of bay scallop Argopecten irradians HSP70 (designated AIHSP70) was cloned by the techniques of homological cloning and rapid amplification of cDNA end (RACE). The full length of AIHSP70 cDNA was 2651 bp in length, having a 5' untranslated region (UTR) of 96 bp, a 3' UTR of 575 bp, and an open reading frame (ORF) of 1980 bp encoding a polypeptide of 659 amino acids with an estimated molecular mass of 71.80 kDa and an estimated isoelectric point of 5.26. BLAST analysis revealed that the AIHSP70 gene shared high identity with other known HSP70 genes. Three classical HSP signature motifs were detected in AIHSP70 by InterPro, analysis. 3-D structural prediction of AIHSP70 showed that its N terminal ATPase activity domain and,C terminal substrate-binding domain shared high similarity with that in human heat shock protein 70. The results indicated that the AIHSP70 was a member of the heat shock protein 70 family. A semi-quantitive RT-PCR method was used to analyse the expression of AIHSP70 gene after the treatment of naphthalin which is one kind of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) and the challenge of bacteria. mRNA expression of AIHSP70 in scallop was up-regulated significantly after the stimulation of naphthalin and increased with increasing naphthalin concentration. A clearly time-dependent expression pattern of AIHSP70 was observed after the scallops were infected by Vibrio anguillarum, and the mRNA expression reached a maximum level at 8 h and lasted to 16 h, and then dropped progressively. The results indicated that AIHSP70 could play an important role in mediating the environmental stress and immune response in scallop. (c) 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Discovery of the genes in response to white spot syndrome virus (WSSV) infection in Fenneropenaeus chinensis through cDNA microarray

We used microarray technology to study differentially expressed genes in white spot syndrome virus (WSSV)-infected shrimp. A total of 3136 cDNA targets, including 1578 unique genes from a cephalothorax cDNA library and 1536 cDNA clones from reverse and forward suppression subtractive hybridization (SSH) libraries of Fenneropenaeus chinensis, plus 14 negative and 8 blank control clones, were spotted onto a 18 x 18 mm area of NH2-modified glass slides. Gene expression patterns in the cephalothorax of shrimp at 6 h after WSSV injection and moribund shrimp naturally infected by WSSV were analyzed. A total of 105 elements on the arrays showed a similar regulation pattern in artificially infected shrimp and naturally infected moribund shrimp; parts of the results were confirmed by semiquantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). The up-regulated expression of immune-related genes, including heat shock proteins (HSP70 and HSP90), trehalose-phosphate synthase (TPS), ubiquitin C, and so forth, were observed when shrimp were challenged with WSSV. Genes including myosin LC2, ATP synthase A chain, and arginine kinase were found to be down-regulated after WSSV infection. The expression of housekeeping genes such as actin, elongation factor, and tubulin is not stable, and so these genes are not suitable as internal standards for semiquantitative RT-PCR when shrimp are challenged by WSSV. As a substitute, we found that triosephosphate isomerase (TPI) was an ideal candidate of interstandards in this situation.

利用荧光原位杂交技术（FISH）对中国明对虾和栉孔扇贝若干重要基因定位的研究

本研究将荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）技术引入中国明对虾和栉孔扇贝这两种重要的海水养殖动物的染色体研究中，建立了相关技术平台，在染色体上定位了部分功能基因，详述如下： 1. 在中国明对虾和栉孔扇贝中建立了FISH平台，利用单色和双色FISH技术在中国明对虾和栉孔扇贝染色体上成功定位了多拷贝基因，发现5S rDNA定位于中国明对虾的一对同源染色体上，栉孔扇贝18S rDNA和组蛋白序列也各自定位于一对同源染色体上，它们均可以作为染色体特异性探针来鉴别染色体。 2. 在栉孔扇贝中发展了BAC-FISH技术，定位了包含热休克蛋白70（HSP70）、丝氨酸蛋白酶（Serine Protease）和脂多糖葡聚糖结合蛋白（LGBP）等免疫相关基因的BAC克隆，发现它们均定位于一对同源染色体的长臂上。利用双色BAC-FISH技术，发现6个包含栉孔扇贝LGBP基因的BAC克隆在间期细胞核上共定位。对栉孔扇贝5个探针进行了同时定位，初步鉴别了栉孔扇贝5条染色体。 3. 在栉孔扇贝热休克蛋白70（HSP70）、丝氨酸蛋白酶（Serine Protease）和脂多糖葡聚糖结合蛋白（LGBP）等免疫相关基因内部发掘了数个潜在的SNP位点，展示了栉孔扇贝SNP位点的丰富性。这些SNP位点可以用于图谱整合。

皱纹盘鲍热休克蛋白70基因的克隆、表达及应用

热休克蛋白70是热休克蛋白家族中最重要的一类家族成员，它具有“分子伴侣”、细胞保护、抗凋亡以及肿瘤免疫治疗等独特复杂的生物学功能，它的研究已成为生命科学领域研究的热点之一。采用RACE方法从皱纹盘鲍中克隆到一种HSP70基因的全长cDNA序列，该序列与其它物种的HSP70基因高度同源。克隆得到的皱纹盘鲍HSP70基因的全长cDNA序列为2631bp，开放阅读框为1968bp，另外其5'-和3'-非翻译区长度分别是90和573bp，其中3'-非翻译区具有AATAAA mRNA加尾信号及PolyA寡聚腺苷酸。开放阅读框编码655个氨基酸，包含N端包含的382个氨基酸的ATP酶结合域（约45kDa）、由161个氨基酸编码的底物肽结合结构域（18kDa）及112个氨基酸编码的C端结构域（10kDa）。构建了含有皱纹盘鲍HSP70的表达载体，以期得到体外表达的重组热激蛋白70，为制备抗体，通过Western blot杂交或酶联免疫等方法检测HSPs蛋白表达情况作准备。 为了研究皱纹盘鲍HSP70的转录表达，采用半定量RT-PCR方法，对HSP70不同组织及热休克、鳗弧菌感染下的转录表达情况分析。试验结果表明，采用热应激及鳗弧菌处理皱纹盘鲍，均能导致皱纹盘鲍肌肉中HSP70 mRNA转录水平明显增加，并在处理后96 h恢复至正常水平；与肌肉组织不同的是，鳃组织在温度及鳗弧菌处理后12 h后达到最高值，并一直维持相对较高的表达水平。在温度和鳗弧菌处理下，皱纹盘鲍HSP70上调表达表明HSP70的响应没有胁迫特异性，可能参与了皱纹盘鲍的免疫反应。 以皱纹盘鲍近交和杂交群体为材料，研究了不同群体的生长速率和HSP70的表达量的差异。试验结果表明，在较低的处理温度下，皱纹盘鲍近交群体HSP70的表达量高于杂交群体，随着处理温度的升高，在接近致死温度时，杂交群体的HSP70表达量要高于近交群体；不同群体达到最大HSP70表达量时的温度（Tpeak）也不同，近交群体的Tpeak为26C，低于杂交群体（28C）；近交群体的最大HSP70表达量高于杂交群体。以上试验结果表明杂交群体的HSP70的表达变化幅度较近交群体的变化幅度小，具有更宽的温度适应性。可能提供了关于杂交能够缓解皱纹盘鲍内在遗传压力的证据。 用荧光定量PCR方法分析不同壳色皱纹盘鲍在热激胁迫下不同恢复时间和南方与北方越冬的皱纹盘鲍在不同程度温度胁迫下的HSP70变化。在南方与北方越冬的皱纹盘鲍由于其越冬环境的温度明显不同，表现出明显的热响应差异。具体表现如下几个方面：首先，两个群体在非胁迫的正常条件下，其HSP70的初始表达量明显不同。南方越冬群体在其正常生长温度下（16C）的表达量高于北方群体的相应的表达量（12C）；其次，随着热激温度的增高，两个群体HSP70的表达量升高的幅度也不同。第三，两个群体HSP70表达量达到最高值后，随着温度的升高，表达量开始下降，但两个群体的表达量下降幅度也有所不同。结果表明在南方的适用后，体内可能聚集了较多的热休克蛋白，可能更有利于渡过北方的高温季节。

栉孔扇贝与海湾扇贝免疫学比较研究

扇贝是我国重要的海水养殖品种，但自1997年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且直接威胁到现有产业的生存和发展。引起扇贝大规模死亡原因是多方面的，其主要原因是病原滋生、养殖环境恶化和种质衰退。因此，深入研究扇贝免疫防御机制，探讨提高机体抗病力的有效途径和方法，改良种质和培育抗病品系，促进我国扇贝养殖业的健康、可持续发展。本文通过比较栉孔扇贝和海湾扇贝正常状态和重金属污染胁迫下相关免疫指标的变化及HSP70和HSP90在重金属胁迫后表达规律，以期更好的了解贝类的防御机制，为扇贝病害防治提供资料。 本研究采用流式细胞仪技术对栉孔扇贝和海湾扇贝血细胞死亡率、细胞吞噬率和呼吸爆发进行了测定，发现正常状态下两种扇贝的细胞死亡率相差不大，呼吸爆发的基础值相差也不大，而海湾扇贝细胞吞噬率显著高于栉孔扇贝。在血淋巴和肝胰腺中，海湾扇贝SOD、ACP酶活性均显著高于栉孔扇贝；海湾扇贝的MDA含量也高于栉孔扇贝，但差异不显著。鳗弧菌感染实验发现，海湾扇贝累积死亡率远低于栉孔扇贝。上述结果表明，海湾扇贝对细菌等异物的吞噬和杀灭能力以及机体自身的抗氧化能力高于栉孔扇贝，这为海湾扇贝比栉孔扇贝具有更高的抗逆性提供了证据。 不同浓度Pb2+刺激后，海湾扇贝血细胞的死亡率明显低于栉孔扇贝。海湾扇贝细胞吞噬率和呼吸爆发均高于栉孔扇贝。对两种扇贝体液免疫指标的测定发现，海湾扇贝的SOD、ACP活性和MDA含量均高于栉孔扇贝。结果表明，在Pb2+刺激下两种扇贝都处于重金属氧化胁迫下，其免疫系统均受到了影响，但相同剂量的Pb2+对两种扇贝的毒害程度不同，海湾扇贝受到的影响要低于栉孔扇贝。 采用同源克隆和cDNA 末端快速扩增（RACE）技术，从海湾扇贝血淋巴中克隆到了热休克蛋白90（AiHSP90）基因。AiHSP90的cDNA序列全长为2669bp，其中5' 非编码区（UTR）为90bp，3' UTR为44bp，开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）包括2175bp，2524-2528位AATAA为推测的AiHSP90基因的 mRNA 多聚腺苷酸加尾信号（Polyadenylation Signal）。开放阅读框编码724个氨基酸残基，推测的理论分子量为83.08 kDa，等电点为4.81。 利用荧光实时定量PCR 技术检测了AiHSP90基因在革兰氏阴性菌鳗弧菌和革兰氏阳性菌藤黄微球菌感染后不同时间点相对于β-actin基因的表达。在鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后，除72h外AiHSP90均上调表达，在9h其mRNA表达达到最大值，分别约为空白组的6.8倍和3倍；随后随着时间的推移，其表达下降，在48h恢复到接近空白组的水平；到72h时降到最低点。鳗弧菌对AiHSP90的诱导比藤黄微球菌要高，这也反映出鳗弧菌对海湾扇贝有更强的毒力，诱导的HSP90表达也更强。本研究首次揭示出在软体动物中HSP90在细菌感染条件下的表达情况，结果表明海湾扇贝AiHSP90参与了机体对细菌感染的应答。 采用荧光实时定量PCR技术，对栉孔扇贝和海湾扇贝在不同浓度、不同种类重金属胁迫后HSP70和HSP90基因表达规律进行了比较。结果显示，镉和铅对栉孔扇贝处理10天后即诱导HSP70以较高水平表达，20天后镉处理组HSP70恢复到与对照接近的水平，而在铅处理组也呈现出下降的趋势。而海湾扇贝HSP70基因表达与栉孔扇贝恰好相反，处理20天后其HSP70表达才出现较高水平。铜离子处理对诱导两种扇贝HSP70的影响相似，对栉孔扇贝HSP70的诱导强度更大。对于同一种重金属，不同的浓度诱导的HSP70表达也各不相同。而对于HSP90，海湾扇贝在受到三种重金属刺激后HSP90的表达量均高于栉孔扇贝，而且长时间的刺激（20天）诱导了更高的HSP90基因表达。不同的浓度的同一种重金属离子诱导的HSP90表达也各不相同。这些结果表明，在重金属胁迫下HSP70以及HSP90在栉孔扇贝和海湾扇贝中均表现出不同的应答方式。结合前面海湾扇贝抗逆性较强的综合结果，两种扇贝热休克蛋白基因表达的比较提示我们栉孔扇贝HSP70的激烈反应预示着抗逆能力的不足，而海湾扇贝HSP90的高表达却预示着更强的抗逆能力，有待于更多应激实验如热刺激、病原刺激等的进一步验证。

刺参Apostichopus japonicus (Selenka)耐高温品系选育的基础研究

刺参是目前支撑我国海水增养殖业高效、稳定、持续发展的重要物种之一，但该产业面临着种质匮乏、病害严重、养殖环境局部恶化和产品品质难以保证等诸多问题。本文围绕刺参增养殖过程中的种质苗种问题，以培育耐高温品系为研究目标，在评价我国沿海不同地理群体刺参及其子一代在热刺激条件下HSP70基因mRNA表达差异的基础上，以低纬度地理群体为亲本，经温度刺激后比较了幼体及幼参的生长及HSP70 mRNA表达差异，获得了性状优良的耐高温群体。主要研究结果如下： 1、研究了我国沿海刺参不同地理群体在热激后HSP70基因mRNA的表达差异，比较了在不同温度下不同地理群体幼参的生长特性。青岛、日照和养殖等低纬度群体成参HSP70基因mRNA表达变化较大连、长岛等高纬度群体明显；热激后低纬度群体幼参HSP70基因mRNA表达量较高纬度群体高；高温条件下，高纬度群体子一代成活率低生长。温度升高对高纬度群体生长的影响较大。 2、利用荧光实时定量PCR检测了HSP70基因在不同组织、不同温度、不同时间mRNA水平的表达差异。刺参的各组织都有HSP70的mRNA表达，且对热刺激都有应答。自然水温12℃时，在＋12℃温度刺激时刺参的呼吸树中的HSP70 mRNA水平较高；刺参成参、幼参呼吸树中HSP70基因的mRNA水平在热激后6-12h达到最高；低温刺激后HSP70 mRNA下调表达。 3、分别从受精卵和初耳幼体开始在不同温度下进行幼体培育， 27℃以上温度培育的刺参幼体，其生长和成活率显著低于24℃以下温度培育的幼体；不同起始刺激阶段和不同温度都是显著影响因子。从初耳幼体进行高温培育，幼体的变态受到明显影响，26℃以上温度培育幼体的变态率显著低于24℃以下培育温度。 4、以日照刺参为亲本，在26℃培育温度下获得了耐高温群体幼参，并从生长、HSP70mRNA水平的表达差异与常温培育的群体（普通群体）进行了比较。耐高温群体幼参在较高温度下成活率和HSP70mRNA表达水平明显高于普通群体，而二者在特定生长率随温度变化上没有差异。 5、在浙江苍南进行了选择群体耐高温能力和生长验证实验。耐温群体的温度耐受能力提高了0.7℃，进入夏眠时间延后15d左右。耐温刺参群体的特定生长率和成活率在3月温度回升后远高于对照组。

中国明对虾重要分子伴侣蛋白基因的克隆及表达研究

对虾养殖业的可持续发展面临着种质退化、病害严重和养殖环境恶化等问题的严重挑战。养殖环境恶化造成的环境胁迫，不但影响对虾的生长性状，而且导致对虾的抵抗力下降，更容易引发病害的发生。养殖环境恶化已经严重影响了对虾养殖业的健康可持续发展。本论文针对环境恶化造成的环境胁迫对对虾影响的分子机理进行了研究。 克隆了中国明对虾对环境胁迫应答的重要伴侣蛋白基因，包括钙网蛋白（FcCRT）、葡萄糖调节蛋白78 （FcGrp78）、热休克蛋白70（FcHsp70）和热休克蛋白90（FcHsp90）的全长cDNA，研究了这些基因的组织表达特征，并对这些基因在不同胁迫条件下的转录表达特征进行了分析。 钙网蛋白是一种多功能的内质网钙结合蛋白，负责蛋白折叠和糖蛋白修饰。本论文首次在中国明对虾报道了钙网蛋白FcCRT基因的全长cDNA序列，编码406个氨基酸，具有保守的N-，P-和C-功能域，以及信号肽和保守的HDEL内质网回收标签。FcCRT基因与其它物种的钙网蛋白具有高度的相似性，系统进化分析表明，FcCRT在亲缘关系上更接近昆虫的钙网蛋白。Northern blot和原位杂交结果显示，FcCRT基因在中国明对虾各组织中均有表达，且在卵巢中发育早起的卵母细胞中表达量最高，说明FcCRT很可能参与了卵母细胞的成熟。FcCRT基因在不同胁迫条件下，其转录表达均呈现明显的变化。在WSSV感染实验中，中国明对虾肝胰脏和淋巴器官中FcCRT转录表达均明显上调；热休克、重金属处理均可引起FcCRT基因转录表达的变化，但不同重金属处理引起FcCRT转录表达变化的模式不同。铜离子处理6小时，会引起FcCRT基因的下调表达，但在12小时之后出现明显上调；镉离子处理12小时后引起FcCRT基因的下调表达，但在24小时又出现明显的上调表达。 葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是内质网重要的伴侣蛋白。中国明对虾的Grp78基因（FcGrp78）的cDNA全长为2325bp，编码665个氨基酸。FcGrp78具有三个Hsp70蛋白家族标签，并含有KDEL内质网回收标签。FcGrp78基因与中国明对虾已有的Hsc70和Hsp70具有高度相似性。Northern blot杂交结果显示FcGrp78基因在中国明对虾各组织中均有表达。FcGrp78基因在WSSV感染的中国明对虾肝胰脏中呈上调表达，在血细胞中下调表达，说明FcGrp78可能与对虾的免疫应答有关。热休克处理会诱导FcGrp78基因转录的上调。不同重金属离子胁迫引起的FcGrp78转录表达有所不同：铜离子处理可以诱导FcGrp78基因在处理后24小时的上调表达；镉离子的处理导致FcGrp78基因处理后12小时的下调以及处理后24小时的上调表达变化。短期低氧胁迫则抑制对虾FcGrp78基因的转录表达。 本论文报道的中国明对虾FcHsp90基因 cDNA全长2552bp，编码726个氨基酸，具有保守的N端功能域、中间功能域和C端功能域，具有五个保守的Hsp90蛋白家族标签，序列上与其他物种Hsp90相似性高。Real-time RT-PCR结果显示FcHsp90基因在发育的卵巢中表达量较高，说明Hsp90可能参与了对虾卵母细胞成熟过程中的蛋白合成和卵黄蛋白原的分泌。WSSV感染引起中国明对虾肝胰脏的FcHsp90的转录表达明显上调，说明FcHsp90很可能与对虾的免疫相关。热休克处理诱导FcHsp90基因转录表达的迅速上调。铜离子处理也可诱导FcHsp90基因转录的上调表达，而镉离子处理首先引起FcHsp90基因的下调表达，24小时后开始上调。低氧胁迫也会抑制FcHsp90基因在对虾体内的转录表达。 诱导型FcHsp70基因cDNA全长2511bp，编码629个氨基酸，具有三个保守的Hsp70蛋白家族标签和C末端EEVD序列。与其他物种的Hsp70蛋白具有高度的相似性。FcHsp70基因转录表达对于热休克处理和铜离子的处理非常敏感：热休克处理2小时后FcHsp70基因的转录水平是对照组的80倍；铜离子处理12小时FcHsp70基因转录表达达到对照组的15倍。而镉离子处理后没有诱导FcHsp70显著的上调表达。 以上研究结果为阐明对虾对环境胁迫应答的机制奠定了重要基础，并可为抗逆对虾的培育提供依据。

牙鲆免疫系统和抗病力的研究

本文主要以一龄牙鲆为研究对象，研究了牙鲆免疫系统的组成，以初步探讨牙鲆的抗病机制，并为牙鲆生理状况的诊断建立快捷的方法；研究了牙鲆主要消化酶的活性，为牙鲆的营养强化进行基础性的研究；研究了含有大麻哈鱼生长激素基因的重组酵母菌对牙鲆的生长和非特异性免疫能力的影响；同时对牙鲆热激蛋白hsp70的cDNA进行了合成和扩增。本论文共包括四个部分，由十个实验组成，每个实验的研究内容介绍如下：实验1 利用姬姆萨染色技术观察了牙鲆血细胞的显微结构。结果表明，牙鲆的血细胞由红细胞和白细胞组成，两类细胞的显微结构具有明显的差异；红细胞有细胞核，在血细胞的组成中占较高比例；不同种类的白细胞其结构不同，实验中发现了血栓细胞、淋巴细胞、单核细胞；但是只凭借光学显微形态的差异难以对白细胞进行更确切的分类。实验2 利用透射电镜技术对牙鲆外周血细胞的超显微结构进行了观察。牙鲆的血细胞可以分为红细胞和白细胞；白细胞包括淋巴细胞、血栓细胞、单核细胞、粒细胞；粒细胞包含两种类型；实验中还发现了类似巨噬细胞的一类细胞，但未发现浆细胞的存在。实验3 利用区带毛细管电泳技术对牙鲆血清蛋白的组成进行了分析。实验条件下，牙鲆的血清蛋白主要包含三种类型，即P2.59, P1.60, P0.77。三种蛋白的分子量和稳定性各不相同，初步判断这三种蛋白主要为白蛋白、α球蛋白和β球蛋白。实验4和实验5 对溶菌酶和抗蛋白酶物质在假雄牙鲆体内的分布以及不同在组织和器官中的比活性进行了研究。溶菌酶广泛分布于牙鲆的体表粘液、鳃、血清、消化组织和脾、肾等组织中；抗蛋白酶物质广泛分布于体表粘液、鳃、血清、肌肉中。在不同的组织和器官中，这种酶的比活性不完全相同。体表粘液、血清、肝脏、前肠、肾、鳃中溶菌酶的比活性较高；胃、中肠、后肠、脾中溶菌酶的比活性较低；胆汁中溶菌酶的比活性最低。血清和体表粘液中抗蛋白酶物质的比活性较高，鳃和肌肉中抗蛋白酶物质的比活性较低。由实验结果可知，鳃和消化道在牙鲆抵抗病原微生物侵袭的过程中发挥着重要的作用。实验6 对碱性磷酸酶在牙鲆体内不同消化器官中的分布进行了研究。碱性磷酸酶在牙鲆的胃、肝脏、肠中广泛分布。在前肠和中肠部位酶的比活性较其它部位的高。胃中碱性磷酸酶的比活性随季节的不同没有显著变化，而肠和肝脏中酶的比活性随季节的不同具有较显著的变化。实验 7 对牙鲆体内消化酶的比活性进行了研究。在牙鲆的胃、前肠、中肠、后肠中可以检测出蛋白酶、脂肪酶、酶、纤维素酶的活性。胃中的蛋白酶主要为酸性蛋白酶，肠中的蛋白酶主要为碱性蛋白酶。肠中蛋白酶的比活性由前肠向后肠递减，前肠与中肠酶的比活性没有显著差异；牙鲆肠中脂肪酶的比活性较胃中的高，在肠的不同部位脂肪酶的比活性无显著差异；牙鲆前肠中酶的比活性最高，胃中的次之，中肠、后肠中淀粉酶的比活性较低；牙鲆的胃及肠道不同部位处的纤维素酶的比活性没有显著差异。随着牙鲆的生长，蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶的比活性增强，酶的比活性减弱；其中胃和中肠内纤维素酶的比活性增强得较显著。实验8和实验9 研究了重组酵母菌对牙鲆的生长、血清中某些激素的含量、血清蛋白的含量，以及血清中溶菌酶和抗蛋白酶物质的比活性等生理指标的影响。通过投喂重组酵母菌，可以提高牙鲆血清中生长激素的含量，影响牙鲆血清中甲状腺激素和三碘甲状腺原氨酸的含量，促进牙鲆的生长，同时能够增加牙血清蛋白的含量，增强牙鲆血清中溶菌酶和抗蛋白酶物质的比活性。牙鲆体内生长激素含量的增加以及酵母菌细胞壁中的多糖成分都能够增强牙鲆的非特异性免疫能力。实验 10 对牙鲆肝脏中热激蛋白hsp70的cDNA序列进行了合成和PCR扩增。在实验条件下能够合成750bp左右的核酸序列，为进一步利用热激蛋白hsp70作为生理指标来诊断牙鲆的生理状态，以及研究热激蛋白在牙鲆抵抗外界胁迫中所发挥的作用提供了基础。

Heat-shock protein70 gene expression in four hatchery Pacific Abalone Haliotis discus hannai Ino populations using for marker-assisted selection

Heat shock proteins (Hsps) are molecular chaperones that help organisms cope with stressful conditions. Here, we report on the growth rates and Hsp70 expressions in inbred and hybrid populations of abalone Haliotis discus hannai Ino. In abalone, inbred populations expressed more Hsp70 than hybrid populations at all temperatures, except at very high temperatures close to the physiological limit. At benign temperatures, there was a clear trend towards higher Hsp70 expression in inbred than hybrid populations, whereas at higher temperatures, a trend in the opposite direction was observed. The temperature of maximal Hsp70 expression (T-peak) varied with the population type. The T-peak of inbred populations (26 degrees C) was lower than that of the hybrid populations (28 degrees C). The maximal inducible Hsp70 of inbred populations was higher than that of hybrid populations. The results showed a trend towards higher expression in inbred population at a lower temperature. These results provide direct experimental evidence that hybrids can cope with the intrinsic stress even at non-stressful temperatures. The constitutive Hsp70 may therefore be used for marker-assisted selection in a breeding programme.