Clonación del DNAc de una hemolisina de Entamoeba histolytica dependiente de actividad de fosfolipasa A2 por Isaías Balderas-Rentería.

Tesis (Maestría en Ciencias con Especialidad en Microbiología) U.A.N.L.

Isolation of extraintestinal pathogenic Escherichia coli from diarrheic dogs and their antimicrobial resistance profile

From January to December 2006, 92 Escherichia coli isolates from 25 diarrheic dogs were analyzed by screening for the presence of adhesin-encoding genes (pap, sfa, afa), hemolysin and aerobactin genes. Virulence gene frequencies detected in those isolates were: 12% pap, 1% sfa, 10% hemolysin and 6.5% aerobactin. Ten isolates were characterized as extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC) strains; all showed a multidrug resistance phenotype that may represent a reason for concern due the risk of dissemination of antimicrobial resistant genes to the microbiota of human beings.

Occurrence of non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli in dogs with diarrhea

Shiga toxigenic Escherichia coli (STEC) and Attaching and effacing E. coli (AEEC) have been associated with diarrhea illness in dogs. From January to December 2006, 92 E. coli isolates from 25 diarrheic dogs were analyzed, by screening for the presence of Shiga toxin-producing (stx 1 and stx 2) and intimin (eae) genes. Twelve isolates were detected by PCR to harbor the Shiga toxin genes (7 the stx 1 (7.6%); 5 the stx 2 (5.4%); and none both of them). Nine (9.8%) of the E. coli isolates studied were eae positive non Shiga toxin-producing. Thirteen (62.0%) isolates, carrying stx or eae gene, also showed a hemolysin production. The strains with virulence genes were also examined for resistance to 12 antimicrobial agents. Resistances to cephalothin (85.7%), streptomycin (81.0%), amoxicillin (71.4%) and gentamicin (71.4%) were predominantly observed.

Characterization of Vibrio Parahaemolyticus isolated from oysters and mussels in São Paulo, Brazil

Vibrio parahaemolyticus is a marine bacterium, responsible for gastroenteritis in humans. Most of the clinical isolates produce thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) encoded by tdh and trh genes respectively. In this study, twenty-three V. parahaemolyticus, previously isolated from oysters and mussels were analyzed by PCR using specific primers for the 16S rRNA and virulence genes (tdh, trh and tlh) and for resistance to different classes of antibiotics and PFGE. Nineteen isolates were confirmed by PCR as V. parahaemolyticus. The tlh gene was present in 100% of isolates, the tdh gene was identified in two (10.5%) isolates, whereas the gene trh was not detected. Each isolate was resistant to at least one of the nine antimicrobials tested. Additionally, all isolates possessed the blaTEM-116 gene. The presence of this gene in V. parahaemolyticus indicates the possibility of spreading this gene in the environment. Atypical strains of V. parahaemolyticus were also detected in this study.

Terpinen-4-ol: estudo do efeito sinérgico/aditivo, adesão em co-cultura e alteração dos fatores de virulência sobre Candida spp

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Validação de metodologia para deteção de Bacillus cereus em arroz e produtos à base de cereais

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar

Factores de virulencia involucrados en el Síndrome Urémico Hemolítico y desarrollo de estrategias terapéuticas. Factors of virulence involved in the Hemolytic Uremic Syndrome and development of therapeutic strategies.

La alta incidencia del Síndrome Urémico Hemolítico(SUH) en Argentina conjuntamente con la severidad de esta patología en niños, han motivado la investigación de numerosos grupos. Si bien se ha reconocido la participación de apoptósis a nivel renal y de leucocitos, aun no se ha profundizado el posible rol del estrés oxidativo en el daño a estas células y otras que son afectadas durante esta patología, ni la relación con el estímulo de especies reactivas del oxígeno(ERO) y del nitrógeno (ERN). Hipótesis: El daño sufrido por el organismo durante el SUH se debe a más de un factor de virulencia incluyendo la Shiga toxina (Stx) o Vero toxina (VT), los que en conjunto causan injuria oxidativa principalmente en células sanguíneas y renales; siendo más sensibles al estrés los niños con falencias en las defensas antioxidantes, que serían los que derivan a fallas renales severas. Es posible que un tratamiento protector antiestrés oxidativo después de la detección del SUH prevenga el curso hacia el daño renal crónico y otras graves secuelas de éste síndrome. Obj.general: Efectuar aportes al conocimiento y tratamiento del SUH, investigando el mecanismo de acción de los principales factores de virulencia de E.coli Entero Hemorrágica (EHEC), planteando estrategias terapéuticas futuras para contrarrestar el estrés oxidativo que pudiese estar involucrado. Obj.específicos: Investigar si la Stx y/o la hemolisina (Hly) de E.coli estimulan la producción de ERO y ERN en células del huésped, causando oxidación de proteínas y lípidos. Estudiar si la respuesta de los eritrocitos ante injurias oxidativas se podría utilizar como parámetro para detectar mayor susceptibilidad a Stx y Hly. Investigar si las defensas antioxidantes intracelulares y plasmáticas se incrementan con secuestrantes de radicales y antioxidantes naturales; estabilizando el potencial de membrana e impidiendo el incremento de biomarcadores de estrés oxidativo. Esclarecer aspectos que involucran al estrés oxidativo en la acción de antibióticos sobre células sanguíneas, líneas celulares y E.coli en estado planctónico o en biofilms, investigando qué antimicrobianos aumentan la liberación de Stx y Hly. Estudiar sustancias antioxidantes naturales y alimentos que puedan ser aplicados en terapia y prevención del SUH. Mat.y Met.: Se trabajará con cepas de bacterias que fueron obtenidas de pacientes con SUH. Stx y Hly serán purificadas por cromatografía afinidad y de intercambio iónico, respectivamente. Ensayos de quimioluminiscencia serán aplicados para determinar el estímulo de ERO, mientras que ERN se cuantificarán por Griess. Los niveles de marcadores de daño oxidativo se estudiarán para oxidación de lípidos, proteínas y otros productos avanzados de oxidación proteica. Rdos esperados: Se espera encontrar acción estresante de Stx y/o Hly sobre eritrocitos y otras células, así como biomarcadores de oxidación en diferentes macromoléculas sanguíneas. Es probable que exista diferente nivel de defensa contra esta injuria en niños con SUH; de ser así estos pacientes son susceptibles de recaídas y cronicidad en el proceso por falta de niveles adecuados de antioxidantes. Es necesario entonces encontrar terapias a largo plazo que aumenten las defensas contra el estrés oxidativo causado por E.coli u otras noxas con que se enfrente el niño predispuesto. Se cuenta con antecedentes en el laboratorio que indican conveniente una dieta rica en antioxidantes, así como otros probables fármacos en estudio. Importancia del proyecto. Este proyecto permitirá continuar con investigaciones propias que muestran acción estresante de ERO en eritrocitos por parte de cepas causantes de SUH. La continuidad de estos estudios puede representar un avance en la terapia de una patología cada vez más frecuente en Argentina. Los avances que se consigan podrían posibilitar un tratamiento preventivo en niños en general, así como una mejor evolución de los casos que derivan actualmente en diálisis.

Atividades citotóxica e hemolítica em Escherichia coli uropatogênicas

Estudamos 59 Escherichia coli uropatogênicas (ECUP) obtidas de pacientes com infecção urinária e 30 E. coli originárias das fezes de indivíduos normais. Cada amostra originou-se de um paciente ou controle. Verificamos que 44% e 3,3% respectivamente eram hemolíticas em meio sólido segundo a origem. Apenas 15% das ECUP hemolíticas produziram alfa-hemolisina, isoladamente ou em associação com ß-hemolisina. A alfa-hemolisina correspondeu a 92% das amostras com atividade hemolítica. Não encontramos correlação entre títulos de alfa-hemolisina e o sítio de origem das ECUP (infecção alta ou baixa). Em 71% das ECUP e 30% das E. coli fecais detectamos a produção de citotoxina com ação citocida para linhagens celulares epitelióides como Vero, He-La e Hep-2 e pouco ativa para fibroblastos de embrião de galinha. A produção desta citotoxina não apresenta correlação com a síntese de hemolisinas. Não verificamos associação entre títulos citotóxicos e origem das ECUP. Certas características biológicas desta citotoxina como a resposta morfológica que determina nas células, o aumento dos títulos citotóxicos com o tempo, sua atividade citocida irreversível e sua termolabilidade sugerem analogia com a Verotoxina (VT) de E. coli. As células afetadas pela citoxina inicialmente mostram aspecto estrelado, tornam-se arredondadas e finalmente desprendem-se do seu suporte. É sugerido que a produção de citotoxina por E. coli aderidas às mucosas do trato urinário possa contribuir para a agressão ao uroepitélio.

Detecção dos genes codificantes da toxina CDT, e pesquisa de fatores que influenciam na produção de hemolisinas em amostras de Campylobacter jejuni de origem avícola

Resumo: Membros termofílicos do gênero Campylobacter são reconhecidos como importantes enteropatógenos para o ser humano e animais. A grande diversidade ecológica destes micro-organismos em diferentes habitats tais como água, animais e alimentos predispõem ao aparecimento de novos fatores de virulência. Este trabalho teve por objetivo detectar os genes codificantes da Toxina Distensiva Citoletal (CDT) por meio da técnica de PCR, pesquisar a atividade de hemolisinas e a influência de soluções quelantes e de íons nesta atividade. Foram utilizadas 45 amostras de Campylobacter jejuni de origem avícola para pesquisa de atividade hemolítica, cultivadas em Caldo Triptona de Soja (TSB). Após o crescimento bacteriano, as amostras foram semeadas em Ágar tríptico de soja (TSA) contendo 5% de sangue de ovino. Para verificar a influência de agentes quelantes e solução de íons na atividade hemolítica, as amostras de C. jejuni foram cultivadas em TSB contendo separadamente os quelantes EDTA, ácido acético, soluções de íons CaCl2, MgCl2 e FeCl3, em atmosfera de microaerofilia. Quanto à atividade de hemolisina de C. jejuni em placas de TSA - sangue ovino foi possível observar que houve hemólise em 40% das amostras analisadas apenas com caldo TSB. Somente o ácido acético apresentou ação quelante sobre a atividade de hemolisinas em amostras de C. jejuni semeadas em placas de TSA - sangue ovino. Para detecção dos genes cdtA, cdtB e cdtC através da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foram utilizadas 119 amostras de C. jejuni de origem avícola. Foi possível observar que 37,8% possuíam o perfil de genes cdtABC. Os resultados demonstraram em amostras avícolas a presença de cepas de C. jejuni com potencial virulento, devido à presença dos genes da toxina CDT e potencial hemolítico, que apresentou ação reduzida in vitro com ácido acético.

Formação de biofilmes em diferentes materiais utilizados na indústria de processamento de leite

Biofilmes bacterianos na indústria de alimentos freqüentemente são prejudiciais, uma vez que podem abrigar patógenos e deteriorantes que contaminam os produtos. Este trabalho se propôs a avaliar e correlacionar o papel dos fatores de adesão e da hidrofobicidade na formação de biofilmes em diversos materiais. Leite in natura foi aliquotado em tubos contendo corpos de prova constituídos de vidro, polipropileno, aço inoxidável e pano de algodão e incubados em 10 °C e 25 °C. Após 2 h, 5 h e 8 h de contato, as células não aderidas foram removidas da superfície dos materiais, e as aderidas contadas em PCA. Foram isolados e identificados microrganismos dos biofilmes, sendo verificada a produção de cápsula (coloração com vermelho congo), fímbria (hemaglutinação em placa), hemolisinas (ágar sangue) e proteases (ágar leite). As hidrofobicidades celular e dos materiais foram determinadas pelos testes de agregação com sulfato de amônio e do ângulo do raio da gota séssil, respectivamente. Verificou-se a adesão de consórcios formados por E. coli, S. aureus e B. cereus. Os 103 isolados obtidos pertencem, principalmente, a espécies da família Enterobacteriaceae (46) e do gênero Staphylococcus (45). Na produção de fatores de virulência, 50,4% dos isolados produziram cápsula, 48,5% produziram fímbria, 55,3% hemolisina e 20,3% proteases. Dos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos, 86,6% e 84,4% foram positivos para o teste de hidrofobicidade, respectivamente. O aço inoxidável foi o material mais hidrofóbico testado, seguido por polipropileno e vidro. A temperatura de 25 °C e o polipropileno foram os maiores favorecedores de adesão dos consórcios bacterianos.

Papel da localização da carga em determinação dos parâmetros do canal iônico

To aureus α-HL channel, we used the cysteine-scanning mutagenesis technique. Twenty-four mutants were produced from the substitution of a single aminoacid of the primary structure of the α-HL pro this yzed after the incorporation of a mutant channel in planar lipid bilayer membranes. The modified proteins were studied in the absence and presence of watersoluble specific sulphydryl-specific reagents, in order to introduce a strong positive or negative harge at positions of substitution. The introduction of a negative charge in the stem region onverted the selectivity of the channel from weak anionic to more cationic. However, the troduction of a positive charge increased its selectivity to the anion. The degree of these alterations was inversely dependent on the channel radius at the position of the introduced harge (selectivity). As to the asymmetry of the conductance-voltage, the influence of the harge was more complex. The introduction of the negative charge in the stem region (the trans art of the pore) provoked a decrease. The intensity of these alterations depended on the radius, and on the type of free charge at the pore entrance. These results suggest that the free charge at surrounds the pore wall is responsible for the cation-anion selectivity of the channel. The istribution of the charges between the entrances is crucial for determining the asymmetry of e conductance-voltage curves. We hope that these results serve as a model for studies with other nanometric channels, in biological or planar lipid bilayer membranes or in iotechnological applications

Isolation of extraintestinal pathogenic Escherichia coli from diarrheic dogs and their antimicrobial resistance profile

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Freqüência de hemolisinas anti-A e anti-B em doadores de sangue do Hemocentro de Botucatu

O Sistema ABO foi descoberto em 1900 e permanece até hoje como sendo o sistema mais importante dentro da prática transfusional. A transfusão ABO incorreta pode resultar na morte do paciente, com uma reação hemolítica intravascular, seguida de alterações imunológicas e bioquímicas. Os anticorpos ABO estão presentes nos soros dos indivíduos, dirigidos contra os antígenos A e/ou B ausentes nas hemácias. Embora as transfusões com pequenas quantias de plasmas incompatíveis sejam geralmente consideradas uma prática segura, alguns casos de reações hemolíticas por plasma incompatível são encontrados na literatura. Tendo em vista a pequena quantidade de estudos sobre as hemolisinas anti-A e anti-B e a importância desses anticorpos na prática transfusional, objetivamos neste trabalho verificar a freqüência dessas hemolisinas em doadores de sangue do Hemocentro da Unesp de Botucatu. Foram analisadas 600 amostras de soros de doadores do grupo O para presença ou ausência das hemolisinas anti-A e anti-B. Desses doadores, 77 (12,8%) foram classificados como perigosos por apresentarem em seu soro altos títulos de hemolisinas e 523 (87,2%) como não perigosos por apresentarem baixos títulos. No grupo dos doadores perigosos, 45 (58,4%) foram reativos para hemolisina anti-A, 11 (14,2%) reativos para hemolisina anti-B e 21 (27,2%) reativos para ambas. O título de aglutininas superior a 1/100 já considera o doador O como perigoso. Assim, o teste realizado em nossa rotina é suficiente para detecção de altos títulos fazendo com que os pacientes dos outros grupos sangüíneos não corram o risco de reação transfusional se necessitarem de transfusão sangüínea não-isogrupo.

Fatores de virulência em linhagens de Escherichia coli isoladas de mastite bovina

Avaliou-se a ocorrência de fatores de virulência e do sorotipo O157:H7 em 120 linhagens de Escherichia coli, isoladas de 80 casos de mastite clínica bovina e 40 de mastite subclínica. Verificou-se alfa-hemolisina em oito (6,7%) linhagens, isoladas de cinco casos de mastite clínica e três de mastite subclínica e em nenhuma das estirpes detectou-se enteroemolisina. A presença de sideróforos foi encontrada em 11 (9,2%) linhagens, sete de mastite clínica e quatro de subclínica. em duas (1,7%) estirpes isoladas de mastite subclínica, identificou-se enterotoxina STa. Observou-se efeito citopático em células vero compatível com a produção de verotoxina-VT em cinco (4,2%) linhagens, duas de mastite clínica e três subclínicas. em uma (0,8%) linhagem isolada de mastite clínica, detectou-se efeito citopático compatível com o fator necrosante citotóxico. Nenhuma estirpe apresentou-se sorbitol-negativa no MacConkey-sorbitol, tampouco aglutinou com o sorotipo O157:H7. Os antimicrobianos mais efetivos foram polimixina B (97,5%) e norfloxacina (95,8%). Observou-se multi-resistência a dois ou mais antimicrobianos em 24 (20%) estirpes, principalmente com o uso de ampicilina e ceftiofur.

Prevalence of virulence factors in Escherichia coli strains isolated from the genital tract of healthy cows

Determinou-se a prevalência dos genes de virulência expressando fimbrias, produção de hemolisina, colicina e aerobactina em cepas de Escherichia coli obtidas do trato genital de vacas saudáveis que não apresentam sinais clínicos indicativos de infecção. A presença dos genes responsáveis pela expressão de fimbrias (pap, sfa, afa) foi avaliada através de reação em cadeia da polimerase utilizando primers especificos para cada um dos genes, nenhum deles foi detectado em qualquer uma das cepas isoladas. A prevalência dos fatores de virulência foi de 90,4%, 69,8%, 28,5% para colicina, hemolisina e aerobactina, respectivamente. A análise da patogenicidade das cepas do trato genital pode contribuir para o entendimento do comportamento das cepas de E. coli.