Die herstellung von gärungsessig. Gewinnung von essigsäure, milchsäure, buttersäure und zitronensäure durch gärung.

Mode of access: Internet.

Auswahl von Kohlehydraten durch verschiedene Hefen bei der alkoholischen Gärung.

Inaug.-Diss.--Erlangen.

Effects of plant diversity on bioenergy parameters in grassland biomass

Extensive grassland biomass for bioenergy production has long been subject of scientific research. The possibility of combining nature conservation goals with a profitable management while reducing competition with food production has created a strong interest in this topic. However, the botanical composition will play a key role for solid fuel quality of grassland biomass and will have effects on the combustion process by potentially causing corrosion, emission and slagging. On the other hand, botanical composition will affect anaerobic digestibility and thereby the biogas potential. In this thesis aboveground biomass from the Jena-Experiment plots was harvested in 2008 and 2009 and analysed for the most relevant chemical constituents effecting fuel quality and anaerobic digestibility. Regarding combustion, the following parameters were of main focus: higher heating value (HHV), gross energy yield (GE), ash content, ash softening temperature (AST), K, Ca, Mg, N, Cl and S content. For biogas production the following parameters were investigated: substrate specific methane yield (CH4 sub), area specific methane yield (CH4 area), crude fibre (CF), crude protein (CP), crude lipid (CL) and nitrogen-free extract (NfE). Furthermore, an improvement of the fuel quality was investigated through applying the Integrated generation of solid Fuel and Biogas from Biomass (IFBB) procedure. Through the specific setup of the Jena-Experiment it was possible to outline the changes of these parameters along two diversity gradients: (i) species richness (SR; 1 to 60 species) and (ii) functional group (grasses, legumes, small herbs and tall herbs) presence. This was a novel approach on investigating the bioenergy characteristic of extensive grassland biomass and gave detailed insight in the sward-composition¬ - bioenergy relations such as: (i) the most relevant SR effect was the increase of energy yield for both combustion (annual GE increased by 26% from SR8→16 and by 65% from SR8→60) and anaerobic digestion (annual CH4 area increased by 22% from SR8→16 and by 49% from SR8→60) through a strong interaction of SR with biomass yield; (ii) legumes play a key role for the utilization of grassland biomass for energy production as they increase the energy content of the substrate (HHV and CH4 sub) and the energy yield (GE and CH4 area); (iii) combustion is the conversion technique that will yield the highest energy output but requires an improvement of the solid fuel quality in order to reduce the risk of corrosion, emission and slagging related problems. This was achieved through applying the IFBB-procedure, with reductions in ash (by 23%), N (28%), K (85%), Cl (56%) and S (59%) and equal levels of concentrations along the SR gradient.

Identifizierung biogene Amine bildender Bakterien und Einsatz von Enzymen zur Hemmung ihres Wachstums während der Weinbereitung

Mikroorganismen spielen eine wichtige Rolle in der Weinherstellung. Neben ihren positiven Stoffwechselaktivitäten wie die Bildung von Ethanol während der alkoholischen Gärung sind vor allem Bakterien in der Lage, Weinfehler zu verursachen. Einer dieser Weinfehler ist die Produktion von biogenen Aminen. Diese niedermolekularen Stickstoffverbindungen können zu verschiedenen Gesundheitsproblemen wie Bluthochdruck und Migräne führen. Aufgrund von hohen Ethanolgehalten und dem Vorkommen verschiedener biogener Amine kommt es im Wein zu einer Verstärkung dieser physiologischen Effekte. Um die Bildung dieser Verbindungen zu verhindern, ist es von speziellem Interesse, die verantwortlichen Mikroorganismen zu identifizieren und sie in ihrem Wachstum zu hemmen.In einem Teil der Dissertation stand die Isolierung und Identifizierung biogener Amine produzierender Bakterien aus deutschen Jungweinen und Mosten im Vordergrund. Es konnte gezeigt werden, dass hauptsächlich Milchsäurebakterien als potenzielle Produzenten in Frage kommen. Diese Bakteriengruppe war in hohen Titern in nahezu allen Proben vorhanden und stellt somit eine potentielle Gefahr für die Weinbereitung dar. Zur Identifizierung der Isolate wurden verschiedene molekularbiologische Methoden wie specifically amplified DNA polymorphic-PCR (Fingerprintmethode), Multiplex-PCR oder 16S rDNA-Sequenzierung angewandt. Das Screening bezüglich der Bildung von biogenen Aminen erfolgte mit Hilfe einer im Rahmen dieser Arbeit entwickelten hochauflösenden Dünnschichtchromatographie gefolgt von der Quantifizierung mittels HPLC.Zur Wachstumshemmung dieser Schadbakterien wurden zwei Exoenzyme aus Streptomyces albidoflavus B578 isolieren. Diese Enzyme wurden gereinigt und als eine Muramidase und eine Protease identifiziert. Aktivitätstests konnten zeigen, dass diese Enzyme eine hohe lytische Wirkung gegen weinrelevante Mikroorganismen aufweisen. Ebenso war die Aktivität der Enzyme unter Weinbedingungen sehr stabil. Aufgrund dieser Ergebnisse könnten diese Enzyme eine mögliche Alternative zur Zugabe von Lysozym oder Schwefeldioxid sein, welche konventionell in der Weinbereitung ihren Einsatz finden.

Entwicklung und Evaluierung von Methoden zur zeitnahen Identifizierung weinrelevanter Mikroorganismen

Hefen der Gattung Saccharomyces und Milchsäurebakterien sind bei der Weinbereitung von besonderer Bedeutung. Neben der alkoholischen Gärung sind Hefen an der Ausbildung von Aromastoffen beteiligt. Milchsäurebakterien spielen eine Rolle beim biologischen Säureabbau (malolaktische Fermentation), können jedoch aufgrund ihrer Stoffwechseleigenschaft weitere Aromamodifikationen bewirken. Die Zusammensetzung der mikrobiellen Flora zu verschiedenen Zeitpunkten der Weinbereitung hat einen direkten Einfluss auf die Qualität der Weine, welche sich sowohl positiv als auch negativ verändern kann. Daher ist die zuverlässige Identifizierung und Differenzierung verschiedener Mikroorganismen auf Art- aber auch Stamm-Ebene während der Vinifikation von Bedeutung.rnDer erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Differenzierung von Hefearten der Gattung Saccharomyces, welche mit Hilfe konventioneller Methoden nicht eindeutig identifiziert werden können. Unter Verwendung des DNA-Fingerprintverfahrens Specifically Amplified Polymorphic DNA (SAPD)-PCR sowie der Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization-Time-Of-Flight-Mass-Spectrometry (MALDI-TOF-MS) war eine Differenzierung dieser taxonomisch sehr nah verwandten Arten möglich. Weiterhin konnten interspezifische Hybridstämme detektiert werden. In diesem Zusammenhang wurde der Hybridcharakter des Stammes NCYC 3739 (S. cerevisiae x kudriavzevii) entdeckt. Um die Elternspezies eines Hybridstamms zuverlässig zu bestimmen, sind weiterführende Genanalysen notwendig. Hierzu konnte eine Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse verschiedener genetischer Marker erfolgreich herangezogen werden.rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde weiterhin ein Schnellidentifizierungssystem zum Nachweis weinrelevanter Milchsäurebakterien entwickelt. Mit Hilfe der Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Technik konnten artspezifische Primer generiert werden, welche auf der Grundlage charakteristischer Fragmente der SAPD-PCR abgeleitet wurden. Durch die Anwendung dieser Primer in einer Multiplex-PCR-Reaktion war die Detektion verschiedener, einerseits häufig in Wein vorkommender und andererseits potentiell an der Ausbildung von Weinfehlern beteiligter Milchsäurebakterien-Arten möglich. Die ermittelte Nachweisgrenze dieser Methode lag mit 10^4 - 10^5 Zellen/ml im Bereich der Zelltiter, die in Most und Wein anzutreffen sind. Anhand der Untersuchung verschiedener Weinproben von Winzern in Rheinhessen wurde die Praxistauglichkeit dieser Methode demonstriert. rnUm die gesamten Milchsäurebakterien-Population im Verlauf der Weinbereitung zu kontrollieren, kann die Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese herangezogen werden. Hierzu wurden in dieser Arbeit Primer zur Amplifikation eines Teilbereichs des rpoB-Gens abgeleitet, da dieses Gen eine Alternative zur 16S rDNA darstellt. Die DNA-Region erwies sich als geeignet, um zahlreiche weinrelevante Milchsäurebakterien-Arten zu differenzieren. In einigen ersten Versuchen konnte gezeigt werden, dass diese Methode für eine praktische Anwendung in Frage kommt.rnOenococcus oeni ist das wichtigste Milchsäurebakterien während der malolaktischen Fermentation und wird häufig in Form kommerzieller Starterkulturen eingesetzt. Da verschiedene Stämme unterschiedliche Eigenschaften aufweisen können, ist es von Bedeutung, die Identität eines bestimmten Stammes zweifelsfrei feststellen zu können. Anhand der Analyse verschiedener O. oeni-Stämme aus unterschiedlichen Weinbaugebieten konnte gezeigt werden, dass sowohl die nested SAPD-PCR als auch die MALDI-TOF-MS genügend Sensitivität aufweisen, um eine Unterscheidung auf Stamm-Ebene zu ermöglichen, wobei die mittels nSAPD-PCR ermittelten Distanzen der Stämme zueinander mit deren geographischer Herkunft korrelierte.rnDie in der vorliegenden Arbeit entwickelten Methoden können dazu beitragen, den Prozess der Weinherstellung besser zu kontrollieren und so eine hohe Qualität des Endproduktes zu gewährleisten.rn

Understanding of stuck fermentations : investigations on the relationship between the microbial diversity and chemical composition of must

Das Ziel dieser Arbeit war es, mehr Informationen über unkonventionelle Gründe für Gärstockungen zu gewinnen und neue Wege zu finden, diese zu überwinden. Mikrobielle Sukzession und die chemische Zusammensetzung bei der Gärung wurden in zwei aufeinander folgenden Jahren in einem Weingut von der oberen Mosel in Deutschland studiert. Es gab keinen Hinweis darauf, dass die isolierten Bakterienspezies oder chemischen Komponenten von Most und Jungwein an schleppenden oder stockenden Gärungen beteiligt waren. Ferner konnte während dieser Arbeit gezeigt werden, dass Saccharomyces bayanus die dominierende Weinhefe in diesem Weingut war statt der klassischen und bekannten Weinhefe Saccharomyces cerevisiae. Während der Gärstockung konnte ein Dreifach-Hybrid Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces kudriavzevii x Saccharomyces bayanus wachsen, Saccharomyces bayanus ersetzen und die Gärung beenden. Beide isolierten Hefestämme Saccharomyces bayanus Stamm HL 77 und der Dreifach-Hybrid Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces kudriavzevii x Saccharomyces bayanus Stamm HL 78 konnten Glucose und Fructose von Anfang an verwerten und konnten bei niedrigen Temperaturen von 15 °C und in der Abwesenheit von Hefe-verwertbarem Stickstoff in Form von Ammonium wachsen, solange Aminosäuren im Medium vorhanden waren, im Gegensatz zu einer kommerziellen Saccharomyces cerevisiae-Starterkultur. Chemische Untersuchungen ergaben, dass Hefe-verwertbarer Stickstoff in dem kooperierenden Weingut mit einem Maximum von 160 mg/l zu Beginn der Gärung vorhanden war und auf 40 mg/L verringert war nach zwei Wochen. Aus diesem Grund sind beide isolierten Hefestämme interessant als Starterkulturen in diesem Weingut und dies kann neben der niedrigen Temperatur im Keller auch ein Grund sein, warum Saccharomyces cerevisiae nicht die dominierende Weinhefe in diesem Fall ist. Der Dreifach-Hybrid Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces kudriavzevii x Saccharomyces bayanus Stamm HL 78 ist in der Lage, Fructose noch effizienter zu nutzen als Saccharomyces bayanus Stamm HL 77 und ist weniger abhängig von der Aminosäurekonzentration. Dieser Stamm wurde bereits erfolgreich bei diesem Projekt eingesetzt, um eine Gärstockung in dem kooperierenden Weingut zu beheben. Es ist bekannt, dass Saccharomyces-Hybride in der Weinherstellung vorkommen aber ihre Rolle bei der Überwindung von Gärstockungen wurde bisher noch nicht beschrieben. Diese Ergebnisse sind nützlich, um Gärstockungen zu vermeiden oder zu überwinden mit der selektiven Verwendung dieser Hefestämme in verschiedenen Stadien der Gärung. Das kooperierende Weingut, welches im oberen Qualitätssegment platziert ist, hatte jedes Jahr Probleme mit Gärstockungen. Daher ist die Anwendung der Dreifach-Hybriden Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces kudriavzevii x Saccharomyces bayanus Stamm HL 78 eine große Chance, Gärstockungen und finanzielle Verluste ohne kommerzielle Starterkulturen oder andere übliche Praktiken, die zu einer Veränderung des Aromaprofils führen können, zu vermeiden. Die beschriebenen Untersuchungen stellen ein Modell dar, um Gärstockungen auch in anderen Weingütern, die Spontangärungen anwenden, zu überwinden.

Isolierung von Essigsäure-, Propionsäure- und Buttersäure-bildenden Bakterien aus Biogasanlagen

In der vorliegenden Arbeit wurden Essigsäure-, Propionsäure und Buttersäure-bildende Bakterien aus einer thermophilen und drei mesophilen Biogasanlagen sowie aus zwei Hochdruck-Biogas-Laborfermentern isoliert. Die Fermenter waren mit dem nachwachsenden Rohstoff Maissilage, teilweise mit Rinder- oder Schweinegülle und weiteren festen Inputstoffen gefüttert. Für die Isolierung von Säure-bildenden Bakterien wurde ein Mineralsalzmedium verwendet, welchem als Kohlenstoffquelle Na-DL-Laktat, Succinat, Ethanol, Glycerin, Glucose oder eine Aminosäuremischung (Alanin, Serin, Threonin, Glutaminsäure, Methionin und Cystein) hinzugefügt wurde. Hierbei handelt es sich um Substrate, welche beim anaeroben Abbau während der Hydrolyse oder der primären Gärung entstehen können. Die erhaltenen Isolate waren in der Lage, aus diesen Substraten Essigsäure, Propionsäure oder Buttersäure zu bilden. Insgesamt wurden aus den beprobten Anlagen 49 Isolate gewonnen, welche zu den Phyla Firmicutes, Tenericutes oder Thermotogae gehörten. Mit Hilfe von 16S rDNA-Sequenzen konnten die meisten Isolate als Clostridium sporosphaeroides, Defluviitoga tunisiensis und Dendrosporobacter sp. identifiziert werden. Die Bildung von Essigsäure, Propionsäure oder Buttersäure wurde in Kulturen von Isolaten festgestellt, welche als folgende Arten identifiziert wurden: Bacillus thermoamylovorans, Clostridium aminovalericum, Clostridium cochlearium/Clostridium tetani, Clostridium sporosphaeroides, Dendrosporobacter sp., Proteiniborus sp., Selenomonas bovis und Tepidanaerobacter sp. Zwei Isolate, verwandt mit Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, konnten Buttersäure und Milchsäure bilden. In Kulturen von Defluviitoga tunisiensis wurde Essigsäurebildung festgestellt. Ein Vergleich der 16S rDNA-Sequenzen mit Datenbanken und die Ergebnisse der PCR-Amplifikationen mit Isolat-spezifischen Primerpaaren ergaben zusätzlich Hinweise, dass es sich bei einigen Isolaten um neue Arten handeln könnte (z. B. Stamm Tepidanaerobacter sp. AS34, Stamm Proteiniborus sp. ASG1.4, Stamm Dendrosporobacter sp. LG2.4, Stamm Desulfotomaculum sp. EG2.4, Stamm Gallicola sp. SG1.4B und Stamm Acholeplasma sp. ASSH51). Durch die Entwicklung Isolat-spezifischer Primerpaare, abgeleitet von 16S rDNA-Sequenzen der Isolate oder Referenzstämmen, konnten die Isolate in Biogasanlagen detektiert und mittels qPCR quantifiziert werden (hauptsächlich im Bereich zwischen 1000 bis 100000000 Kopien der 16S rDNA/g BGA-Probe). Weiterhin konnten die Isolate mit Hilfe physiologischer Versuche charakterisiert und deren Rolle in der anaeroben Abbaukette diskutiert werden. Die Art Defluviitoga tunisiensis scheint eine große Bedeutung in Biogasanlagen zu spielen. Defluviitoga tunisiensis wurde am häufigsten in Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Arbeit isoliert und konnte auch mit Hilfe des entwickelten Primerpaares in hohen Abundanzen in den beprobten Biogasanlagen detektiert werden (10000 - 100000000 Kopien der 16S rDNA/g BGA-Probe). Die manuelle Annotation des Gesamtgenoms sowie die Substratverwertungsversuche haben gezeigt, dass Defluviitoga tunisiensis ein sehr breites Substratspektrum in der Verwertung von Kohlenhydraten besitzt und dadurch möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Verwertung von Biomasse in Biogasanlagen einnimmt. Mit Hilfe der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten somit neue Einblicke in die zweite Stufe des anaeroben Abbaus, die Acidogenese, in Biogasanlagen gegeben werden. rn

Die Chemie in ihrer Anwendung auf Agricultur und Physiologie

von Justus Liebig

Biomass, quality traits and methane production of extensive grassland: biodiversity effects and sensor approaches

Energy policies around the world are mandating for a progressive increase in renewable energy production. Extensive grassland areas with low productivity and land use limitations have become target areas for sustainable energy production to avoid competition with food production on the limited available arable land resources and minimize further conversion of grassland into intensively managed energy cropping systems or abandonment. However, the high spatio-temporal variability in botanical composition and biochemical parameters is detrimental to reliable assessment of biomass yield and quality regarding anaerobic digestion. In an approach to assess the performance for predicting biomass using a multi-sensor combination including NIRS, ultra-sonic distance measurements and LAI-2000, biweekly sensor measurements were taken on a pure stand of reed canary grass (Phalaris aruninacea), a legume grass mixture and a diversity mixture with thirty-six species in an experimental extensive two cut management system. Different combinations of the sensor response values were used in multiple regression analysis to improve biomass predictions compared to exclusive sensors. Wavelength bands for sensor specific NDVI-type vegetation indices were selected from the hyperspectral data and evaluated for the biomass prediction as exclusive indices and in combination with LAI and ultra-sonic distance measurements. Ultrasonic sward height was the best to predict biomass in single sensor approaches (R² 0.73 – 0.76). The addition of LAI-2000 improved the prediction performance by up to 30% while NIRS barely improved the prediction performance. In an approach to evaluate broad based prediction of biochemical parameters relevant for anaerobic digestion using hyperspectral NIRS, spectroscopic measurements were taken on biomass from the Jena-Experiment plots in 2008 and 2009. Measurements were conducted on different conditions of the biomass including standing sward, hay and silage and different spectroscopic devices to simulate different preparation and measurement conditions along the process chain for biogas production. Best prediction results were acquired for all constituents at laboratory measurement conditions with dried and ground samples on a bench-top NIRS system (RPD > 3) with a coefficient of determination R2 < 0.9. The same biomass was further used in batch fermentation to analyse the impact of species richness and functional group composition on methane yields using whole crop digestion and pressfluid derived by the Integrated generation of solid Fuel and Biogas from Biomass (IFBB) procedure. Although species richness and functional group composition were largely insignificant, the presence of grasses and legumes in the mixtures were most determining factors influencing methane yields in whole crop digestion. High lignocellulose content and a high C/N ratio in grasses may have reduced the digestibility in the first cut material, excess nitrogen may have inhibited methane production in second cut legumes, while batch experiments proved superior specific methane yields of IFBB press fluids and showed that detrimental effects of the parent material were reduced by the technical treatment