Essential role of Glu-C66 for menaquinol oxidation indicates transmembrane electrochemical potential generation by Wolinella succinogenes fumarate reductase

Quinol:fumarate reductase (QFR) is a membrane protein complex that couples the reduction of fumarate to succinate to the oxidation of quinol to quinone, in a reaction opposite to that catalyzed by the related enzyme succinate:quinone reductase (succinate dehydrogenase). In the previously determined structure of QFR from Wolinella succinogenes, the site of fumarate reduction in the flavoprotein subunit A of the enzyme was identified, but the site of menaquinol oxidation was not. In the crystal structure, the acidic residue Glu-66 of the membrane spanning, diheme-containing subunit C lines a cavity that could be occupied by the substrate menaquinol. Here we describe that, after replacement of Glu-C66 with Gln by site-directed mutagenesis, the resulting mutant is unable to grow on fumarate and the purified enzyme lacks quinol oxidation activity. X-ray crystal structure analysis of the Glu-C66 → Gln variant enzyme at 3.1-Å resolution rules out any major structural changes compared with the wild-type enzyme. The oxidation-reduction potentials of the heme groups are not significantly affected. We conclude that Glu-C66 is an essential constituent of the menaquinol oxidation site. Because Glu-C66 is oriented toward a cavity leading to the periplasm, the release of two protons on menaquinol oxidation is expected to occur to the periplasm, whereas the uptake of two protons on fumarate reduction occurs from the cytoplasm. Thus our results indicate that the reaction catalyzed by W. succinogenes QFR generates a transmembrane electrochemical potential.

Mitochondrial bioenergetics and redox state are unaltered in Trypanosoma cruzi isolates with compromised mitochondrial complex I subunit genes

In trypanosomatids the involvement of mitochondrial complex I in NADH oxidation has long been debated. Here, we took advantage of natural Trypanosoma cruzi mutants which present conspicuous deletions in ND4, ND5 and ND7 genes coding for complex I subunits to further investigate its functionality. Mitochondrial bioenergetics of wild type and complex I mutants showed no significant differences in oxygen consumption or respiratory control ratios in the presence of NADH-linked substrates or FADH(2)-generating succinate. No correlation could be established between mitochondrial membrane potentials and ND deletions. Since release of reactive oxygen species occurs at complex I, we measured mitochondrial H(2)O(2) formation induced by different substrates. Significant differences not associated to ND deletions were observed among the parasite isolates, demonstrating that these mutations are not important for the control of oxidant production. Our data support the notion that complex I has a limited function in T. cruzi.

The contribution of genes required for anaerobic respiration to the virulence of Salmonella enterica serovar Gallinarum for chickens

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Participation of genes involved in the process of anaerobic respiration of infection in chickens by salmonella typhimurium

Intestinal pathogens are exposed to various stress conditions during their infectious cycle. Anaerobiosis, one of such hostile condition, is offered by the host within gut and intestinal lumen, where survival, multiplication and entry into intestinal epithelial cells are priority for the invasion of the pathogen. The fumarate reductase (frdABCD), dimethyl sulfoxide (DMSO)-trimethylamine N-oxide (TMAO) reductase (dmsABC), and nitrate reductase (narGHIJ) operons in Salmonella Typhimurium (STM) encode enzymes involved in anaerobic respiration to the electron acceptors fumarate, DMSO, TMAO, and nitrate, respectively. They are regulated in response to nitrate and oxygen availability and changes in cell growth rate. Vitamin B12 (cobalamin) is synthesized by Salmonella Typhimurium only under anaerobic growth conditions used as a cofactor in four known reactions. The deletion of cobS and cbiA genes prevent any form of cobalamin production. In the present study we evaluate the infection of birds by mutants of STM, with the anaerobic respiratory system committed by mutations in the genes: narG, napA, cobS, cbiA, frdA, dmsA, and torC. Virulence was assessed by oral inoculation of groups of one-day-old broilers with 0.1 mL of culture contained 10 8 colony forming units (CFU)/mL or diluted at 10 -3 and 10 -2 of strains mutants of Salmonella Typhimurium. Clinical signs and mortality were recorded over a period of 21 days. In general, the symptoms of chickens infected with the mutant strains were similar to those presenting by control birds. Except for STMNalr cbiA, all showed reduced capacity to cause mortality in comparison with the original strain. The mortality of group of chickens infected with STMNal r △narG, STMNal r △frdA, STMNal r △dmsA and STMNal r △cobS△cbiA showed significant decrease in mortality compared to control group (p<0.05).

Participação de genes associados ao processo de respiração anaeróbica na infecção de aves por Salmonella Typhimurium

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Rekonstitution des Fumaratsensors DcuS in Liposomen und Transport von Fumarat und Succinat in Escherichia coli

Das Zweikomponentenregulationssystem DcuSR kontrolliert die Expression der wichtigsten fumaratinduzierten Gene in Escherichia coli. Die Gene dcuB und dctA, die fürDicarboxylatcarrier kodieren, sowie das Fumaratreduktase-Operon (frd), sind Zielgene für DcuSR. DcuS ist eine membranständige Sensorkinase mit einer großen periplasmatischen Domäne. NMR-spektroskopische Untersuchungen dieser Domäne zeigen Alpha-Helices und Beta-Faltblätter. Für die Fumaratbindung wichtige Aminosäuren wurden durch Mutagenese identifiziert. Gereinigtes DcuS wurde in Liposomen rekonstituiert. In Anwesenheit von ATP wird DcuS autophosphoryliert. Der Phosphatrest kann dann auf DcuR übertragen werden und beweist somit die Aktivität dieses in vitro Testsystems.Der Transport von C4-Dicarboxylaten erfolgt unter anaeroben Bedingungen durch die sekundären Carrier DcuA, DcuB und DcuC. Es konnte ein weiteres Protein (DcuD) identifiziert werden, das hohe Sequenzähnlichkeit zu DcuC aufweist. Eine dcuD-Mutante zeigte keinen Phänotyp und überproduziertes DcuD konnte den Ausfall der anderen Dcu-Carrier nicht kompensieren. DcuD ist damit ein kryptisches Mitglied der Dcu-Carrierfamilie. Unter aeroben Bedingungen katalysiert DctA den Transport von C4-Dicarboxylaten. Dennoch können dctA-Mutanten noch mit Succinat wachsen. Die Diffusionsrate von Succinat durch Membranen wurde bestimmt. Sie ist um Größenordnungen niedriger als der Transport in der Mutante. Bei dem DctA unabhängigen Transportsystem handelt es sich um einen H+/Succinat2-Symporter, der bei saurem pH aktiv ist und viele Eigenschaften eines Monocarboxylatcarriers aufweist.

Der Carrier DcuB als zweiter Sensor des Zweikomponentensystems DcuSR in Escherichia coli

Escherichia coli kann C4-Dicarboxylate und andere Carbonsäuren als Substrate für den aeroben und anaeroben Stoffwechsel nutzen. Die Anwesenheit von C4-Dicarboxylaten im Außenmedium wird über das Zweikomponentensystem DcuSR, bestehend aus der membranständigen Sensorkinase DcuS und dem cytoplasmatischen Responseregulator DcuR, erkannt. Die Bindung von C4-Dicarboxylaten an die periplasmatische Domäne von DcuS führt zu einer Induktion der Zielgene. Hierzu zählen die Gene für den anaeroben Fumarat/Succinat-Antiporter DcuB (dcuB), die anaerobe Fumarase (fumB) und die Fumaratreduktase (frdABCD). Unter aeroben Bedingungen stimuliert DcuSR die Expression des dctA Gens, das für den aeroben C4-Dicarboxylat-Carrier DctA kodiert. Für den Carrier DcuB konnte eine regulatorische Funktion bei der Expression der DcuSR-regulierten Gene gezeigt werden. Die Inaktivierung des dcuB Gens führte bereits ohne Fumarat zu einer maximalen Expression einer dcuB´-´lacZ Reportergenfusion und anderer DcuSR-abhängiger Gene. Diese Stimulierung erfolgte nur in einem dcuS-positiven Hintergrund. DcuB unterscheidet sich damit von den alternativen Carriern DcuA und DcuC, die diesen Effekt nicht zeigten. Mithilfe ungerichteter Mutagenese wurden DcuB-Punktmutanten hergestellt (Thr394Ile und Asp398Asn), die eine Geninduktion verursachten, aber eine intakte Transportfunktion besaßen. Dies zeigt, dass der regulatorische Effekt von DcuB unabhängig von dessen Transportfunktion ist. Durch gerichtete Mutagenese wurde die Funktion einer Punktmutation (Thr394) näher charakterisiert. Es werden zwei Modelle zur Membrantopologie von DcuB und der Lage der Punktmutationen im Protein vorgestellt. Da DcuB seine regulatorische Funktion über eine Interaktion mit DcuS vermitteln könnte, wurden mögliche Wechselwirkungen zwischen DcuB und DcuS als auch DcuR mithilfe von Two-Hybrid-Systemen untersucht. Für biochemische Untersuchungen von DcuB wurde außerdem die Expression des Proteins in vivo und in vitro versucht. Unter aeroben Bedingungen beeinflusst der C4-Dicarboxylat-Carrier DctA die Expression der DcuSR-abhängigen Gene. Eine Mutation des dctA Gens bewirkte eine stärkere Expression einer dctA´-´lacZ Reportergenfusion im Vergleich zum Wildtyp. Diese Expression nahm in einem dcuS-negativen Hintergrund ab, die Succinat-abhängige Induktion blieb jedoch erhalten. Unter anaeroben Bedingungen kann das dctA Gen auch durch Inaktivierung von DcuB induziert werden. Es wird ein Modell vorgestellt, das die Beteiligung beider Carrier an der DcuSR-abhängigen Regulation erklärt.

The C-4-Dicarboxylate carriers DcuB and DctA of Escherichia coli: function as cosensors and topology

Das fakultativ anaerobe Enterobakterium Escherichia coli nutzt C4-Dicarboxylate sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die Aufnahme der C4-Dicarboxylaten und die Energiekonservierung mittels Fumaratatmung wird durch das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert. Die Sensorhistidinkinase DcuS und der nachgeschaltete Responseregulator DcuR aktivieren bei Verfügbarkeit von C4-Dicarboxylaten die Expression der Gene für den Succinat Transporter DctA, den anaeroben Fumarat/Succinat Antiporter DcuB, die Fumarase B sowie die Fumaratreduktase FrdABCD. Die Transportproteine DctA und DcuB wiederum regulieren die Expression der DcuSR-abhängigen Gene negativ. Fehlen von DctA oder DcuB resultiert bereits ohne Effektor in einer maximalen Expression von dctA bzw. dcuB. Durch gerichtete und ungerichtete Mutagenese wurde gezeigt, dass die Transportfunktion des Carriers DcuB unabhängig von seiner regulatorischen Funktion ist. DcuB kann daher als Cosensor des DcuSR Systems angesehen werden.rnUnter Verwendung von Reportergenfusionen von C-terminal verkürzten Konstrukten von DcuB mit der Alkalischen Phosphatase und der β-Galactosidase wurde die Topologie des Multitransmembranproteins DcuB bestimmt. Zusätzlich wurde die Zugänglichkeit bestimmter Aminosäurereste durch chemische Modifikation mit membran-durchlässigen und membran-undurchlässigen Thiolreagenzien untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse deuten auf die Existenz eines tief in die Membran reichenden, hydrophilen Kanal hin, welcher zum Periplasma hin geöffnet ist. Mit Hilfe der Topologie-Studien, des Hydropathie-Blots und der Sekundärstruktur-Vorhersage wurde ein Modell des Carriers erstellt. DcuB besitzt kurze, periplasmatisch liegende Proteinenden, die durch 12 Transmembranhelices und zwei große hydrophile Schleifen jeweils zwischen TM VII/VIII und TM XI/XII verbunden sind. Die regulatorisch relevanten Reste K353, T396 und D398 befinden sich innerhalb von TM XI sowie auf der angrenzenden cytoplasmatischen Schleife XI-XII. Unter Berücksichtigung der strukturellen und funktionellen Aspekte wurde ein Regulationsmodell erstellt, welches die gemeinsam durch DcuB und DcuS kontrollierte C4-Dicarboxylat-abhängige Genexpression darstellt. rnDer Effekt von DctA und DcuSR auf die Expression einer dctA´-´lacZ Reportergenfusion und auf die aerobe C4-Dicarboxylat-Aufnahme wurde untersucht. In-vivo FRET-Messungen weisen auf eine direkte Wechselwirkung zwischen dem Carrier DctA und dem Sensor DcuS hin. Dieses Ergebnis stützt die Theorie der Regulation von DcuS durch C4-Dicarboxylate und durch die Cosensoren DctA bzw. DcuB mittels direkter Protein-Protein Interaktion.rn

Funktion der C 4-Dicarboxylat-Transporter DctA und DcuB als Co-Sensoren von DcuS in Escherichia coli

Escherichia coli kann C4-Dicarboxylate sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen zur Energiekonservierung nutzen. Die Synthese der beteiligten Transporter und Enzyme wird auf der Transkriptionsebene durch das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert. DcuS ist der Sensor für C4-Dicarboxylate. Der Antwortregulator DcuR wird von DcuS aktiviert und induziert die Expression des C4-Dicarboxylat-Transporters DctA unter aeroben Verhältnissen. Anaerob verstärkt DcuSR die Expression des Fumarat/Succinat-Antiporters DcuB, der Fumarase B und der Fumaratreduktase FrdABCD. DctA und DcuB agieren als Co-Sensoren von DcuS und üben einen negativen Effekt auf die Genexpression von dctA bzw. dcuB aus.rnIn dieser Arbeit wurde die Funktion von DctA und DcuB als Co-Sensoren von DcuS untersucht. Sowohl für DcuB als auch für DctA wurde eine direkte Protein-Protein-Interaktion mit DcuS über ein bakterielles Two-Hybrid System nachgewiesen. DcuS bildete ein Transporter-Sensor-Cluster mit DctA und DcuB. C-terminale Verkürzung und die Mutagenese einzelner Aminosäuren der C-terminalen Helix 8b von DctA führten zu einem Verlust der Interaktion mit DcuS. Mit dieser Interaktion gingen sowohl die regulatorische Funktion als auch die Transportfunktion der Punktmutante DctA-L414A verloren. Ein Verlust der Interaktion wurde ebenfalls zwischen einer konstitutiv aktiven DcuS-Mutante und wildtypischem DctA beobachtet. Ebenso zeigte sich eine partielle Reduktion der Interaktion von DcuS mit DctA, wenn DcuS nach der zweiten Transmembranhelix verkürzt wurde. Die Interaktion zwischen DcuS und DctA wurde durch den Effektor Fumarat modifiziert, ging aber nicht komplett verloren.rnDctA konnte in verschiedenen Plasmidsystemen überproduziert werden und bildete Homotrimere. Die Topologie von DctA wurde mit experimentellen und in silico Methoden aufgeklärt. DctA ähnelt der Struktur und Topologie des Aminosäuretransporters Glt aus Pyrococcus horikoshii. DctA besitzt acht Transmembranhelices mit einem cytosolischen N- und C-Terminus sowie zwei Haarnadelschleifen. Die Substratbindung findet höchstwahrscheinlich in den Haarnadelschleifen statt und der Transport erfolgt nach dem „alternating access“ Modell.rnAußerdem wurde die Funktion des Transporters YfcC untersucht. Das Gen yfcC wurde mit Schlüsselgenen des Acetatstoffwechsels co-transkribiert. In yfcC-Deletionsstämmen zeigte sich ein stammspezifischer Defekt bei Wachstum mit Acetat und Transport von Acetat.

Fumarate hydratase isoforms of Leishmania major: Subcellular localization, structural and kinetic properties

Fumarate hydratases (FHs; EC 4.2.1.2) are enzymes that catalyze the reversible hydration of fumarate to S-malate. Parasitic protists that belong to the genus Leishmania and are responsible for a complex of vector-borne diseases named leishmaniases possess two genes that encode distinct putative FH enzymes. Genome sequence analysis of Leishmania major Friedlin reveals the existence of genes LmjF24.0320 and LmjF29.1960 encoding the putative enzymes LmFH-1 and LmFH-2, respectively. In the present work, the FH activity of both L. major enzymes has been confirmed. Circular dichroism studies suggest important differences in terms of secondary structure content when comparing LmFH isoforms and even larger differences when comparing them to the homologous human enzyme. CD melting experiments revealed that both LmFH isoforms are thermolabile enzymes. The catalytic efficiency under aerobic and anaerobic environments suggests that they are both highly sensitive to oxidation and damaged by oxygen. Intracellular localization studies located LmFH-1 in the mitochondrion, whereas LmFH-2 was found predominantly in the cytosol with possibly also some in glycosomes. The high degree of sequence conservation in different Leishmania species, together with the relevance of FH activity for the energy metabolism in these parasites suggest that FHs might be exploited as targets for broad-spectrum antileishmanial drugs. (c) 2012 Elsevier B.V. All rights reserved.

Long-term Efficacy And Safety Of Tenofovir Disoproxil Fumarate In Hiv-1-infected Adolescents Failing Antiretroviral Therapy: The Final Results Of Study Gs-us-104-0321.

Reports of long-term tenofovir disoproxil fumarate (TDF) treatment in HIV-infected adolescents are limited. We present final results from the open-label (OL) TDF extension following the randomized, placebo (PBO)-controlled, double-blind phase of GS-US-104-0321 (Study 321). HIV-infected 12- to 17-year-olds treated with TDF 300 mg or PBO with an optimized background regimen (OBR) for 24-48 weeks subsequently received OL TDF plus OBR in a single arm study extension. HIV-1 RNA and safety, including bone mineral density (BMD), was assessed in all TDF recipients. Eighty-one subjects received TDF (median duration 96 weeks). No subject died or discontinued OL TDF for safety/tolerability. At week 144, proportions with HIV-1 RNA <50 copies/mL were 30.4% (7 of 23 subjects with baseline HIV-1 RNA >1000 c/mL initially randomized to TDF), 41.7% (5 of 12 subjects with HIV-1 RNA <1000 c/mL who switched PBO to TDF) and 0% (0 of 2 subjects failed randomized PBO plus OBR with HIV-1 RNA >1000 c/mL and switched PBO to TDF). Viral resistance to TDF occurred in 1 subject. At week 144, median decrease in estimated glomerular filtration rate was 38.1 mL/min/1.73 m (n = 25). Increases in median spine (+12.70%, n = 26) and total body less head BMD (+4.32%, n = 26) and height-age adjusted Z-scores (n = 21; +0.457 for spine, +0.152 for total body less head) were observed at week 144. Five of 81 subjects (6%) had persistent >4% BMD decreases from baseline. Some subjects had virologic responses to TDF plus OBR, and TDF resistance was rare. TDF was well tolerated and can be considered for treatment of HIV-infected adolescents.

Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T polymorphism and high plasma homocysteine in chronic hepatitis C (CHC) infected patients from the Northeast of Brazil

Background/Aim: Hyperhomocysteinemia due to Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) gene, in particular the C677T (Ala222Val) polymorphism were recently associated to steatosis and fibrosis. We analyzed the frequency of MTHFR gene in a cross-sectional study of patients affected by Chronic Hepatitis C (CHC) from Northeast of Brazil. Method: One hundred seven-four untreated patients with CHC were genotyped for the C677T MTHFR. Genomic DNA was extracted from peripheral blood cells and the C677T MTHFR polymorphism was identified by PCR-RFLP. The homocysteine (Hcy) levels were determined by chemiluminescence method. All patients were negative for markers of Wilson's disease, hemochromatosis and autoimmune diseases and have current and past daily alcohol intake less than 100 g/week. Results: Among subjects infected with CHC genotype non-1 the frequency of MTHFR genotypes TT was 9.8% versus 4.4% genotype 1 (p = 0.01). Nevertheless, association was found between the MTHFR genotype TT x CT/CC polymorphism and the degree of steatosis and fibrosis in both hepatitis C genotype (p < 0.05). A significant difference was found on plasma Hcy levels in patients with steatosis regardless of HCV genotype (p = 0.03). Conclusion: Our results indicate that plasma Hcy levels is highly prevalent in subjects with chronic hepatits C with steatosis regardless of HCV genotype and vitamin deficiency. The presence of genotype TT of MTHFR C677T polymorphism was more common in CHC genotype non-1 infected patient regardless of histopathological classification and genotype TT+CT frequencies were significant in the presence of fibrosis grade 1+2 and of steatosis in CHC infected patients from the northeast of Brazil regardless of HCV genotype. The genetic susceptibility of MTHFR C677T polymorphism should be confirmed in a large population.

Imidazolium fumarate

In the title compound, C(3)H(5)N(2)(+)center dot C(4)H(3)O(4)(-), the dihedral angle between the imidazolium ring and the plane formed by the fumarate anion is 80.98 (6)degrees. In the crystal structure, intermolecular O-H center dot center dot center dot O and N-H center dot center dot center dot O hydrogen bonds form extended chains along [100] and [01 (1) over bar], creating a two-dimensional network.

Profiles of xylose reductase, xylitol dehydrogenase and xylitol production under different oxygen transfer volumetric coefficient values

BACKGROUND: Xylitol is a sugar alcohol (polyalcohol) with many interesting properties for pharmaceutical and food products. It is currently produced by a chemical process, which has some disadvantages such as high energy requirement. Therefore microbiological production of xylitol has been studied as an alternative, but its viability is dependent on optimisation of the fermentation variables. Among these, aeration is fundamental, because xylitol is produced only under adequate oxygen availability. In most experiments with xylitol-producing yeasts, low oxygen transfer volumetric coefficient (K(L)a) values are used to maintain microaerobic conditions. However, in the present study the use of relatively high K(L)a values resulted in high xylitol production. The effect of aeration was also evaluated via the profiles of xylose reductase (XR) and xylitol clehydrogenase (XD) activities during the experiments. RESULTS: The highest XR specific activity (1.45 +/- 0.21 U mg(protein)(-1)) was achieved during the experiment with the lowest K(L)a value (12 h(-1)), while the highest XD specific activity (0.19 +/- 0.03 U mg(protein)(-1)) was observed with a K(L)a value of 25 h(-1). Xylitol production was enhanced when K(L)a was increased from 12 to 50 h(-1), which resulted in the best condition observed, corresponding to a xylitol volumetric productivity of 1.50 +/- 0.08 g(xylitol) L(-1) h(-1) and an efficiency of 71 +/- 6.0%. CONCLUSION: The results showed that the enzyme activities during xylitol bioproduction depend greatly on the initial KLa value (oxygen availability). This finding supplies important information for further studies in molecular biology and genetic engineering aimed at improving xylitol bioproduction. (C) 2008 Society of Chemical Industry

A study of cell disruption of Candida mogii by glass bead mill for the recovery of xylose reductase

The release of xylose reductase (XR) from Candida mogii by cell disruption in a glass beads mill was studied using an experimental design. Statistical analysis of the results indicated that XR volumetric activity increases by using lower glass beads diameter and cell concentration, and by increasing the number of agitation pulses. Based on results attained in experimental design, assays were carried out aiming at the maximization of XR release. Under optimized conditions (300 mu m glass beads, 45 g/l of cell concentration and 50 pulses), the XR volumetric activity reach 0.683 U/ml. Disruption with glass beads showed to be the most efficient method for XR release when compared to sonication process. The highest specific activity (0.175 U/mg of protein) was found in extracts obtained by suspension freezing and thawing, which suggests that this method can be used as a selective process of cell disruption for XR release. (c) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.