Efeito da inoculação do fitoplasma do enfezamento sobre o desenvolvimento e produção de híbridos de milho

O efeito isolado do fitoplasma sobre o desenvolvimento e a produção de dez híbridos de milho (Zea mays) foi avaliado em condições controladas. Plantas com dez dias de idade foram experimentalmente inoculadas através de dez insetos infetivos de Dalbulus maidis por planta. Plantas infetadas foram comparadas com plantas livres de fitoplasma quanto à sintomatologia e à alteração de alguns componentes de produção. As plantas infetadas exibiram avermelhamento foliar, proliferação de espigas anormais e enfezamento em maior ou menor grau, em função de cada híbrido. Para os híbridos mais suscetíveis, além da grande proporção de grãos miúdos, foram constatadas redução de até 35% na altura de plantas, 98% na produção de grãos, 72% no tamanho de espigas, 50% no número de fileiras/espiga, 98% no número de grãos/espiga e 18% na germinação de sementes.

Proliferação de ramos em plantas comerciais de bico-de-papagaio associada a fitoplasma do grupo 16srIII

Bico-de-papagaio é uma espécie ornamental, encontrada tanto na forma de arbustos, presente em jardins residenciais e públicos, como comercializada em vasos para decoração de interiores. Com o objetivo de detectar a presença de fitoplasma em plantas mostrando sintomas de proliferação de ramos, amostras foram obtidas de plantas sintomáticas e assintomáticas cultivadas em jardins e de plantas comerciais sintomáticas envasadas. A técnica de duplo PCR, utilizando os iniciadores R16mF2/mR1 e R16F2n/R2, foi empregada para detecção do fitoplasma, a partir de DNA extraído de folhas. Fitoplasma foi detectado consistentemente em todas as amostras sintomáticas, porém não houve detecção em qualquer das amostras assintomáticas. A identificação molecular conduzida através de PCR com iniciadores específicos e por análise de RFLP revelou que o fitoplasma detectado pertence ao grupo 16SrIII. Assim, foi demonstrado que a ocorrência de proliferação de ramos em bico-de-papagaio está associada à presença de fitoplasma. Plantas superbrotadas apresentam um dossel mais compacto, sendo mais atrativas ao consumidor, portanto a presença do fitoplasma é considerada como benéfica para fins ornamentais e comerciais.

Evidência molecular da ocorrência de um fitoplasma associado ao lenho mole da macieira

O lenho mole da macieira é uma doença relevante em diversas partes do mundo. Sintomas típicos desta doença têm sido observados em pomares instalados em estados do sul do território brasileiro desde a década de oitenta. Enxertia tem revelado a natureza infecciosa da doença e a observação de corpúsculos filamentosos no floema tem evidenciado possível associação com fitoplasma. No presente trabalho plantas com sintomas de lenho mole foram coletadas em pomar comercial, visando demonstrar a presença de fitoplasma em tecido doente, bem como identificar molecularmente este fitoplasma. Através do emprego de duplo PCR com iniciadores universais R16mF2/R1 e R16F2n/R2, fitoplasma foi consistentemente detectado em plantas sintomáticas. A identificação conduzida com duplo PCR usando-se iniciadores específicos R16(III)F2/R demonstrou que o fitoplasma detectado pertencia ao grupo 16SrIII. Análises de RFLP conduzidas com as endonucleases AluI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e SauIIIA confirmaram que o fitoplasma era um representante típico do grupo 16SrIII. A detecção e identificação molecular se constitui numa forte evidência que um fitoplasma está associado ao lenho mole da macieira no Brasil, complementando os trabalhos realizados anteriormente com transmissão por enxertia e observação por microscopia eletrônica .

Etiología de enfermedades asociadas al decaimiento del peral. Mejora de técnicas de detección de fitoplasmas

El fitoplasma causante de la enfermedad del decaimiento del peral o Pear decline (PD) había sido descrito en nuestro país, pero se desconocía la incidencia real del patógeno, ya que las sintomatologías observadas se confundían a menudo con otros patógenos o con posibles desordenes fisiológicos. Se propuso realizar un estudio conducente a discernir la presencia del PD de otros agentes afines, así como determinar su incidencia y distribución por variedades y patrones en el área frutícola de Cataluña y Cuenca del Ebro. Así mismo, para un adecuado control de la enfermedad era necesario conocer cuales eran las especies de insectos vectores de la enfermedad en la zona y conocer si existía un único aislado del fitoplasma o por el contrario existía variabilidad genética del mismo. Se desconocía si la distinta expresión de síntomas observada era debida a variabilidad genética del fitoplasma o a una respuesta varietal. En el momento de iniciarse el proyecto únicamente dos especies del género Cacopsylla habían sido identificadas como vectores de la enfermedad C. pyricola y C. pyrisuga, aunque se sospechaba que C. pyri también era probablemente vector de la enfermedad, ya que era la especie más abundante en los países mediterráneos y se habían identificado individuos de esta especie portadores del fitoplasma. Por otro lado, la dificultad de diagnosticar las enfermedades producidas por fitoplasmas era también uno de los principales problemas para su control. La técnica de la PCR aunque era la más sensible, resultaba poco asequible para la aplicación rutinaria en empresas o para la certificación de material vegetal. Los principales problemas eran debidos a la complejidad del proceso de extracción del ADN, especialmente en leñosas y muy especialmente en peral, donde la presencia de inhibidores interfiere a menudo en el desarrollo de la PCR. Por estos motivos se planteó la mejora de las técnicas de detección para este fitoplasma y la puesta a punto de modificaciones que simplificaran la técnica de la PCR y permitieran su utilización de forma más rutinaria. Otro punto importante para la detección precoz de la enfermedad era conocer la distribución y concentración del fitoplasma en los distintos estadios fenológicos del árbol y en los distintos tejidos u órganos, con el fin de determinar el mejor momento para realizar la detección. Otra finalidad de este objetivo era determinar en que épocas del año podía propagarse la enfermedad a través de la multiplicación vegetativa, ya que se creía que el fitoplasma descendía a las raíces durante el invierno y por tanto las yemas tomadas durante este período estaban libres del mismo. También se planteó un estudio para determinar la correlación entre la detección del fitoplasma y la expresión de síntomas, ya que la detección del fitoplasma en plantas asintomáticas es esencial en los procesos de propagación vegetativa y de certificación del material vegetal obtenido.

Multilocus sequence analysis reveals the genetic diversity of European fruit tree phytoplasmas and supports the existence of inter-species recombination

The genetic diversity of three temperate fruit tree phytoplasmas ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, ‘Ca. P. mali’ and ‘Ca. P. pyri’ has been established by multilocus sequence analysis. Among the four genetic loci used, the genes imp and aceF distinguished 30 and 24 genotypes, respectively, and showed the highest variability. Percentage of substitution for imp ranged from 50 to 68% according to species. Percentage of substitution varied between 9 and 12% for aceF, whereas it was between 5 and 6% for pnp and secY. In the case of ‘Ca P. prunorum’ the three most prevalent aceF genotypes were detected in both plants and insect vectors, confirming that the prevalent isolates are propagated by insects. The four isolates known to be hypo-virulent had the same aceF sequence, indicating a possible monophyletic origin. Haplotype network reconstructed by eBURST revealed that among the 34 haplotypes of ‘Ca. P. prunorum’, the four hypo-virulent isolates also grouped together in the same clade. Genotyping of some Spanish and Azerbaijanese ‘Ca. P. pyri’ isolates showed that they shared some alleles with ‘Ca. P. prunorum’, supporting for the first time to our knowledge, the existence of inter-species recombination between these two species.

Evaluation of susceptibility of pear and plum varieties and rootstocks to Ca. P. pyri and Ca. P. prunorum using Real-Time PCR

Real-time PCR was used to quantify phytoplasma concentration in fifty inoculated trees from five Prunus rootstocks and in forty-eight symptomatic pear and Japanese plum trees from orchards. Seasonal fluctuation of Ca. P. prunorum in different Prunus rootstocks, over three years, showed that the highest percentage detected by nested-PCR was in the ‘Garnem’ rootstock on nearly all sampling dates. Intra-varietal differences were also observed. Phytoplasma titer could be estimated by real time PCR in some trees of the rootstocks ‘Garnem’, ‘Barrier’, ‘GF-677’ and ‘Marianna’, and ranged from 4.7x105 to 3.18x109 phytoplasmas per gram of tissue. Quantification by real-time PCR was not possible in the ‘Cadaman’ trees analyzed, probably due to a lower phytoplasma titer in this variety. Samples from infected trees from commercial plots had different phytoplasma concentration and detection percentage depending on the variety, both being lower in ‘Fortune’ and ‘606’ Japanese plum and in ‘Blanquilla’ pear trees.

Evaluation of detection methods for Virus, Viroids and Phytoplasmas affecting pear and apple

The RT-PCR technique for the detection of apple stem grooving virus (ASGV), apple stem pitting virus (ASPV), apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), apple mosaic virus (ApMV) and pear blister canker viroid (PBCV) was evaluated for health control of fruit plants from nurseries. The technique was evaluated in purified RNA and crude extracts and also in phloem collected in autumn and from young spring shoots. The results obtained for phytoplasma detection with ribosomal and non-ribosomal primers are also presented.

Incidência de viroses e enfezamentos e estimativa de perdas causadas por molicutes em milho no Paraná

O objetivo deste trabalho foi avaliar a incidência de viroses e enfezamentos e estimar as perdas causadas por enfezamentos na cultura do milho safrinha. Os diagnósticos baseados em sintomas foram confirmados por PCR ou RTPCR. Em todas as lavouras, foram identificadas plantas com sintomas de enfezamentos, em incidência de 6,2% a 49,9% (média de 20,7%). Na identificação de insetos vetores desses patógenos, a cigarrinha Dalbulus maidis foi detectada em 20 lavouras das 24 amostradas, constituindo 66,6% do total de espécimens de cigarrinhas coletadas. A perda potencial causada pelos enfezamentos no período foi estimada em cerca de 16,5 milhões de dólares. A ocorrência de plantas com sintomas de "Maize rayado fino virus" e "Maize dwarf mosaic virus" foi baixa e o diagnóstico confirmado por RTPCR. A análise de 441 amostras suspeitas de infecção por "Mal de Río Cuarto virus", por DASELISA, mostrou ausência desse vírus. Resultados de PCR indicaram a presença de um possível fitoplasma distinto de "Maize bushy stunt phytoplasma" em duas plantas apresentando nanismo acentuado, folhas estreitas, enrijecidas, com deformações, e grãos na inflorescência, havendo necessidade de mais estudos para a confirmação da identidade desse possível novo fitoplasma.

Controle químico da cigarrinha-do-milho e incidência dos enfezamentos causados por molicutes

O objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência do tratamento inseticida de sementes de milho no controle de Dalbulus maidis e na redução da incidência de enfezamentos em viveiro telado e em campo. Foram realizados dois experimentos; no experimento 1, em viveiro telado, sementes de milho foram tratadas com imidacloprid e thiamethoxan e, nessas plantas, cigarrinhas sadias, cigarrinhas infectantes com fitoplasma ou com espiroplasma foram confinadas. Avaliaram-se eficiência de controle, incidência de plantas com enfezamentos, altura das plantas e produção de grãos. No experimento 2, em campo, imidacloprid e thiamethoxan foram utilizados em tratamento de sementes e pulverizações aos 10 e 20 dias após a semeadura. A incidência de enfezamentos e a produção de grãos foram avaliadas. Em viveiro telado, os produtos imidacloprid e thiamethoxan proporcionaram controle de adultos de D. maidis acima de 50%, até o trigésimo dia, e reduziram a incidência de doenças e danos no crescimento e produção das plantas infectadas expostas às cigarrinhas infectantes aos dois dias após a emergência. Em campo, não foi constatada redução na incidência de enfezamentos ou ganho em produção, possivelmente devido ao fluxo migratório de cigarrinhas infectantes.

Herança da resistência ao enfezamento em milho

Os objetivos deste trabalho foram determinar a herança da resistência ao complexo de enfezamento em milho e determinar as melhores fontes de resistência entre as linhagens estudadas. Foram realizadas as análises dialélica e médias de gerações em linhagens de milho. Para a análise dialélica, foram cruzadas 12 linhagens de milho, em dialélico parcial. Para análises de médias de gerações, foram cruzadas três linhagens resistentes e quatro suscetíveis, para a obtenção das gerações F1, F2, RCP R e RCP S. Os trabalhos foram conduzidos em Jaboticabal, SP. A incidência de enfezamento foi avaliada no estádio fenológico R3. Efeitos significativos quanto à capacidade geral de combinação e capacidade específica de combinação foram obtidos, o que indicou que, no controle do caráter enfezamentos, estão envolvidos tanto os efeitos aditivos quanto os de dominância. Análises de médias de gerações mostraram a presença de poucos genes envolvidos com o controle da resistência, com predominância de efeitos aditivos, o que permite a seleção de genótipos resistentes. As linhagens L02, L03 e L05 poderão ser utilizadas como fontes de resistência, em futuras combinações híbridas.

Efeito da população infetiva de Dalbulus maidis na produção de grãos e no desenvolvimento de sintomas do enfezamento vermelho do milho

O enfezamento vermelho, causado por fitoplasma, é uma doença que vem aumentando significativamente de importância, em função dos plantios sucessivos de milho (Zea mays). A transmissão ocorre por meio de cigarrinhas, destacando-se a espécie Dalbulus maidis. Com o objetivo de determinar o efeito da população infetiva de D. maidis sobre a produção e o desenvolvimento de sintomas, plantas do híbrido suscetível XLX 520, com dez dias de idade, foram experimentalmente inoculadas com fitoplasma, utilizando populações de um, três, seis e nove insetos por planta, confinados por quatro dias para o período de inoculação. Como tratamentos testemunha, foram utilizadas plantas infestadas com um, três, seis e nove insetos sadios e plantas não infestadas por cigarrinhas. Nas plantas infetadas, os sintomas mais evidentes foram avermelhamento foliar, enfezamento generalizado e proliferação de espigas improdutivas. Rendimento e qualidade de grãos, bem como altura de plantas foram reduzidos à medida em que se aumentou a população de insetos infetivos. Incidência da doença e intensidade de sintomas foram maiores nas plantas inoculadas com as maiores densidades de insetos. Reduções médias de 35,0; 53,7; 65,7 e 91,3% foram constatadas quando se avaliou a produção de plantas inoculadas com um, três, seis e nove insetos infetivos, respectivamente. Assim, é possível que quanto mais alta a população de insetos infetivos, maior a quantidade de inóculo inicial transmitido às plantas e maior o efeito da doença sobre as mesmas.

Disseminação de molicutes do milho a longas distâncias por Dalbulus maidis (Hemiptera: Cicadellidae)

O objetivo do trabalho foi testar a hipótese de que a cigarrinha Dalbulus maidis (Hemiptera: Cicadellidae) serve como reservatório natural dos molicutes (Spiroplasma kunkelii e fitoplasma) que infetam o milho (Zea mays) no Mato Grosso do Sul, após períodos prolongados de pousio. Nas safras 1997/98 e 1998/99, avaliou-se a infetividade natural de migrantes desse inseto vetor em plantios de primavera (novembro/dezembro) da região de Anastácio (MS), onde não se cultiva o milho na entressafra (abril a setembro), em duas situações distintas: (A) áreas onde o milho era plantado anualmente a partir de outubro, e (B) áreas onde o milho não era cultivado há vários anos. Cigarrinhas foram coletadas no campo e confinadas em plântulas sadias de milho, em casa de vegetação, para a inoculação dos patógenos. Após 50-60 dias, as plantas-teste foram avaliadas quanto a sintomas diagnósticos de S. kunkelii e por PCR para detecção de fitoplasma. Através dos bionsaios de transmissão, detectou-se S. kunkelii e fitoplasma em 2 a 20% e 1 a 4% dos indivíduos coletados, respectivamente. O aparecimento de adultos infetivos logo após a germinação da cultura, inclusive nas áreas onde o milho não era cultivado há vários anos, sugere que os molicutes foram transportados na entressafra por indivíduos migratórios de D. maidis.

Ocorrência de doenças causadas por molicutes e por vírus em milho nas Províncias de Tucumán e de Córdoba na Argentina

A incidência de doenças causadas por molicutes e por vírus foi avaliada em lavouras de milho (Zea mays) nas Províncias de Tucumán e de Córdoba, na Argentina, em fevereiro de 2000. Na Província de Tucumán verificou-se que 44% das lavouras apresentaram altos níveis de incidência de plantas com sintomas de enfezamentos causados por molicutes (50 a 100%), em altitudes variando de 300 a 2.000 m. A presença de fitoplasma e de espiroplasma foi confirmada em amostras de folhas de plantas com sintomas de enfezamentos, através dos testes de PCR e de "Western blotting". Constatou-se, porém, que a eficiência desses testes para detecção destes patógenos, quando os sintomas apresentados pelas plantas eram muito acentuados, foi da ordem de 70%, e de apenas 30% quando os sintomas eram menos acentuados. Na localidade Jesus Maria, foram encontradas plantas apresentando acentuado nanismo, folhas estreitas e com deformações. Dentre quatro amostras destas plantas, submetidas a testes de PCR, em duas foi detectada a presença de fitoplasma, possivelmente d istinto do "Maize Bushy Stunt Phytoplasma". A cigarrinha Dalbulus maidis, inseto vetor dos molicutes, foi encontrada apenas em Tucumán, estando ausente em Córdoba. O Mal de Rio Cuarto virus foi detectado em seis lavouras em Córdoba, e em três em Tucumán. A cigarrinha Delphacodes kuscheli foi detectada em todas as lavouras em Córdoba, e em apenas três lavouras em Tucumán. O Maize dwarf mosaic virus foi detectado em cerca de 60% das lavouras amostradas nas duas Províncias e o Maize rayado fino virus em apenas uma localidade em Tucumán.

Identidade molecular dos fitoplasmas associados aos enfezamentos do tomateiro e da berinjela com base na análise do gene 16S rDNA

Doenças de hortaliças de ocorrência no território brasileiro e em outras áreas do mundo têm sido associadas a diversos fitoplasmas. Na região de Piracicaba-SP e Bragança Paulista-SP, em plantas de tomate e berinjela foram observados sintomas típicos de enfezamento caracterizados por porte reduzido, clorose foliar, superbrotamento de ramos, desenvolvimento anormal do cálice, encurtamento de entre-nós, redução no tamanho de folhas, flores e frutos. Através de duplo PCR, utilizando os iniciadores R16 mF1/mR2 e R16 F2n/R2, fragmentos de DNA de 1,2 kb foram amplificados de amostras sintomáticas, demonstrando a presença de fitoplasma nos tecidos das plantas. O uso de iniciadores específicos demonstrou que estes fitoplasmas eram afiliados ao grupo 16SrIII. Análises de RFLP, usando as enzimas de restrição AluI, HpaII, KpnI, MboI, MseI e RsaI confirmaram que os fitoplasmas detectados eram representantes do grupo 16SrIII. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados em Escherichia coli, sequenciados e comparados, por homologia de seqüência, entre si e com outros fitoplasmas do grupo 16SrIII. Um índice de similaridade de seqüência acima de 95% foi encontrado quando seqüências dos fitoplasmas detectados em tomate e berinjela foram comparadas com aquelas de outros representantes do grupo 16SrIII. Um índice de 98-99% foi obtido quando seqüências dos fitoplasmas encontrados em tomate e berinjela foram comparadas entre si. Estes resultados evidenciaram que o enfezamento do tomateiro e da berinjela podem estar associados a um mesmo fitoplasma, com base na análise de seqüências do gene do 16S rDNA.