Modifications post-traductionnelles des canaux calciques cardiaques de type L : identification des résidus asparagine qui participent à la glycosylation de la sous-unité auxiliaire CaVα2δ1

Les canaux calciques de type L CaV1.2 sont principalement responsables de l’entrée des ions calcium pendant la phase plateau du potentiel d’action des cardiomyocytes ventriculaires. Cet influx calcique est requis pour initier la contraction du muscle cardiaque. Le canal CaV1.2 est un complexe oligomérique qui est composé de la sous-unité principale CaVα1 et des sous-unités auxiliaires CaVβ et CaVα2δ1. CaVβ joue un rôle déterminant dans l’adressage membranaire de la sous-unité CaVα1. CaVα2δ1 stabilise l’état ouvert du canal mais le mécanisme moléculaire responsable de cette modulation n’a pas été encore identifié. Nous avons récemment montré que cette modulation requiert une expression membranaire significative de CaVα2δ1 (Bourdin et al. 2015). CaVα2δ1 est une glycoprotéine qui possède 16 sites potentiels de glycosylation de type N. Nous avons donc évalué le rôle de la glycosylation de type-N dans l’adressage membranaire et la stabilité de CaVα2δ1. Nous avons d’abord confirmé que la protéine CaVα2δ1 recombinante, telle la protéine endogène, est significativement glycosylée puisque le traitement à la PNGase F se traduit par une diminution de 50 kDa de sa masse moléculaire, ce qui est compatible avec la présence de 16 sites Asn. Il s’est avéré par ailleurs que la mutation simultanée de 6/16 sites (6xNQ) est suffisante pour 1) réduire significativement la densité de surface de! CaVα2δ1 telle que mesurée par cytométrie en flux et par imagerie confocale 2) accélérer les cinétiques de dégradation telle qu’estimée après arrêt de la synthèse protéique et 3) diminuer la modulation fonctionnelle des courants générés par CaV1.2 telle qu’évaluée par la méthode du « patch-clamp ». Les effets les plus importants ont toutefois été obtenus avec les mutants N663Q, et les doubles mutants N348Q/N468Q, N348Q/N812Q, N468Q/N812Q. Ensemble, ces résultats montrent que Asn663 et à un moindre degré Asn348, Asn468 et Asn812 contribuent à la biogenèse et la stabilité de CaVα2δ1 et confirment que la glycosylation de type N de CaVα2δ1 est nécessaire à la fonction du canal calcique cardiaque de type L.

Modifications post-traductionnelles des canaux calciques cardiaques de type L : identification des résidus asparagine qui participent à la glycosylation de la sous-unité auxiliaire CaVα2δ1

Les canaux calciques de type L CaV1.2 sont principalement responsables de l’entrée des ions calcium pendant la phase plateau du potentiel d’action des cardiomyocytes ventriculaires. Cet influx calcique est requis pour initier la contraction du muscle cardiaque. Le canal CaV1.2 est un complexe oligomérique qui est composé de la sous-unité principale CaVα1 et des sous-unités auxiliaires CaVβ et CaVα2δ1. CaVβ joue un rôle déterminant dans l’adressage membranaire de la sous-unité CaVα1. CaVα2δ1 stabilise l’état ouvert du canal mais le mécanisme moléculaire responsable de cette modulation n’a pas été encore identifié. Nous avons récemment montré que cette modulation requiert une expression membranaire significative de CaVα2δ1 (Bourdin et al. 2015). CaVα2δ1 est une glycoprotéine qui possède 16 sites potentiels de glycosylation de type N. Nous avons donc évalué le rôle de la glycosylation de type-N dans l’adressage membranaire et la stabilité de CaVα2δ1. Nous avons d’abord confirmé que la protéine CaVα2δ1 recombinante, telle la protéine endogène, est significativement glycosylée puisque le traitement à la PNGase F se traduit par une diminution de 50 kDa de sa masse moléculaire, ce qui est compatible avec la présence de 16 sites Asn. Il s’est avéré par ailleurs que la mutation simultanée de 6/16 sites (6xNQ) est suffisante pour 1) réduire significativement la densité de surface de! CaVα2δ1 telle que mesurée par cytométrie en flux et par imagerie confocale 2) accélérer les cinétiques de dégradation telle qu’estimée après arrêt de la synthèse protéique et 3) diminuer la modulation fonctionnelle des courants générés par CaV1.2 telle qu’évaluée par la méthode du « patch-clamp ». Les effets les plus importants ont toutefois été obtenus avec les mutants N663Q, et les doubles mutants N348Q/N468Q, N348Q/N812Q, N468Q/N812Q. Ensemble, ces résultats montrent que Asn663 et à un moindre degré Asn348, Asn468 et Asn812 contribuent à la biogenèse et la stabilité de CaVα2δ1 et confirment que la glycosylation de type N de CaVα2δ1 est nécessaire à la fonction du canal calcique cardiaque de type L.

Les gènes et protéines BSP chez la souris et l’humain : clonage, caractérisation, expression sous forme recombinante et étude des fonctions biologiques

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins.

Avaliação de dois clones de Escherichia coli recombinante quanto ao crescimento e expressão de antígenos de Leishmania chagasi (kmp11 e P36)

Visceral leishmaniosis caused by Leishmania chagasi, also known as calazar, presented, in the period from 1990 to 2005, tax of incidence in Brazil varying between 1 and 3 cases for 100 000 inhabitants. The Northeast region that up to the year of 2000 contributed with almost 90% of the registered cases is reducing his participation in the current decade, reaching 56% in 2005. Conventional leishmaniasis treatment is costly and it shows high toxicity, demanding more research for alternative treatments, with special interest in development of vaccines and diagnosis kits which include production of recombinant antigens by host cells. Escherichia coli has been the microorganism most studied and used as a host for recombinant protein production. Therefore, the aim of this work was to study the influence of induction on cellular growth and to verify the type of Leishmania chagasi antigens expression (intra or extracellular) during two recombinant E. coli clones (kmp11 and P36) cultivation in rotary incubator (shaker) using three different media (2xTY, TB, FASS+EL). For that, tests were carried out using conditions established in the literature for E. coli (37°C and 200 rpm) and media supplemented with antibiotics to guarantee that only competent cells grows. First, tests were carried out without induction in order to verify the two microorganisms kinetic behavior (growth and substrate consumption) in different media. Next, the induction was carried out through the addition of IPTG (1mM as final concentration), at the first hour of cultivation. It was observed that protein expression were intracellular for all clones and media tested, however the highest level of expression was clearly observed by the electrophoresis band density (intensity) for 2xTY medium and kmp11 protein. Although it contains the lowest substrate concentration, consequently, a reduced cellular concentration when compared to other media, it appeared that this medium and clone combination is the most indicated for recombinant protein production. Therefore, the objective of this work was achieved, since the interested proteins were produced. Consequently, this result motivates new studies for production optimization using different cultivation strategies

Expressão da proteína S1 recombinante do vírus da bronquite infecciosa em Saccharomyces cerevisiae para aplicação no imunodiagnóstico

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Expressão em Escherichia coli de uma proteína recombinante do gene A2 de Leishmania chagasi e utilização desta proteína no diagnóstico da leishmaniose visceral canina

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Análise imunológica comparada da eficiência e especificidade da hialuronidase recombinante de Polybia paulista (Hymenoptera, Vespidae) expressa em bactéria e levedura

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Análise proteômica diferencial de Acidithiobacillus ferrooxidans em resposta aos sulfetos minerais calcopirita e bornita e efeito de uma proteína recombinante de A. ferrooxidans LR contendo cisteína na oxidação bacteriana da calcopirita

Pós-graduação em Biotecnologia - IQ

Clonagem do gene p28 e análise da expressão da proteína recombinante a partir da amostra Jaboticabal de Ehrlichia canis e sua aplicação no diagnóstico da erliqueose canina

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Caracterização biofísica e produção de antissoro policlonal contra a capa proteica recombinante do Southem bean mosaic virus

Pós-graduação em Genética - IBILCE

Efeito da desintegrina recombinante DisBa-01 incorporada em micelas ou livre em células portando ou não a integrina αvβ3

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Desenvolvimento e aplicação do ELISA indireto com proteína recombinante de nucleocapsídeo de coronavírus felino (FCoV) para quantificação de anticorpos em soros de gatos naturalmente infectados

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

Clonagem e expressão do gene engXCA de Xanthomonas campestri pv. campestris em Saccharmyces cerevisiae e estudos das endoglucanases nativa e recombinante

Pós-graduação em Biotecnologia - IQ

Obtenção de uma nova proteína recombinante componente do complexo telemérico LAGT1 de Leishmania Amazonensis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Atividade antiangiogênica da forma recombinante da proteína 21 de Trypanosoma cruzi

Chagas disease, caused by the parasite Trypanosoma cruzi, is the cause of Chronic chagasic cardiomyopathy (CCC). The prospection of innovative therapeutic agents against CCC is a major task. The recombinant form of 21 (rP21), a secreted T. cruzi protein involved in host cell invasion and on progression of chronic inflammatory processes have been studied as a potential novel therapeutic target. Our present work aimed to verify and investigate the impact of rP21 in the formation of blood vessels in vitro and in vivo. First, tEnd cells were treated with different concentrations of rP21 or bacterial extract and viability and cellular adhesion were evaluated by MTT and angiogenesis inhibition by Matrigel tube formation assay and murine model. To verify the proteolytic activity of rP21 on extracellular matrix (ECM) components, fibrinogen, matrigel and fibronectin was incubated with rP21 or not. In addition, we performed proliferation assays and cell cycle analysis. Furthermore, the accumulation and distribution of F-actin was determined by Phalloidin staining using ImageJ software. Finally, tEnd cells were incubated with rP21 and the mRNA levels were analyzed by real-time PCR. Our results showed that rP21 did not alter cell viability and adhesion, but strongly inhibited vessel formation in vitro and in vivo. Tube formation assay showed that angiogenesis inhibition was dependent of the CXCR4-rP21 binding. In addition to these results, we observed that the rP21 was able to inhibit cell proliferation and promoted a significant reduction in the number of 4n cells (G2/M phase). Moreover, we found that rP21 significantly increased F-actin levels and this protein was able to modulate expression of genes related to angiogenesis and actin cytoskeleton. However, rP21 showed no significant activity on the matrix components. In this sense, we conclude that the rP21-endothelial cells (ECs) interaction via CXCR4 promotes inhibition of vessel formation through a cascade of intracellular events, such as inhibition of ECs proliferation and modulation of the expression of molecules associated with angiogenic processes and actin cytoskeleton.