Atividade antiangiogênica da forma recombinante da proteína 21 de Trypanosoma cruzi

Chagas disease, caused by the parasite Trypanosoma cruzi, is the cause of Chronic chagasic cardiomyopathy (CCC). The prospection of innovative therapeutic agents against CCC is a major task. The recombinant form of 21 (rP21), a secreted T. cruzi protein involved in host cell invasion and on progression of chronic inflammatory processes have been studied as a potential novel therapeutic target. Our present work aimed to verify and investigate the impact of rP21 in the formation of blood vessels in vitro and in vivo. First, tEnd cells were treated with different concentrations of rP21 or bacterial extract and viability and cellular adhesion were evaluated by MTT and angiogenesis inhibition by Matrigel tube formation assay and murine model. To verify the proteolytic activity of rP21 on extracellular matrix (ECM) components, fibrinogen, matrigel and fibronectin was incubated with rP21 or not. In addition, we performed proliferation assays and cell cycle analysis. Furthermore, the accumulation and distribution of F-actin was determined by Phalloidin staining using ImageJ software. Finally, tEnd cells were incubated with rP21 and the mRNA levels were analyzed by real-time PCR. Our results showed that rP21 did not alter cell viability and adhesion, but strongly inhibited vessel formation in vitro and in vivo. Tube formation assay showed that angiogenesis inhibition was dependent of the CXCR4-rP21 binding. In addition to these results, we observed that the rP21 was able to inhibit cell proliferation and promoted a significant reduction in the number of 4n cells (G2/M phase). Moreover, we found that rP21 significantly increased F-actin levels and this protein was able to modulate expression of genes related to angiogenesis and actin cytoskeleton. However, rP21 showed no significant activity on the matrix components. In this sense, we conclude that the rP21-endothelial cells (ECs) interaction via CXCR4 promotes inhibition of vessel formation through a cascade of intracellular events, such as inhibition of ECs proliferation and modulation of the expression of molecules associated with angiogenic processes and actin cytoskeleton.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais

Dissertação (Mestrado)

A doença de Chagas, causada pelo parasito Trypanosoma cruzi, é a causa da Cardiomiopatia chagásica crônica (CCC). A prospecção de agentes terapêuticos contra a CCC é o maior desafio. Neste cenário, a proteína recombinante 21 (rP21) de T. cruzi se encontra envolvida na invasão da célula hospedeira e na progressão de processos inflamatórios crônicos, o que a torna um novo potencial alvo terapêutico. O presente trabalho teve como objetivo verificar e investigar o impacto da rP21 na formação de vasos sanguíneos in vitro e in vivo. Inicialmente, a viabilidade e adesão de células tEnd tratadas com diferentes concentrações de rP21 ou extrato bacteriano foi avaliada por MTT e a inibição da angiogênese foi verificada por ensaios da formação de vasos em Matrigel e em modelo murino. Para analisar a atividade proteolítica da rP21 em componentes da matriz extracelular, fibrinogênio, Matrigel e fibronectina foram incubados com rP21 ou não. Além disso, realizamos ensaios de proliferação celular e análise do ciclo celular. Posteriormente, o acúmulo e distribuição de F-actina foi determinado por marcação com faloidina e análise no software ImageJ. Finalmente, para análise de expressão gênica, células tEnd foram incubadas com rP21 e foi feito o RT-qPCR. Nossos resultados mostram que a rP21 não alterou a viabilidade celular e adesão, entretanto promoveu a inibição da formação de vasos in vivo e in vitro. Além disso, os ensaios de formação de vasos demonstraram que a inibição da angiogênese in vitro foi dependente da interação CXCR4-rP21. Somado à estes resultados, observamos que a rP21 foi capaz de inibir a proliferação celular e promover uma redução significativa no número de células 4n (fase G2/M). Além disso, observamos que a rP21 promoveu um aumento nos níveis de F-actina e modulação da expressão de genes relacionados a angiogênese e ao citoesqueleto de actina. Entretanto, a rP21 não demonstrou atividade significativa sobre os componentes da matriz extracelular. Neste sentido, concluímos que a ligação da rP21 à células endoteliais (ECs) via receptor CXCR4 promova a inibição da formação de vasos através de uma cascata de eventos intracelulares, tais como a inibição da proliferação de ECs e modulação da expressão de moléculas relacionadas à processos angiogênicos e ao citoesqueleto de actina.