Resiliencia en cuidadores familiares de personas mayores dependientes

El presente trabajo analiza la distribución de los niveles de resiliencia en cuidadores no profesionales (familiares) de personas mayores dependientes, y explora las características que poseen los cuidadores altamente resilientes. Para ello se administró la escala CD-RISC a una muestra de 111 cuidadores. En función de las puntuaciones obtenidas, se distinguieron dos grupos: alta vs. moderada o baja resiliencia. Se analizaron las diferencias entre ambos grupos en las diversas variables que afectan al estrés del cuidador. Aunque hubo diferencias en el estado cognitivo del receptor de cuidado, las mayores diferencias se obtuvieron en las denominadas variables mediadoras, observando en los cuidadores con alta resiliencia mayores puntuaciones en: satisfacción con el apoyo social recibido, autoeficacia para controlar los pensamientos negativos, autoestima, autocuidado y extraversión; y siendo estas diferencias estadísticamente significativas. Asimismo los cuidadores altamente resilientes tendieron a manifestar una menor preocupación por los problemas del mayor, y presentaron menores niveles de sintomatología depresiva y ansiosa. Este estudio pone de manifiesto la importancia de la resiliencia como factor de protección en el ámbito del estrés crónico, incorporando aspectos positivos de la adaptación a los modelos teóricos de cuidado, los cuales tradicionalmente se han venido centrando en el desarrollo de sintomatología

Estudio de genes de la familia MYB relacionados con la tolerancia al estrés salino en Lotus spp

Resumen: El género Lotus comprende alrededor de 100 especies anuales y perennes distribuidas en todo el mundo. Algunas de las especies de Lotus muestran un gran potencial para la adaptación a estreses abióticos. Entre estas especies se encuentra Lotus tenuis, especie herbácea, que se encuentra naturalizada en los bajos salinos alcalinos de la Pampa Deprimida hace más de 50 años y es muy valorada como forrajera en los sistemas ganaderos. Como características principales se encuentra la variabilidad genética de sus poblaciones, la plasticidad genotípica de las plantas, su tolerancia al anegamiento y a la salinidad. Teniendo en cuenta la importancia de los daños causados por el estrés en las plantas, sería de gran utilidad comprender cuales son los mecanismos moleculares a través de los cuales las plantas detectan el estrés y transducen la señal dentro de las células para generar respuestas adaptativas y de esta manera poder diseñar estrategias que permitan mejorar la tolerancia al estrés de los cultivos. Uno de los mecanismos de la regulación de la expresión génica es a través de los factores de transcripción (FT). Estos, entre otras funciones, regulan las respuestas adaptativas, por eso sería importante conocer cuáles son los genes involucrados en estas respuestas. Varias familias de FT se encuentran involucradas en la respuesta al estrés abiótico en plantas, una de ellas es la familia de proteínas MYB, siendo esta una de las más numerosas en las plantas. El objetivo de este trabajo es identificar FT tipo MYB en L. tenuis y evaluar su relación con la respuesta adaptativa al estrés salino. Para este experimento se extrajo ADN de hojas de plantas que crecieron en condiciones normales y ARN de raíces de plántulas que permanecieron bajo condiciones de salinidad por 8 y 24 horas, de dos familias de medio hermano (FMH) de L. tenuis, una susceptible y otra tolerante a la salinidad. Se realizaron varias reacciones de PCR y RT-PCR, que arrojaron como resultado amplificación del fragmento genómico y del transcrito con el tamaño esperado. Una vez secuenciados estos fragmentos se determinó la presencia de FT tipo MYB en L. tenuis. Analizando los resultados preliminares de la expresión relativa de los genes MYB estudiados bajo condiciones de estrés salino, se observó expresión bajo condiciones de salinidad como en condiciones normales de crecimiento, lo que sugiere que estos genes no solo responden al estrés salino sino también a otros estreses o factores. Para el gen MYB 102_1420 se observó mayor expresión del tratamiento con solución salina a las 24 horas que a las 8 horas. Al comparar ambas FMH vemos que el comportamiento es similar. Para el gen MYB 102_950 se observó que la FMH susceptible bajo condiciones de salinidad a las 8 horas presenta mayor expresión que a las 24 horas, con la FMH tolerante sucede todo lo contrario. El estudio de la capacidad de adaptación y tolerancia a los distintos estreses y el control de las respuestas adaptativas por medio de los FT en L. tenuis permitirá contribuir a mejorar su adaptación en la Pampa Deprimida, y de esta manera poder identificar poblaciones aptas para ser cultivadas en suelos salinos.

Los horarios laborales y su influencia en la percepción del equilibro trabajo-familia

Conciliar el trabajo y la familia es una lucha cotidiana que cada persona realiza para satisfacer las exigencias de ambas dimensiones de su vida. El no tener consciencia del problema que surge en el empleado para lograr esta conciliación y la ausencia de soluciones eficaces a éste, no sólo afecta a la organización a través de la baja productividad, el absentismo, el aumento del estrés, entre otros efectos; sino también a la vida familiar, social, física y psicológica del trabajador. Es por ello, que este proyecto de grado busca a partir de la revisión de la literatura mostrar cómo la percepción que tienen los trabajadores de su equilibrio trabajo-familia, se ve influenciada por un factor organizativo, como lo son los turnos laborales; además evidenciar las soluciones que se han implementado en las diferentes empresas de manera exitósa, para finalmente plantear estrategias que se puedan aplicar en las organizaciones facilitando el equilibrio trabajo-familia de los trabajadores.

Estrès infantil?. '¿Estrés infantil?'.

Resumen del autor en catalán

La familia del paciente en Unidad de Cuidado Intensivo (UCI)

Introducción: Ingresar a la UCI no es una experiencia exclusiva del paciente; implica e involucra directamente a la familia, en aspectos generadores de estrés, estrategias de afrontamiento, temores, actitudes y expectativas, la participación de la familia en el cuidado y el rol del psicólogo. Objetivo: Revisar de los antecedentes teóricos y empíricos sobre la experiencia de la familia en UCI. Metodología: Se revisaron 62 artículos indexados en bases de datos. Resultados: la UCI es algo desconocido tanto para el paciente como para la familia, por esto este entorno acentúa la aparición de síntomas ansiosos, depresivos y en algunos casos estrés post traumático. La muerte es uno de los principales temores que debe enfrentar la familia. Con el propósito de ajustarse a las demandas de la UCI, los familiares exhiben estrategias de afrontamiento enfocadas principalmente en la comunicación, el soporte espiritual y religioso y la toma de decisiones. El cuidado centrado en la familia permite una mejor comunicación, relación con el paciente y personal médico. El papel del psicólogo es poco explorado en el espacio de la UCI, pero este puede promover estrategias de prevención y de rehabilitación en el paciente y su grupo familiar. Discusión: es importante tener en cuenta que la muerte en UCI es una posibilidad, algunos síntomas como ansiedad, depresión pueden aparecer y mantenerse en el tiempo, centrar el cuidado en la familia permite tomar las decisiones basados en el diagnóstico y pronóstico y promueve expectativas realistas. Conclusiones: temores, expectativas, actitudes, estrategias de afrontamiento, factores generadores de estrés permiten explicar y comprender la experiencia de la familia del paciente en UCI.

Familia y deficiencia mental : realidad, necesidades y recursos de los hermanos.

Proporcionar y crear alguna alternativa que se adapte y satisfaga las necesidades de los hermanos de los disminuidos mentales. Muestra restringida de 14 hermanos mayores de 14 años y 13 padres de niños deficientes mentales. Muestra amplia de 41 hermanos y 33 padres de niños deficientes mentales. Muestra de los centros: 40 profesionales de diversos centros dedicados a la Educación Especial. Realiza una revisión bibliográfica abordando la dinámica de la familia normal, disminución mental y dinámica de la familia del disminuido mental. Aborda conceptualmente el proceso evaluativo. Desarrolla las entrevistas y pasa los cuestionarios a los hermanos de los deficientes mentales. Pasa la escala de estimación a los diferentes centros de la muestra. Realiza el análisis de datos con cada uno de los instrumentos que utiliza para la recogida de información. Diseña un plan de necesidades, elabora el plan de intervención y propone libros divulgativos. Entrevista. Cuestionario. Escala de estimación. Validez. Fiabilidad. Investigación evaluativa. Tabulación de frecuencias y porcentajes. Programa estadístico SPSS-PC. Engloba los resultados en la realidad, necesidades primarias, necesidades secundarias, adaptación y necesidad de intervención. Ambas alternativas de intervención no son excluyentes. El libro puede ser aplicado en muchos más contextos y por lo tanto ayudaría a los hermanos en cualquier interpretación del estrés. En el mundo en el que vivimos, donde el estrés está de moda, conocer y utilizar este afrontamiento puede resolver muchos problemas.

Familia y deficiencia mental.

Determinar el grado de estrés que provoca en la familia, sobre todo en los padres, el hecho de existir en ella un deficiente mental.. Abarca a 73 padres (padres y madres) de hijos deficientes mentales escolarizados o institucionalizados en 6 centros de Zamora, en los cuales se imparte educación especial. Las edades de los hijos están comprendidas entre 5 y 22 años.. El estudio parte de la siguiente hipótesis: cuanto mayor es el grado de deficiencia, mayor es también el grado de estrés. Empieza definiendo el concepto de deficiencia mental y procede a una clasificación de la deficiencia en función de su grado. Como variable dependiente toma el estrés de los padres que tienen un hijo con deficiencia mental y como independiente, el grado en que se da dicha deficiencia. Identifica el estrés como todo aquello que es vivido como una sobrecarga. Dependiendo de su coeficiente intelectual y yendo de menor a mayor, los deficientes se consideran ligeros (CI: 50-69), moderados (CI: 35-49), severos (CI: 20-34) y profundos (CI: 0-19). La parte práctica de la investigación trata los siguientes aspectos: la educación del deficiente mental, sus tipos, el deficiente mental y la familia, el estrés familiar provocado por la deficiencia y la deshumanización del deficiente.. Se elabora un cuestionario que consta de 22 ítems. En veintiuno de ellos las respuestas van a ser afirmativas o negativas. La respuesta al último ítem permite ver el grado de deficiencia.. En la construcción de los ítems se tiene en cuenta: cuestiones relativas a problemas familiares y de los padres, el pesismismo de los padres frente a la situación de los hijos y los problemas relativos al aspecto conductual del hijo deficiente. Los resultados se muestran en tablas y gráficos, mediante porcentajes.. Respecto al factor problemas familiares y de los padres, la hipótesis es válida sólo para los deficientes mentales ligeros y moderados puesto que el grado de estrés alcanzado por los padres del deficiente mental profundo es inferior al de los padres del severo. En lo que se refiere al factor pesimismo, puede afirmarse que a mayor grado de deficiencia, mayor es el pesimismo de los padres y mayor el estrés. El nivel de conductas inadecuadas es mayor en los ligeros que en los moderados; también, los severos superan a los profundos en conductas inadecuadas.. El estrés manifestado por los padres no siempre está directamente relacionado con el grado de deficiencia mental del hijo. Los datos obtenidos permiten afirmar que el grado de estrés, sí está directamente relacionado con el grado de deficiencia, en los casos de deficiencia mental ligera y moderada.

Conductas desadaptativas de los adolescentes en Navarra : el papel de la familia y la escuela.

Analizar tres tipos de conductas desadaptativas (agresividad y conductas delictivas, consumo de drogas, y victimización) en los adolescentes que cursan la Educación Secundaria Obligatoria (ESO) en Navarra en función de variables individuales, familiares, escolares y sociales. Se pretende confirmar las siguientes hipótesis:1.-Los adolescentes que se ven implicados en menor medida en conductas desadaptativas, muestran un funcionamiento familiar más adecuado que los adolescentes que participan en estas conductas con mayor frecuencia.2.-Los adolescentes que presentan unos niveles positivos de autoestima (física, emocional, familiar, académica y social), informan de una menor comisión de conductas desadaptativas.3.-Los adolescentes que manifiestan una buena salud mental, presentan una menor implicación en conductas desadaptativas.4.-Los adolescentes con una actitud negativa y de rechazo hacia la autoridad institucional, presentan una mayor implicación en conductas transgresoras. 715 estudiantes de Educación Secundaria Obligatoria, de edades comprendidas entre 11 y 18 años, de ambos sexos, de colegios públicos y concertados y de las líneas linguísticas de castellano y euskera. Variables tenidas en cuenta en la realización del estudio: funcionamiento familiar, salud mental, actitud hacia la autoridad institucional. Variables referidas a las conductas desadaptativas: agresividad y conductas delictivas, consumo de drogas y victimización. Entre los factores que mejor explican dichas conductas desadaptativas en los adolescentes se encuentran la comunicación familiar inadecuada, la agresividad familiar, las autoestimas familiar y académica, el estrés percibido, la sintomatología depresiva, el rechazo a la autoridad escolar y la escasa valoración parental hacia la escuela.

Atención temprana y familia : cómo intervenir creando entornos competentes.

Resumen basado en el de la publicación

Servicios sociales de ayuda a la familia.

Estos servicios apenas contribuyen a solucionar los problemas sociales que se vienen produciendo en los últimos años en los diversos modelos de familia. La prensa y la bibliografía especializada se han hecho eco de las dificultades que padecen la mayoría de las familias. Mientras tanto las prestaciones familiares de la seguridad social son muy escasas, aumenta la demanda de apoyo a la familia en los servicios sociales de base y las administraciones (Ministerio, Comunidades Autónomas, Comunidades Locales) desarrollo de programas para familia desfavorecidas y en situación de riesgo social. Existe una responsabilidad pública que debe procurar servicios sociales de apoyo a la familia con miembros dependientes (mayores, discapacitados) y sobre todo con menores de seis años, también deben colaborar las empresas. Las personas empleadas y con responsabilidades familiares verán disminuir el estrés asociado a la doble tarea, familiar y laboral, si se adoptan medidas empresariales que hagan posible la conciliación de la vida familiar con el trabajo en función de la flexibilidad de horarios o de la movilidad geográfica y funcional requerida por las personas trabajadoras con responsabilidades familiares.

Estrés y burnout en la enseñanza.

Abordar la incidencia y las características del estrés y el burnout, conjuntamente, en la enseñanza y obtener un modelo predictivo. 614 profesores de más de 40 centros diferentes, tanto públicos como privados (concertados) de todos los niveles educativos (de preescolar a bachillerato) no universitarios de las Islas Baleares, y 37 profesores que estaban de baja. Este estudio aborda el estrés y el burnout desde un diseño integral que considera las siguientes variables: las características sociodemográficas (sexo, estado civil, edad, antigüedad profesional, etc) y profesionales (nivel educativo, tipo de centro, puesto profesional, número de alumnos, etc), el ambiente físico y social (apoyo social), las características personales del individuo, las causas ambientales y personales que producen el estrés y el burnout, las consecuencias de estrés y el burnout para la salud del individuo (psicológicas, fisiológicas y conductuales), para la organización laboral (disfunciones y bajo rendimiento) y para las relaciones sociales (deterioro). Permite relacionarlas entre sí y obtener un modelo predictivo. Han construido un amplio cuestionario y han aplicado el test estandarizado 16PF. Finalmente proponen técnicas y estrategias de actuación para el diseño de actividades de prevención e intervención. Instrumento estandarizado de personalidad 16PF de R. B. Cattell, escala de autoevaluación de síntomas de estrés, Maslach Burnout Inventory, cuestionario para la evaluación del apoyo social, prueba de Scheffé. Porcentajes. 1. La mayoría de los profesores (77 por ciento) consideran negativa y perjudicial la experiencia de estrés. La ansiedad es el sentimiento asociado. Aunque muchas variables sociodemográficas y profesionales determinan diferencias en el nivel de estrés, sólo la antigüedad (el grupo de 11 a 20 años), el nivel educativo (profesores de primaria) y las bajas de tipo psiquiátrico inducen diferencias significativas. 2. Un 40 por ciento de profesores españoles tienen niveles altos de burnout, especialmente en las dimensiones de agotamiento emocional y de realización personal. 3. Las causas específicas de estrés y burnout en la enseñanza consideradas más importantes por los profesores son: la falta de tiempo suficiente para preparar el trabajo, el excesivo número de alumnos por clase, la baja consideración de la profesión docente, el desinterés de los padres por sus hijos, la falta de motivación de los escolares, el excesivo papeleo burocrático y la hostilidad o mala conducta de los alumnos. 4. Las consecuencias principales del estrés son: el cansancio, el nerviosismo, la preocupación, la tensión, la irritabilidad y las ideas obsesivas. 5. Los factores de personalidad que tienen una relación más significativa con el nivel de estrés en la enseñanza son: relajado-tenso, reservado-abierto y sereno-aprensivo. 6. Los mejores predictores del nivel de estrés son: el agotamiento emocional, la intensidad de los síntomas, la despersonalización, la internalidad y estabilidad de las causas de estrés y los factores despreocupado-consciente y adhesión-autosuficiencia. Los mejores predictores de las dimensiones de burnout resultan ser los siguientes: para agotamiento emocional, el nivel de estrés, la intensidad total de las causas, el apoyo de amigos, el apoyo de motivación, la adhesión-autosuficiencia y la emocionalidad inestable-estable; para despersonalización, la intensidad e internalidad de las causas, el apoyo de los alumnos, la adhesión-autosuficiencia y la sensibilidad dura-blanda; para realización personal, el apoyo de los alumnos y de la familia y algunos rasgos de personalidad (cohibido-emprendedor, adhesión-autosuficiencia, reservado-abierto y relajado-tenso).

Diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica : estudio prospectivo en una familia de Gran Canaria con alta incidencia de muerte súbita.

Programa de doctorado: Avances en medicina interna.

Genes implicados en la respuesta molecular al estrés hídrico en Pinus pinaster Ait

La presente tesis doctoral se centra en el estudio de la respuesta molecular de las coníferas mediterráneas al estrés hídrico. Para ello se ha escogido como especie modelo Pinus pinaster Ait., la conífera más abundante en España, y que habita un amplio rango de situaciones ecológicas, especialmente en lo relativo a la disponibilidad de agua. En primer lugar, se ha aplicado un estrés hídrico controlado en cultivo hidropónico y se ha generando una genoteca sustractiva con objeto de identificar los genes inducidos por el estrés, analizando su expresión en raíces, tallos y acículas. A continuación, se ha analizado, la expresión de los genes anteriormente obtenidos así como de otros seleccionados de las bases de datos disponibles, durante una sequía prolongada en tierra, similar a las que las plantas deben afrontar en la naturaleza. Se ha utilizado en este caso, además de P. pinaster, P. pinea, otra conífera mediterránea adaptada a las sequías recurrentes. Este trabajo ha permitido identificar genes candidato expresionales, presumiblemente comunes en la respuesta molecular de las coníferas al déficit hídrico. Se han detectado diferencias notables en la expresión de determinados genes, que podrían ser los responsables de las diferencias exhibidas por ambas especies en el comportamiento frente a la sequía. Entre los genes identificados como inducidos por el estrés hídrico se encuentran varios miembros de la familia de las deshidrinas. Trabajos previos han utilizado deshidrinas como genes candidato; no obstante, la falta de especificidad de ciertos fragmentos y marcadores utilizados, debido a la complejidad estructural de esta familia, resta fiabilidad a algunos de los resultados publicados. Por este motivo, se ha estudiado en detalle esta familia en P. pinaster, se han identificado y caracterizado 8 miembros y se ha analizado su patrón de expresión frente a sequía. Este estudio ha permitido describir por primera vez unos segmentos conservados en la secuencia de aminoácidos de las deshidrinas de pináceas, cuya presencia y número de repeticiones parece estar relacionado con su especificidad. Por último, se han escogido tres genes implicados en distintas fases de la respuesta al estrés hídrico para su análisis exhaustivo: una deshidrina, una nodulina y un factor de transcripción tipo AP2. Se ha caracterizado su estructura exón/intrón y secuenciado su región promotora. Además, se han obtenido líneas transformadas que sobreexpresan estos genes tanto de forma heteróloga, en la especie modelo Arabidopsis thaliana, como en el propio P. pinaster. Este material facilitará la realización de futuros estudios sobre la función y el mecanismo de actuación de estos genes en la respuesta al estrés hídrico. ABSTRACT This thesis focuses in the study of the molecular response to water stress in Mediterranean conifers. For this purpose, P. pinaster was selected as model species. It’s the most abundant conifer in Spain, living in a wide range of ecological conditions, especially regarding water availability. First, we have applied a controlled polyethylene glycol-induced water stress in hydroponic culture and obtained a suppression subtractive hybridization (SSH) library, with the aim of identifying genes induced by water stress, analysing their expression in roots, stems and needles. We have then analysed the expression patterns of the identified genes, together with other genes selected from public databases. This study was conducted throughout a prolonged drought stress in soil, similar to the ones plants have to face in nature. In this case not only P. pinaster was analysed but also P. pinea, another Mediterranean conifer well adapted to recurrent droughts. This work has enabled us to identify of reliable candidate genes, presumably shared with other conifers in the response to water stress. We observed remarkable differences in the expression of some genes, which could be involved in the differential behaviour that these species show in the water stress response. Within the genes induced by water stress, several members of the dehydrin gene family were identified. Due to the structural complexity of the family, certain ambiguities and inconsistencies have been detected in previous works that have used dehydrins as candidate genes. For this reason, we have analysed thoroughly this gene family in P. pinaster, and have identified and characterized eight different members, whose expression patterns during drought have also been assessed. This study has allowed us to identify for the first time novel conserved segments in the amino acids sequences of Pinaceae. The presence and number of repetitions of these segments could be associated with the functional specificity of these proteins. Finally, three genes involved in different steps of the water stress response were selected for an exhaustive analysis: a dehydrin, a nodulin and an AP2 transcription factor. For all of them, the exon/intron structure was established and their promoter region was sequenced. Also, transformed lines were obtained both in Arabidopsis thaliana and in P. pinaster for the constitutive overexpression of these genes. This material will facilitate the development of further studies to investigate the function of these genes during the water stress response

Chaperonas moleculares y tolerancia a estrés abiótico en especies arbóreas

Las temperaturas extremas, la sequía y otros estreses abióticos limitan la producción forestal de forma significativa, causando grandes pérdidas económicas en el sector. Los árboles, al ser organismos sésiles, han desarrollado una serie de estrategias para percibir dichos factores, activando respuestas defensivas apropiadas. Entre ellas ocupa un lugar preeminente la síntesis de proteínas con actividad chaperona molecular. Las chaperonas moleculares interaccionan con proteínas desnaturalizadas total o parcialmente, promoviendo su correcto plegamiento y ensamblaje. Las chaperonas moleculares que se sintetizan de forma predominante en plantas, pero no en otros eucariotas, pertenecen a la familia sHSP (small heat-shock proteins). Se trata de una familia inusualmente compleja y heterogénea, cuyos miembros son de pequeño tamaño (16-42 kD) y poseen un dominio “alfa-cristalina” muy conservado. Estas proteínas están implicadas en protección frente a estrés abiótico mediante la estabilización de proteínas y membranas, si bien su mecanismo de acción se conoce de forma incompleta. A pesar del evidente potencial aplicado de las proteínas sHSP, son muy escasos los estudios realizados hasta el momento con un enfoque netamente biotecnológico. Por otra parte, casi todos ellos se han llevado a cabo en especies herbáceas de interés agronómico o en especies modelo, como Arabidopsis thaliana. De ahí que las sHSP de arbóreas hayan sido mucho menos caracterizadas estructural y funcionalmente, y ello a pesar del interés económico y ecológico de los árboles y de su prolongada exposición vital a múltiples factores estresantes. La presente Tesis Doctoral se centra en el estudio de sHSP de varias especies arbóreas de interés económico. El escrutinio exhaustivo de genotecas de cDNA de órganos vegetativos nos ha permitido identificar y caracterizar los componentes mayoritarios de tallo en dos especies productoras de madera noble: nogal y cerezo. También hemos caracterizado la familia completa en chopo, a partir de su secuencia genómica completa. Mediante expresión heteróloga en bacterias, hemos analizado el efecto protector de estas proteínas in vivo frente a distintos tipos de estrés abiótico, relevantes para el sector productivo. Los resultados demuestran que las proteínas sHSP-CI: (i) aumentan la viabilidad celular de E.coli frente a casi todos estos factores, aplicados de forma individual o combinada; (ii) ejercen un rol estabilizador de las membranas celulares frente a condiciones adversas; (iii) sirven para mejorar la producción de otras proteínas recombinantes de interés comercial. El efecto protector de las proteínas sHSP-CI también ha sido analizado in planta, mediante la expresión ectópica de CsHSP17.5-CI en chopos. En condiciones normales de crecimiento no se han observado diferencias fenotípicas entre las líneas transgénicas y los controles, lo que demuestra que se pueden sobre-expresar estas proteínas sin efectos pleiotrópicos deletéreos. En condiciones de estrés térmico, por el contrario, los chopos transgénicos mostraron menos daños y un mejor crecimiento neto. En línea con lo anterior, las actividades biológicas de varias enzimas resultaron más protegidas frente a la inactivación por calor, corroborando la actividad chaperona propuesta para la familia sHSP y su conexión con la tolerancia al estrés abiótico. En lo que respecta a la multiplicación y propagación de chopo in vitro, una forma de cultivo que comporta estrés para las plantas, todas las líneas transgénicas se comportaron mejor que los controles en términos de producción de biomasa (callos) y regeneración de brotes, incluso en ausencia de estrés térmico. También se comportaron mejor durante su cultivo ex vitro. Estos resultados tienen gran potencial aplicado, dada la recalcitrancia de muchas especies vegetales de interés económico a la micropropagación y a la manipulación in vitro en general. Los resultados derivados de esta Tesis, aparte de aportar datos nuevos sobre el efecto protector de las proteínas sHSP citosólicas mayoritarias (clase CI), demuestran por vez primera que la termotolerancia de los árboles puede ser manipulada racionalmente, incrementando los niveles de sHSP mediante técnicas de ingeniería genética. Su interés aplicado es evidente, especialmente en un escenario de calentamiento global. ABSTRACT Abiotic stress produces considerable economic losses in the forest sector, with extreme temperature and drought being amongst the most relevant factors. As sessile organisms, plants have acquired molecular strategies to detect and recognize stressful factors and activate appropriate responses. A wealth of evidence has correlated such responses with the massive induction of proteins belonging to the molecular chaperone family. Molecular chaperones are proteins which interact with incorrectly folded proteins to help them refold to their native state. In contrast to other eukaryotes, the most prominent stress-induced molecular chaperones of plants belong to the sHSP (small Heat Shock Protein) family. sHSPs are a widespread and diverse class of molecular chaperones that range in size from 16 to 42k Da, and whose members have a highly conserved “alpha-crystallin” domain. sHSP proteins play an important role in abiotic stress tolerance, membrane stabilization and developmental processes. Yet, their mechanism of action remains largely unknown. Despite the applied potential of these proteins, only a few studies have addressed so far the biotechnological implications of this protein family. Most studies have focused on herbaceous species of agronomic interest or on model species such as Arabidopsis thaliana. Hence, sHSP are poorly characterized in long-lived woody species, despite their economic and ecological relevance. This Thesis studies sHSPs from several woody species of economic interest. The most prominent components, namely cytosolic class I sHSPs, have been identified and characterized, either by cDNA library screening (walnut, cherry) or by searching the complete genomic sequence (poplar). Through heterologous bacterial expression, we analyzed the in vivo protective effects of selected components against abiotic stress. Our results demonstrate that sHSP-CI proteins: (i) protect E. coli cells against different stressful conditions, alone or combined; (ii) stabilize cell membranes; (iii) improve the production of other recombinant proteins with commercial interest. The effects of CsHSP17.5-CI overexpression have also been studied in hybrid poplar. Interestingly, the accumulation of this protein does not have any appreciable phenotypic effects under normal growth conditions. However, the transgenic poplar lines showed enhanced net growth and reduced injury under heat-stress conditions compared to vector controls. Biochemical analysis of leaf extracts revealed that important enzyme activities were more protected in such lines against heat-induced inactivation than in control lines, lending further support to the chaperone mode of action proposed for the sHSP family. All transgenic lines showed improved in vitro and ex vitro performance (calli biomass, bud induction, shoot regeneration) compared to controls, even in the absence of thermal stress. Besides providing new insights on the protective role of HSP-CI proteins, our results bolster the notion that heat stress tolerance can be readily manipulated in trees through genetic engineering. The applied value of these results is evident, especially under a global warming scenario.

Nuevos mecanismos moleculares de tolerancia a sequía y otros tipos de estrés abiótico en especies arbóreas de interés económico

Las masas forestales tienen una importancia colosal para nuestra sociedad y el conjunto de la biosfera. Estudios recientes a escala mundial indican que la sequía es el factor abiótico que más afecta a su crecimiento y supervivencia, seguida por las temperaturas extremas y la salinidad. Aunque comprender los mecanismos con que las especies arbóreas toleran estas formas de estrés tiene un interés aplicado evidente, dichos mecanismos se han estudiado mucho más en especies herbáceas modelo o de interés agronómico. Existen sin embargo diferencias notables entre ellas, como se demuestra en esta tesis y en otros trabajos recientes. Nuestro estudio se centra concretamente en la respuesta molecular del chopo –el sistema modelo forestal más desarrollado– al estrés abiótico, con particular énfasis en la sequía. Utilizando una estrategia proteómica y tratamientos controlados, hemos identificado componentes mayoritarios de dicha respuesta. Su participación en la misma se ha validado mediante análisis transcripcionales detallados utilizando tecnología qRT-PCR (PCR cuantitativa en tiempo real). Hemos identificado proteínas cuyo nexo funcional con mecanismos de tolerancia ya era conocido, como chaperonas moleculares sHSP o enzimas que atenúan el estrés oxidativo, pero también proteínas cuya relación funcional con el estrés es menos clara o incluso novedosa, como polifenol oxidasas (PPO), deshidrogenasas/reductasas de cadena corta (SDR), o bicupinas (BIC), entre otras. El cuerpo central de la tesis consiste en la caracterización detallada de una PPO inusual, cuya inducción por estrés hídrico se describe por vez primera. Estas enzimas están ampliamente distribuidas en plantas, si bien su número es muy variable de unas especies a otras. Algunas, como nogal, tienen un único gen, mientras que Arabidopsis no tiene ninguno. En la última versión del genoma de chopo hemos identificado un total de 12 miembros bona fide, corrigiendo trabajos previos, y hemos caracterizado su expresión individual ante diferentes situaciones de estrés controlado y tratamientos hormonales. La isoforma antedicha es el único miembro de la familia que responde claramente a la deshidratación. También responde a salinidad y a la mayor parte de tratamientos hormonales ensayados, pero no a daño mecánico o tratamientos con metil jasmonato. Esto la diferencia de enzimas homólogas presentes en otras especies de plantas, que se han relacionado experimentalmente con estrés biótico. Los patrones de acumulación de transcritos en árboles adultos son compatibles con un papel protector frente a la sequía. La integración de nuestros estudios funcionales y filogenéticos sugiere que la familia ha sufrido un proceso reciente de diversificación y neofuncionalización, siendo la protección frente a deshidratación su papel primigenio. Aunque se conoce la actividad bioquímica in vitro de este tipo de enzimas, sus sustratos naturales son esencialmente una incógnita. Mediante expresión heteróloga en Escherichia coli BL21(DE3) hemos detectado que la enzima de chopo es capaz de oxidar L-DOPA a dopaquinona, siendo menos activa frente a otros sustratos. Por otra parte, hemos demostrado su localización cloroplástica mediante transformación transitoria de protoplastos con fusiones a la proteína fluorescente YFP. Mediante la obtención de plantas transgénicas de A. thaliana hemos demostrado que la enzima de chopo aumenta considerablemente la tolerancia in vivo frente a la deshidratación y al estrés salino. El análisis fenotípico detallado de las líneas transgénicas, combinando múltiples metodologías, nos ha permitido sustanciar que la tolerancia tiene una base compleja. Esta incluye una mayor protección del sistema fotosintético, una capacidad antioxidante muy incrementada y la acumulación de solutos osmoprotectores como la prolina. Los análisis metabolómicos nos han permitido asociar la expresión de la proteína a la síntesis de un flavano no descrito previamente en A. thaliana, vinculando la enzima de chopo con la síntesis de fenilpropanoides. También hemos observado alteraciones en los niveles hormonales que podrían subyacer a efectos pleiotrópicos con interés aplicado, como un aumento consistente del tamaño de la planta o el acortamiento del ciclo de crecimiento. Además de aportar datos novedosos sobre la funcionalidad in vivo de esta familia de oxidasas, los resultados de esta tesis demuestran que los árboles son sistemas de estudio interesantes para caracterizar nuevas estrategias de tolerancia al estrés abiótico con potencial aplicado. ABSTRACT Forests masses have an extraordinary importance for our society and the biosphere. Recent worldwide studies indicate that drought is the abiotic factor that affects more their growing and survival, followed by extreme temperatures and salinity. The understanding of how the arboreal species tolerate the stress has an evident practical interest, but their mechanisms have been studied much more in herbaceous species or with agronomic interest. However, considerable differences exist between them, as this thesis and recent studies show. Our study is focused on the molecular response of the poplar –the more developed forestry model system- to abiotic stress, specifically focused in the drought. Using a proteomic strategy and controlled treatments, we have identified main components in such response. Its participation has been validated through transcriptional analysis using qRT-PCR technology. We have identified proteins whose functional connection with tolerance mechanisms were already known, as molecular chaperones sHSP or enzymes that attenuate the oxidative stress, but also some proteins whose functional relationship with the stress is less clear or even novel, as polifenol oxidases (PPO), short chain deshidrogenases/reductases (SDR), or bicupines (BIC), among others. The central body of the thesis consists of the detailed characterization of an unsual PPO, whose induction due to drought stress is first described. These enzymes are thoroughly distributed in plants, but their number of members is very variable among species. Some of them, as the walnut tree, have a single gene, while Arabidopsis has none. We have identified a total of 12 members in the last version of the poplar genome, correcting previous works, and have characterized their individual expression against different situations of controlled stress and hormone treatments. The aforementioned isoform is the only member of the family that responds clearly to the drought. It also reacts to salinity and the majority of hormonal treatments tested, but it does not respond to mechanical damage or treatments with methyl jasmonate. This is the difference with homologue enzymes present in other plant species, which have been related experimentally with abiotic stress. The accumulation patterns of transcripts in adult trees are compatible with a protector role against drought. The integration of our functional and phylogenetic studies suggests that the family has suffered a recent process of diversification and neofunctionalization, being the protection against drought their original role. Although the in vitro biochemistry activity of this kind of enzymes is already known, their natural substracts are essentially a mystery. By means of heterologous expression of Escherichia coli BL21(DE3) we have detected that the enzyme of poplar is able to oxidize L-DOPA to dopaquinone, being less active against other substrates. Additionally, we have proven its chloroplastic location with transitory transformation of protoplasts with YFP protein fusion. By means of getting transgenic plants of A. thaliana, we have demonstrated that the poplar enzyme increases notably the in vivo tolerance against the drought and salinity stresses. The phenotypic analysis of the transgenic lines, and the use of multiple methodologies, allowed us to test the complexity of the tolerance. This includes a major protection of the photosynthetic system, a very increased antioxidant capacity and the accumulation of osmoprotectant solutes as the proline. The metabolic analysis has allowed to associate the protein expression with the synthesis of a Flavan non described previously in A. thalaiana, linking the enzyme of poplar with the synthesis of phenylpropanoids. We have observed alterations in the hormonal levels that could underlie pleiotropic effects with applied interest, as a consistent increase of the size of the plant and the reduction of the growth cycle. The results of this thesis, in addition to provide novel data about the in vivo functionality of the oxidase family, demonstrate that the trees are interesting systems of study to characterize new strategies of tolerance against abiotic stress with applied potential.