Efeito de substâncias químicas de uso laboratorial sobre Drosophila melanogaster (Diptera - Drosophilidade) do ponto de vista bioquímico e fenotípico

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Os efeitos do plasma não térmico à pressão atmosférica no desenvolvimento larval e anomalias morfológicas de Drosophila Melanogaster

O plasma não térmico nos cuidados de saúde é um campo emergente que tem as suas raízes na ciência de plasmas. Este tipo de investigação tem crescido rapidamente e é agora objeto de um amplo esforço de pesquisa interdisciplinar envolvendo a medicina, a biologia, a física, a química e a engenharia. Têm sido feitos vários trabalhos de modo a elucidar quais as interações das espécies produzidas pelo plasma com os sistemas vivos. É evidente que o mecanismo da interação do plasma com os sistemas vivos é complexo, em parte devido à complexidade do plasma mas principalmente devido à enorme complexidade da biologia. O principal objetivo desta dissertação foi observar os efeitos do plasma não térmico à pressão atmosférica (PNTPAs) no desenvolvimento larval e anomalias morfológicas de Drosophila melanogaster. Para o efeito, foram expostas e analisadas fenotipicamente 2.566 larvas após exposição, dos diferentes estádios (1.º, 2.º e 3.º) de desenvolvimento. Os testes foram realizados com aplicações de plasma com e sem ultra violeta, em duas linhas diferentes de Drosophila; uma linha selvagem preparada por nós e uma linha laboratorial. A análise fenotípica revelou que após exposição as larvas apresentavam alterações no fenótipo e no comportamento que não foram observadas no controlo, nomeadamente anomalias nas mudas, traqueias partidas, formação de massas melanóticas que podiam persistir até à fase adulta, excesso de gotículas lipídicas, atraso no desenvolvimento, comportamento de não alimentação e formação de pupa imatura que levava à formação de pupa precoce e morte pupal. Na fase pupal, as anomalias mais comuns estavam relacionadas com a forma do pupário (causadas pela pipação prematura), apresentando um desenvolvimento aberrante. Entre os vários fenótipos observados, o mais significativo foi o criptocefálico (alterações na eversão dos discos imaginais) levando à morte pupal. Nos adultos, as principais anomalias morfológicas foram registadas na formação e segmentação das patas, na forma e padrão das nervuras das asas e na formação do tórax. A similaridade destes resultados com trabalhos publicados relacionados com a hormona esteróide ecdisona indicam que provavelmente o PNTPA poderá ter influenciado a biossíntese e/ou a regulação da ecdisona, a principal hormona que regula o desenvolvimento e a metamorfose em Drosophila.

Os efeitos do plasma não térmico à pressão atmosférica no desenvolvimento larval e anomalias morfológicas de Drosophila Melanogaster

O plasma não térmico nos cuidados de saúde é um campo emergente que tem as suas raízes na ciência de plasmas. Este tipo de investigação tem crescido rapidamente e é agora objeto de um amplo esforço de pesquisa interdisciplinar envolvendo a medicina, a biologia, a física, a química e a engenharia. Têm sido feitos vários trabalhos de modo a elucidar quais as interações das espécies produzidas pelo plasma com os sistemas vivos. É evidente que o mecanismo da interação do plasma com os sistemas vivos é complexo, em parte devido à complexidade do plasma mas principalmente devido à enorme complexidade da biologia. O principal objetivo desta dissertação foi observar os efeitos do plasma não térmico à pressão atmosférica (PNTPAs) no desenvolvimento larval e anomalias morfológicas de Drosophila melanogaster. Para o efeito, foram expostas e analisadas fenotipicamente 2.566 larvas após exposição, dos diferentes estádios (1.º, 2.º e 3.º) de desenvolvimento. Os testes foram realizados com aplicações de plasma com e sem ultra violeta, em duas linhas diferentes de Drosophila; uma linha selvagem preparada por nós e uma linha laboratorial. A análise fenotípica revelou que após exposição as larvas apresentavam alterações no fenótipo e no comportamento que não foram observadas no controlo, nomeadamente anomalias nas mudas, traqueias partidas, formação de massas melanóticas que podiam persistir até à fase adulta, excesso de gotículas lipídicas, atraso no desenvolvimento, comportamento de não alimentação e formação de pupa imatura que levava à formação de pupa precoce e morte pupal. Na fase pupal, as anomalias mais comuns estavam relacionadas com a forma do pupário (causadas pela pipação prematura), apresentando um desenvolvimento aberrante. Entre os vários fenótipos observados, o mais significativo foi o criptocefálico (alterações na eversão dos discos imaginais) levando à morte pupal. Nos adultos, as principais anomalias morfológicas foram registadas na formação e segmentação das patas, na forma e padrão das nervuras das asas e na formação do tórax. A similaridade destes resultados com trabalhos publicados relacionados com a hormona esteróide ecdisona indicam que provavelmente o PNTPA poderá ter influenciado a biossíntese e/ou a regulação da ecdisona, a principal hormona que regula o desenvolvimento e a metamorfose em Drosophila.

Efeito do trans-resveratrol sobre a longevidade e o metabolismo de glicogênio de Drosophila melanogaster em diferentes idades

O trans-resveratrol é uma fitoalexina natural encontrada em uvas, amoras, amendoim e muitas espécies de plantas. Em uvas o trans-resveratrol é responsável pela proteção natural contra doenças e sua concentração depende da origem geográfica, da variedade e dos métodos de fabricação do vinho; sendo considerado por muitos autores como um geroprotetor. O objetivo do presente trabalho foi verificar o efeito do transresveratrol na longevidade e no metabolismo de carboidratos (glicogênio, atividade e expressão da enzima glicogênio fosforilase - GFT) de Drosophila melanogaster em diferentes idades (0, 7, 14, 18 e 21 dias). Para a análise da longevidade espécimes de D. melanogaster com idade de 10 dias foram colocados em vidros contendo meio de cultura padrão acrescido de água ou dimetilsulfóxido (DMSO) 0,03%, ou trans-resveratrol nas concentrações de 1, 10 ou 20μM para ovoposição durante 24 horas, a prole recebeu os seus respectivos tratamentos durante toda a vida. Para as análises do metabolismo de glicogênio os espécimes de D. melanogaster foram colocados em meio de cultura padrão adicionado de água ou dimetilsulfóxido 0,03% (DMSO) ou ainda, trans-resveratrol na concentração de 1μM dissolvido em DMSO (0,03%) para ovoposição; seus ovos foram mantidos até a eclosão, durante a fase adulta os animais continuaram a receber os seus respectivos tratamentos até os pontos em que foram feitas as determinações bioquímicas e moleculares. Os resultados indicam que o tratamento com trans-resveratrol modulou o metabolismo de carboidratos em fêmeas e em machos de forma diferenciada; contudo, este composto não foi capaz de alterar a expressão gênica da GFT. Nas fêmeas tratadas com trans-resveratrol 1μM verificou-se um aumento de 127% na longevidade quando comparado ao grupo controle. Já nos machos tratados com trans-resveratrol 1μM observou-se um acréscimo de 50% na longevidade quando comparado ao grupo controle. Em ambos sexos tratados com Trans-resveratrol 10 e 20μM não houve aumento significativo da longevidade. Com base nos resultados podemos sugerir que o trans-resveratrol como outros antioxidantes descritos na literatura tem seus efeitos benéficos na menor dose administrada, podendo nas doses mais elevadas estar atuando como um pró-oxidante. Os resultados obtidos sugerem que o trans-resveratrol modula o metabolismo do glicogênio tanto em machos como em fêmeas e aumenta a longevidade do modelo experimental testado.

Componentes do valor adaptativo e investigação do polimorfismo genético do gene Cyp6g1 (exons 1 e 2) em linhagens resistentes e suscetíveis de Drosophila melanogaster e de Drosophila simulans

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Efeito da Hidroxiuréia, uma substância de uso médico, sobre parâmetros biológicos de Drosophila melanogaster

Pós-graduação em Genética - IBILCE

Expression of Caenorhabditis elegans RNA-directed RNA polymerase in transgenic Drosophila melanogaster does not affect morphological development

Drosophila melanogaster, along with all insects and the vertebrates, lacks an RdRp gene. We created transgenic strains of Drosophila melanogaster in which the rrf-1 or ego-1 RdRp genes from C. elegans were placed under the control of the yeast GAL4 upstream activation sequence. Activation of the gene was performed by crossing these lines to flies carrying the GAL4 transgene under the control of various Drosophila enhancers. RT-PCR confirmed the successful expression of each RdRp gene. The resulting phenotypes indicated that introduction of the RdRp genes had no effect on D. melanogaster morphological development. © 2010 Springer Science+Business Media B.V.

Drosophila melanogaster mounts a unique immune response to the rhabdovirus Sigma virus

Rhabdoviruses are important pathogens of humans, livestock, and plants that are often vectored by insects. Rhabdovirus particles have a characteristic bullet shape with a lipid envelope and surface-exposed transmembrane glycoproteins. Sigma virus (SIGMAV) is a member of the Rhabdoviridae and is a naturally occurring disease agent of Drosophila melanogaster. The infection is maintained in Drosophila populations through vertical transmission via germ cells. We report here the nature of the Drosophila innate immune response to SIGMAV infection as revealed by quantitative reverse transcription-PCR analysis of differentially expressed genes identified by microarray analysis. We have also compared and contrasted the immune response of the host with respect to two nonenveloped viruses, Drosophila C virus (DCV) and Drosophila X virus (DXV). We determined that SIGMAV infection upregulates expression of the peptidoglycan receptor protein genes PGRP-SB1 and PGRP-SD and the antimicrobial peptide (AMP) genes Diptericin-A, Attacin-A, Attacin-B, Cecropin-A1, and Drosocin. SIGMAV infection did not induce PGRP-SA and the AMP genes Drosomycin-B, Metchnikowin, and Defensin that are upregulated in DCV and/or DXV infections. Expression levels of the Toll and Imd signaling cascade genes are not significantly altered by SIGMAV infection. These results highlight shared and unique aspects of the Drosophila immune response to the three viruses and may shed light on the nature of the interaction with the host and the evolution of these associations.

From actin monomers to bundles: The roles of twinfilin and α-actinin in Drosophila melanogaster development

The actin cytoskeleton is essential for a large variety of cell biological processes. Actin exists in either a monomeric or a filamentous form, and it is very important for many cellular functions that the local balance between these two actin populations is properly regulated. A large number of proteins participate in the regulation of actin dynamics in the cell, and twinfilin, one of the proteins examined in this thesis, belongs to this category. The second level of regulation involves proteins that crosslink or bundle actin filaments, thereby providing the cell with a certain shape. α-Actinin, the second protein studied, mainly acts as an actin crosslinking protein. Both proteins are conserved in organisms ranging from yeast to mammals. In this thesis, the roles of twinfilin and α-actinin in development were examined using Drosophila melanogaster as a model organism. Twinfilin is an actin monomer binding protein that is structurally related to cofilin. In vitro, twinfilin reduces actin polymerisation by sequestering actin monomers. The Drosophila twinfilin (twf) gene was identified and found to encode a protein functionally similar to yeast and mammalian twinfilins. A strong hypomorphic twf mutation was identified, and flies homozygous for this allele were viable and fertile. The adult twf mutant flies displayed reduced viability, a rough eye phenotype and severely malformed bristles. The shape of the adult bristle is determined by the actin bundles that are regularly spaced around the perimeter of the developing pupal bristles. Examination of the twf pupal bristles revealed an increased level of filamentous actin, which in turn resulted in splitting and displacement of the actin bundles. The bristle defect was rescued by twf overexpression in developing bristles. The Twinfilin protein was localised at sites of actin filament assembly, where it was required to limit actin polymerisation. A genetic interaction between twinfilin and twinstar (the gene encoding Cofilin) was detected, consistent with the model predicting that both proteins act to limit the amount of filamentous actin. α-Actinin has been implicated in several diverse cell biological processes. In Drosophila, the only function for α-actinin yet known is in the organisation of the muscle sarcomere. Muscle and non-muscle cells utilise different α-actinin isoforms, which in Drosophila are produced by alternative splicing of a single gene. In this work, novel α-actinin deletion alleles, including ActnΔ233, were generated, which specifically disrupted the transcript encoding the non-muscle α-actinin isoform. Nevertheless, ActnΔ233 homozygous mutant flies were viable and fertile with no obvious defects. By comparing α-actinin protein distribution in wild type and ActnΔ233 mutant animals, it could be concluded that non-muscle α-actinin is the only isoform expressed in young embryos, in the embryonic central nervous system and in various actin-rich structures of the ovarian germline cells. In the ActnΔ233 mutant, α-actinin was detected not only in muscle tissue, but also in embryonic epidermal cells and in certain follicle cell populations in the ovaries. The population of α-actinin protein present in non-muscle cells of the ActnΔ233 mutant is referred to as FC-α-actinin (Follicle Cell). The follicular epithelium in the Drosophila ovary is a well characterised model system for studies on patterning and morphogenesis. Therefore, α-actinin expression, regulation and function in this tissue were further analysed. Examination of the α-actinin localisation pattern revealed that the basal actin fibres of the main body follicle cells underwent an organised remodelling during the final stages of oogenesis. This involved the assembly of a transient adhesion site in the posterior of the cell, in which α-actinin and Enabled (Ena) accumulated. Follicle cells genetically manipulated to lack all α-actinin isoforms failed to remodel their cytoskeleton and translocate Ena to the posterior of the cell, while the actin fibres as such were not affected. Neither was epithelial morphogenesis disrupted. The reorganisation of the basal actin cytoskeleton was also disturbed following ectopic expression of Decapentaplegic (Dpp) or as a result of a heat shock. At late oogenesis, the main body follicle cells express both non-muscle α-actinin and FC-α-actinin, while the dorsal anterior follicle cells express only non-muscle α-actinin. The dorsal anterior cells are patterned by the Dpp and Epidermal growth factor receptor (EGFR) signalling pathways, and they will ultimately secrete the dorsal appendages of the egg. Experiments involving ectopic activation of EGFR and Dpp signalling showed that FC-α-actinin is negatively regulated by combined EGFR and Dpp signalling. Ubiquitous overexpression of the adult muscle-specific α-actinin isoform induced the formation of aberrant actin bundles in migrating follicle cells that did not normally express FC-α-actinin, provided that the EGFR signalling pathway was activated in the cells. Taken together, this work contributes new data to our knowledge of α-actinin function and regulation in Drosophila. The cytoskeletal remodelling shown to depend on α-actinin function provides the first evidence that α-actinin has a role in the organisation of the cytoskeleton in a non-muscle tissue. Furthermore, the cytoskeletal remodelling constitutes a previously undescribed morphogenetic event, which may provide us with a model system for in vivo studies on adhesion dynamics in Drosophila.

Stability of Adult Emergence and Activity/Rest Rhythms in Fruit Flies Drosophila melanogaster under Semi-Natural Condition

Here we report the results of a study aimed at examining stability of adult emergence and activity/rest rhythms under seminatural conditions (henceforth SN), in four large outbred fruit fly Drosophila melanogaster populations, selected for emergence in a narrow window of time under laboratory (henceforth LAB) light/dark (LD) cycles. When assessed under LAB, selected flies display enhanced stability in terms of higher amplitude, synchrony and accuracy in emergence and activity rhythms compared to controls. The present study was conducted to assess whether such differences in stability between selected and control populations, persist under SN where several gradually changing time-cues are present in their strongest form. The study revealed that under SN, emergence waveform of selected flies was modified, with even more enhanced peak and narrower gate-width compared to those observed in the LAB and compared to control populations in SN. Furthermore, flies from selected populations continued to exhibit enhanced synchrony and accuracy in their emergence and activity rhythms under SN compared to controls. Further analysis of zeitgeber effects revealed that enhanced stability in the rhythmicity of selected flies under SN was primarily due to increased sensitivity to light because emergence and activity rhythms of selected flies were as stable as controls under temperature cycles. These results thus suggest that stability of circadian rhythms in fruit flies D. melanogaster, which evolved as a consequence of selection for emergence in a narrow window of time under weak zeitgeber condition of LAB, persists robustly in the face of day-to-day variations in cycling environmental factors of nature.

Rhythmic egg-laying behaviour in virgin females of fruit flies Drosophila melanogaster

Fruit fly Drosophila melanogaster females display rhythmic egg-laying under 12: 12 h light/dark (LD) cycles which persists with near 24 h periodicity under constant darkness (DD). We have shown previously that persistence of this rhythm does not require the neurons expressing pigment dispersing factor (PDF), thought to be the canonical circadian pacemakers, and proposed that it could be controlled by peripheral clocks or regulated/triggered by the act of mating. We assayed egg-laying behaviour of wild-type Canton S (CS) females under LD, DD and constant light (LL) conditions in three different physiological states; as virgins, as females allowed to mate with males for 1 day and as females allowed to mate for the entire duration of the assay. Here, we report the presence of a circadian rhythm in egg-laying in virgin D. melanogaster females. We also found that egg-laying behaviour of 70 and 90% females from all the three male presence/absence protocols follows circadian rhythmicity under DD and LL, with periods ranging between 18 and 30 h. The egg-laying rhythm of all virgin females synchronized to LD cycles with a peak occurring soon after lights-off. The rhythm in virgins was remarkably robust with maximum number of eggs deposited immediately after lights-off in contrast to mated females which show higher egg-laying during the day. These results suggest that the egg-laying rhythm of D. melanogaster is endogenously driven and is neither regulated nor triggered by the act of mating; instead, the presence of males results in reduction in entrainment to LD cycles.