Variação da sensibilidade de populações de Phakopsora pachyrhizi a fungicidas inibidores da desmetilação no Brasil

Durante as safras 2008/09, 2009/10 e 2010/11 foi monitorada a sensibilidade do fungo Phakopsora pachyrhizi aos fungicidas tebuconazol, ciproconazol, metconazol e protioconazol (inibidores da desmetilação, IDMs). Folhas destacadas de soja foram tratadas com os fungicidas em doses variando de zero a 32 mg L-1 (tebuconazol, ciproconazol e metconazol) e zero a 8 mg L-1 (protioconazol) e inoculadas com esporos de P. pachyrhizi provenientes de lavouras de soja de diferentes regiões produtoras. As folhas inoculadas foram incubadas em placas de Petri com papel umedecido, a 23°C ± 2ºC, e a severidade da ferrugem estimada 15 dias após a inoculação. Foram determinadas as doses efetivas para reduzir 50% da severidade da doença (DE50). O fungicida protioconazol apresentou a maior atividade intrínseca, com valores de DE50 variando de 0,000001 mg L-1 a 0,39 mg L-1. Os valores de DE50variaram de 0,001 mg L-1 a 1,49 mg L-1 para tebuconazol; 0,001 mg L-1 a 3,27 mg L-1 para ciproconazol e 0,004 mg L-1 a 3,89 mg L-1 para metconazol. As medianas de DE50 para todos os fungicidas avaliados foram inferiores a 0,5 mg L-1, nas três safras. As correlações (r) entre as DE50 dos quatro fungicidas foram significativas (p<0,05), mostrando a existência de resistência cruzada entre os fungicidas. A variação nos valores de DE50 no monitoramento mostra uma coexistência de populações com diferentes níveis de sensibilidade aos IDMs no campo.

Evidencia de la presencia de histonas en trofozoitos de Entomoeba invadens

Tesis (Maestra en ciencias con especialidad en biología celular) U.A.N.L.

Efeitos da tricostatina A sobre a acetilação de histonas, proliferação celular e diferenciação de células tronco embrionárias murinas

Background: Embryonic stem cells are cells derived from early-stage embryos that are characterized by pluripotency and self-renewal capacity. The in vitro cultured murine embryonic stem cells can indefinitely propagate in an undifferentiated state in the presence of leukemia inhibitory factor (LIF). However, when stimulated, these cells can differentiate into cell lines derived from all three embryonic germ layers. The trichostatin A (TSA) is an epigenetic modifier agent and several studies have used the TSA to stimulate cellular differentiation. However, most of these studies only assessed one TSA concentration. Therefore, this study aimed to evaluate the effects of different TSA concentrations on histone hyperacetylation during in vitro cell differentiation of murine pluripotent embryonic stem cells, cultured with or without LIF, in the quest of to standardize their application on early cultures of embryonic stem cells.Materials, Methods & Results: Undifferentiated murine embryonic stem cells were plated in the presence of different TSA concentrations (0 nM, 15 nm, 50 nM and 100 nM) in the presence or absence of LIF. Thus, the treatments were evaluated in undifferentiated embryonic stem cells cultured in the presence of LIF (Control group: 0 nM LIF(+); Group 15 nM LIF+; Group 50 nM LIF+ and Group 100 nM LIF+), and in embryonic stem cells cultured in the absence of LIF (Control group: 0 nM LIF; Group 15 nM LIF(-); Group 50 nM LIF(-) and Group 100 nM LIF-). Treatment with TSA was performed for 24 h. After that the medium was replaced with fresh medium without TSA. Samples were collected at 0, 12, 24, 36 and 48 h after the beginning of the experiment. Three replicates were performed in each experimental group. The relative amount of Histone H3 lysine 9 acetylation was analyzed in all groups, as well as the cell proliferation in the embryonic stem cells cultured in the presence of LIF. In the control group (0 nM), the absence of LIF resulted in higher levels (P < 0.05) of H3lys9ac compared to the cultures supplemented with LIF. In the embryonic stem cells cultured in the presence of LIF, the 50 nM and 100 nM treatments resulted in higher levels (P < 0.05) of H3lys9ac when compared with 0 nM and 15 nM treatments. Evaluating the Hoechst area in the 0 nM group, it was observed that the number of cells increased (P < 0.05) according to the time of culture. Treatment with 15 nM also reflected a similar distribution, but the Hoechst area in 15 nM group was lower (P < 0.05) at 24 and 48h when compared to the observed in the control group. In the 100 nM treatment, was observed that the area of Hoechst was lower (P < 0.05) to that obtained in the control group at 12, 24 and 48h. In addition, it was observed that treatment with TSA induces greater cellular differentiation when compared to control groups in stem cells cultured in the presence of LIF as well as in the absence of LIF.Discussion: In the present study it was observed that TSA treatment increased the levels of histone acetylation in murine embryonic stem cells at a 50 nM concentration, making it possible to reduce the concentration recommended in the literature (100 nM). In addtion, it was concluded that the lower TSA concentrations utilized (15 nm and 50 nM) was less harmful to cellular proliferation than the 100 nM TSA concentration.

Efeito das condições de cultivo no remodelamento das histonas de embriões bovinos produzidos in vitro

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FCAV

Efeitos da hiperaceleração de histonas na diferenciação in vitro de células tronco embrionárias murinas

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efeitos do exercício voluntario na recuperação de hemissecção da medula espinhal: mudanças na rede perineuronal e acetilação de histonas

A prática regular de exercícios físicos previne e combate várias doenças ao longo do tempo, destacando-se como excelente ferramenta terapêutica para o tratamento de lesões no sistema nervoso central (SNC). Após uma transecção (completa ou incompleta/hemissecção) da medula espinhal, células gliais reativas secretam substâncias inibitórias à regeneração axonal como, por exemplo, as moléculas de proteoglicanas de sulfato de condroitina (PGSCs) que exercem papel importante na formação de uma barreira físico-química, chamada cicatriz glial, que impede o crescimento dos axônios danificados pela lesão. Pesquisas que envolvem modelo experimental de lesão da medula espinhal e reabilitação por exercício físico têm obtido promissores resultados. No entanto, os mecanismos fisiológicos e moleculares pelos quais promovem esses resultados positivos ainda são pouco conhecidos. O objetivo do presente trabalho foi analisar a recuperação da função motora da pata posterior após protocolo de exercício físico voluntario em modelo experimental de hemissecção da medula espinhal e investigar dois mecanismos moleculares envolvidos na recuperação funcional: a degradação de PGSCs nas redes perineuronais e acetilação de histonas. Para isso, vinte e quatro (24) ratos da linhagem Wistar (Rattus novergicus) foram utilizados e separados em 3 grupos (controle, treinados e não treinados). Com exceção do grupo controle, todos os animais foram habituados a rodas de corridas e em seguidas foram submetidos a uma cirurgia experimental de hemissecção da medula espinhal, na altura da 8a vertebra torácica. Nossos resultados demonstraram que o exercício voluntário em rodas de corrida após lesão experimental da medula espinhal promoveu recuperação da função motora da pata posterior afetada, porém não observamos diferenças qualitativas na acetilação de histonas e degradação de PGSCs entre os grupos.

Origens dos cromossomos B em espécies de Characidium (Characiformes, Crenuchidae) baseada em pintura cromossômica, sequências de rDNA e histonas

Pós-graduação em Ciências Biológicas (Genética) - IBB

Mecanismos de degradação de compostos de relevância biológica por radicais oxidantes

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Química, especialidade Química Orgânica

Transcriptional regulation of the mannosyltransferase-encoding gene pigm in inherited glycosylphosphatidylinositol (GPI) deficiency

RESUMO:O glicosilfosfatidilinositol (GPI) é um complexo glicolipídico utlizado por dezenas de proteínas, o qual medeia a sua ancoragem à superfície da célula. Proteínas de superfície celular ancoradas a GPI apresentam várias funções essenciais para a manutenção celular. A deficiência na síntese de GPI é o que caracteriza principalmente a deficiência hereditária em GPI, um grupo de doenças autossómicas raras que resultam de mutações nos genes PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO e PIGT, os quais sao indispensáveis para a biossíntese do GPI. Uma mutação pontual no motivo rico em GC -270 no promotor de PIGM impede a ligação do factor de transcrição (FT) Sp1 à sua sequência de reconhecimento, impondo a compactação da cromatina, associada à hipoacetilação de histonas, e consequentemente, impedindo a transcrição de PIGM. Desta forma, a adição da primeira manose ao GPI é comprometida, a síntese de GPI diminui assim como as proteínas ligadas a GPI à superficie das células. Pacientes com Deficiência Hereditária em GPI-associada a PIGM apresentam trombose e epilesia, e ausência de hemólise intravascular e anemia, sendo que estas duas últimas características definem a Hemoglobinúria Paroxística Nocturna (HPN), uma doença rara causada por mutações no gene PIGA. Embora a mutação que causa IGD seja constitutiva e esteja presente em todos os tecidos, o grau de deficiência em GPI varia entre células do mesmo tecido e entre células de tecidos diferentes. Por exemplo nos granulócitos e linfócitos B a deficiência em GPI é muito acentuada mas nos linfócitos T, fibroblastos, plaquetas e eritrócitos é aproximadamente normal, daí a ausência de hemólise intravascular. Os eventos transcricionais que estão na base da expressão diferencial da âncora GPI nas células hematopoiéticas são desconhecidos e constituem o objectivo geral desta tese. Em primeiro lugar, os resultados demonstraram que os níveis de PIGM mRNA variam entre células primárias hematopoiéticas normais. Adicionalmente, a configuração dos nucleossomas no promotor de PIGM é mais compacta em células B do que em células eritróides e tal está correlacionado com os níveis de expressão de PIGM, isto é, inferior nas células B. A presença de vários motivos de ligação para o FT específico da linhagem megacariocítica-eritróide GATA-1 no promotor de PIGM sugeriu que GATA-1 desempenha um papel regulador na sua transcrição. Os resultados mostraram que muito possivelmente GATA-1 desempenha um papel repressor em vez de activador da expressão de PIGM. Resultados preliminares sugerem que KLF1, um factor de transcrição restritamente eritróide, regula a transcrição de PIGM independentemente do motivo -270GC. Em segundo lugar, a investigação do papel dos FTs Sp demonstrou que Sp1 medeia directamente a transcrição de PIGM em ambas as células B e eritróide. Curiosamente, ao contrário do que acontece nas células B, em que a transcrição de PIGM requer a ligação do FT geral Sp1 ao motivo -270GC, nas células eritróides Sp1 regula a transcrição de PIGM ao ligar-se a montante e não ao motivo -270GC. Para além disso, demonstrou-se que Sp2 não é um regulador directo da transcrição de PIGM quer nas células B quer nas células eritróides. Estes resultados explicam a ausência de hemólise intravascular nos doentes com IGD associada a PIGM, uma das principais características que define a HPN. Por último, resultados preliminares mostraram que a repressão da transcrição de PIGM devida à mutação patogénica -270C>G está associada com a diminuição da frequência de interacções genómicas em cis entre PIGM e os seus genes “vizinhos”, sugerindo adicionalmente que a regulação de PIGM e desses genes é partilhada. No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese contribuem para o conhecimento do controlo transcricional de um gene housekeeping, específico-detecido, por meio de FTs genéricos e específicos de linhagem.-------------ABSTRACTC: Glycosylphosphatidylinositol (GPI) is a complex glycolipid used by dozens of proteins for cell surface anchoring. GPI-anchored proteins have various functions that are essential for the cellular maintenance. Defective GPI biosynthesis is the hallmark of inherited GPI deficiency (IGD), a group of rare autosomal diseases caused by mutations in PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO and PIGT, all genes indispensable for GPI biosynthesis. A point mutation in the -270GC-rich box in the core promoter of PIGM disrupts binding of the transcription factor (TF) Sp1 to it, imposing nucleosome compaction associated with histone hypoacetylation, thus abrogating transcription of PIGM. As a consequence of PIGM transcriptional repression, addition of the first mannose residue onto the GPI core and thus GPI production are impaired; and expression of GPI-anchored proteins on the surface of cells is severely impaired. Patients with PIGM-associated IGD suffer from life-threatening thrombosis and epilepsy but not intravascular haemolysis and anaemia, two defining features of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH), a rare disease caused by somatic mutations in PIGA. Although the disease-causing mutation in IGD is constitutional and present in all tissues, the degree of GPI deficiency is variable and differs between cells of the same and of different tissues. Accordingly, GPI deficiency is severe in granulocytes and B cells but mild in T cells, fibroblasts, platelets and erythrocytes, hence the lack of intravascular haemolysis.The transcriptional events underlying differential expression of GPI in the haematopoietic cells of PIG-M-associated IGD are not known and constitute the general aim of this thesis. Firstly, I found that PIGM mRNA levels are variable amongst normal primary haematopoietic cells. In addition, the nucleosome configuration in the promoter of PIGM is more compacted in B cells than in erythroid cells and this correlated with the levels of PIGM mRNA expression, i.e., lower in B cells. The presence of several binding sites for GATA-1, a mega-erythroid lineage-specific transcription factor (TF), at the PIGM promoter suggested that GATA-1 has a role on PIGM transcription. My results showed that GATA-1 in erythroid cells is most likely a repressor rather than an activator of PIGM expression. Preliminary data suggested that KLF1, an erythroid-specific TF, regulates PIGM transcription but independently of the -270GC motif. Secondly, investigation of the role of the Sp TFs showed that Sp1 directly mediates PIGM transcriptional regulation in both B and erythroid cells. However, unlike in B cells in which active PIGM transcription requires binding of the generic TF Sp1 to the -270GC-rich box, in erythroid cells, Sp1 regulates PIGM transcription by binding upstream of but not to the -270GC-rich motif. Additionally, I showed that Sp2 is not a direct regulator of PIGM transcription in B and erythroid cells. These findings explain lack of intravascular haemolysis in PIGM-associated IGD, a defining feature of PNH. Lastly, preliminary work shows that transcriptional repression of PIG-M by the pathogenic -270C>G mutation is associated with reduced frequency of in cis genomic interactions between PIGM and its neighbouring genes, suggesting a shared regulatory link between these genes and PIGM. Altogether, the results presented in this thesis provide novel insights into tissuespecific transcriptional control of a housekeeping gene by lineage-specific and generic TFs.

Regulação epigenética de um gene de resposta a stress de frio em arroz (OsDREB1B)

O arroz (Oryza sativa L.) constitui a principal fonte de alimento para mais de metade da população mundial. O frio tem um grande impacto no desenvolvimento da planta de arroz com efeitos negativos ao nível da produtividade e economia mundial. Os mecanismos epigenéticos associados a alterações estruturais da cromatina estão envolvidos nos mecanismos de resposta das plantas a stresses abióticos. O foco do presente trabalho consistiu na compreensão da influência de fatores epigenéticos, nomeadamente de modificações de histonas, na regulação transcricional de um gene específico (OsDREB1B) envolvido na resposta de arroz ao stress de frio. O estudo da regulação epigenética deste gene envolveu a utilização de plantas de arroz com mutações em enzimas epigenéticas e drogas remodeladoras da cromatina. Neste trabalho mostramos que o gene OsDREB1B é induzido pelo stress de frio (4 °C) em todas os genótipos de arroz analisados, no entanto, a indução do gene em resposta ao stress de frio é maior em Nipponbare que em Dongjin. Nos genótipos que apresentam epimutações, nomeadamente o knockout de osdrm2 (DMT706) e de oshac704 (HAC704), o gene OsDREB1B é mais expresso que no respetivo genótipo selvagem (Dongjin), sendo que a indução da expressão em resposta ao frio foi maior em DMT706 do que em HAC704. A análise do padrão de marcas histónicas ao longo do promotor de OsDREB1B, através da imunoprecipitação da cromatina (ChIP) com anticorpos específicos, revelou que, em resposta ao frio (4ºC), Dongjin apresenta uma menor predominância da marca H3K9ac na região de -519 a -355 pares de bases (antes do ATG), enquanto que Nipponbare possui maior presença de H4K5ac na região de -280 a -121 pares de bases, sugerindo que a regulação epigenética de OsDREB1B seja influenciada pelo genótipo. No caso dos epi-mutantes (HAC704 e DMT706) registou-se um empobrecimento das marcas histónicas testadas sugerindo que a indução da expressão do OsDREB1B em reposta ao stress provocado pelo frio não depende necessariamente da presença de OsDRM2 nem de OsHAC704. Uma visão integrada da paisagem epigenética e do transcriptoma, perspetiva uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta da planta a condições ambientais adversas, abrindo novas linhas de trabalho no sentido de obter plantas mais tolerantes a fatores de stress.

Study of the retinoic acid regulated genes in the rodent hypothalamus controlling growth and appetite and the potential for the epigenetic control

Dissertação de mestrado em Bioquímica (área de especialização em Biomedicina)

The role of macroH2A1 in prostate carcinogenesis

Dissertação de mestrado em Genética Molecular

ARN helicasas en dos procesos de desarrollo: variación antigénica y enquistamiento de giardia lamblia.

Además de su importancia médica y veterinaria al ser una de las mayores causas de enfermedad intestinal con origen en el consumo de agua, Giardia es un excelente modelo para estudiar la evolución de importantes procesos celulares, ya que es una de las células eucariotas más primitivas que se conocen. Giardia utiliza dos mecanismos de adaptación a los cambios ambientales que confronta durante su ciclo de vida, ya sea para sobrevivir dentro del intestino del huésped como es la variación de sus antígenos de superficie, o fuera del mismo como es la diferenciación a quiste o enquistamiento. El Objetivo General de nuestro proyecto de investigación es el de comprender los mecanismos de adaptación y diferenciación celular en Giardia lamblia y utilizar esos conocimientos para el desarrollo de metodologías que permitan evitar la enfermedad y/o la transmisión del parásito así como también para definir nuevas técnicas diagnósticas. Las ARN Helicasas están presentes en muchas Archaea, casi todas las Eubacterias y todos los organismos eucariotas, y son necesarias o están involucradas en muchos procesos diferentes del metabolismo del ARN. En células eucariotas se las ha asociado desde la transcripción hasta la degradación del ARN, incluyendo pre-ARNm splicing, exportación del ARNm, biogénesis del ribosoma, iniciación de la traducción y expresión génica en organelas. Resultados previos indican que el mecanismo por el cual Giardia regula la expresión de sus proteínas variables de superficie es a nivel post-transcripcional, utilizando un mecanismo similar a ARN de interferencia. La presencia de los complejos de doble hebra de ARN promueve la acción de ARN Helicasas y ARNasas III que cortan el dsRNA en fragmentos cortos de 21-23 nt. Sin dudas ésta es la primera evidencia de un mecanismo de este tipo que participa fisiológicamente en la regulación génica diferencial. Por otro lado, se ha descripto la interacción de helicasas con deacetilasas de histonas (HDAC), las cuales según estudios realizados en nuestro laboratorio estarían involucradas en la regulación epigenética de la variación antigénica y el enquistamiento. Se busca por lo tanto comprender la participación de ARN Helicasas en ambos procesos de adaptación del parásito, evaluando el grado e importancia de las mismas. En particular se focalizará en la localización subcelular, la interacción con otros componentes de la maquinaria regulatoria y determinación de los dominios involucrados, como también la relación entre sus niveles de expresión y los diferentes fenotipos asociados a estos procesos de adaptación del parásito.

Mecanismos epigenéticos involucrados en regulación génica específica durante los procesos de diferenciación del protozoario intestinal giardia lamblia.

Se define como epigenética al área de la genética que estudia todos aquellos cambios heredables que no se encuentran determinados en la secuencia primaria del ADN (Albert y col., 2002). Los cambios epigenéticos son variados; los más conocidos son la metilación de bases nitrogenadas (que no existe en Giardia; Prucca y col., 2008), las modificaciones post-traduccionales de histonas y los Complejos de Remodelación de Cromatina. En los últimos años se ha avanzado en el estudio de la regulación de la expresión de genes mediante estos procesos. El mecanismo de ARNi está íntimamente relacionado con la modificaciones post-traduccionales de histonas; regulando la estructura de cromatina y permitiendo que los complejos primarios de transcripción de genes puedan o no expresar la información. Nuestra hipótesis de trabajo se basa en que cambios epigenéticos están involucrados en la regulación génica específica durante los procesos de adaptación y diferenciación de Giardia. Para responder la misma se plantean los siguientes objetivos específicos: 1. Identificar modificaciones de histonas y su relación con los procesos de diferenciación celular en Giardia. 2. Caracterizar enzimas involucradas en las modificaciones post-traduccionales de histonas. 3. Determinar qué tipo de modificaciones participan en la activación o silenciamiento de la expresión de genes específicos. 4. Manipular al parásito para aumentar o disminuir las modificaciones epigenéticas que pueden estar involucradas en los procesos de diferenciación a quiste o en la variación antigénica para una mayor comprensión de los mecanismos moleculares involucrados. 5. Determinar el estado redox de Giardia durante el enquistamiento y la variación antigénica. 6. Participación de ARN-helicasas en los Complejos Remodeladores de Cromatina.

As proteínas núcleares nos seláceos

São estudadas as reações químicas e fisico-químocas de uma proteina extraida do esperma de peixes dos gêneros Carcharias, Raf. e Galeocerdo, Ranz. Parece tratar-se de histonas, tendo em vista os resultados obtidos.