Charakterisierung und funktionelle Analyse verschiedener Isoformen von Clusterin (Apolipoprotein J)

Clusterin (CLU), auch bekannt unter dem Namen Apolipoprotein J (ApoJ), wird von Zellen als hetreodimeres Glykoprotein exprimiert und in den extrazellulären Raum sezerniert. Es wird daher auch als sezerniertes CLU (sCLU) bezeichnet. Neben sCLU sind auch nicht-sezernierte Isoformen von CLU bekannt, die in der vorliegenden Arbeit erforscht wurden. Ziel dabei war es, die Expression, die Biogenese, sowie die Funktion dieser Proteine zu ergründen. Nicht-sezernierte CLU-Formen werden ausschließlich von Zellen exprimiert, die zuvor einer Stresssituation ausgesetzt wurden. Dies konnte insbesondere durch Kultur verschiedener Zelllinien bei erhöhter Temperatur oder durch Behandlung mit dem Proteasominhibitor MG 132 demonstriert werden, worauf neben sCLU auch 50 kDa bzw. 45 kDa große, nicht-sezernierte CLU-Proteine in geringen Mengen exprimiert wurden. Bezüglich der Biogenese dieser Proteine wurden mehrere Hypothesen bzw. Mechanismen diskutiert und in dieser Arbeit untersucht: alternative Translationsstartpunkte auf verschiedenen mRNAs, alternatives Splicing einzelner mRNAs sowie Retrotranslokation oder Mistranslokation von sCLU-Vorläuferproteinen. Um die Hypothesen eruieren zu können, musste zuerst eine Expressionsanalyse der bekannten CLU-mRNAs durchgeführt werden. Über 5’-RACE, semi-quantitative und quantitative PCRs wurde die Expression von vier CLU-mRNAs sowie deren Induktion auf Zellstress hin festgestellt. Variante 1 (BP211675) ist die dominante CLU-mRNA und macht über 99,5 % an CLU-mRNA in unbehandelten sowie in gestressten Zellen aus. Des Weiteren sind geringste Mengen der mRNA-Varianten 2 und 3 (NR_038335.1 und NR_045494.1) detektiert worden, deren Sequenzen sich lediglich in ihrem alternativen Exon 1 von Variante 1 unterscheiden. Schließlich konnte die Expression von Variante 1 [Δex2] festgestellt werden, welcher durch alternatives Splicing, i.e. Exon-skipping, das Exon 2 mit der ER-Signalsequenz-codierenden Region (SSCR) fehlt. HEK 293-Zellen, die transient mit je einer der rekombinanten CLU-mRNAs in Form rekombinanter cDNA transfiziert wurden, exprimierten neben großen Mengen sCLU auch geringe Mengen an den nicht-sezernierten CLU-Isoformen. Die anschließend durchgeführten in vitro Mutagenesen belegen, dass alle Isoformen ausgehend von distinkten Translationsstartpunkten aus synthetisiert werden. CLU1-449 (50 kDa) wird als prä-Proprotein von sCLU ausgehend von einem Startcodon auf Exon 2 unmittelbar vor der SSCR translatiert. Unter Zellstress-Bedingungen kann es zu einer Mistranslokation während der co-translationalen Translokation kommen, sodass Teile von CLU1-449 im Cytosol akkumulieren. CLU21-449 (50 kDa) wird ausgehend von einem CUG-Startcodon downstream der SSCR über interne Translationsinitiation gebildet. Analoges gilt für CLU34-449 (45 kDa), welches von einem AUG-Startcodon auf Exon 3 translatiert wird. CLU34-449 ist außerdem die einzige CLU-Form die von Variante 1 [Δex2] codiert wird. Somit konnten drei der in der Literatur postulierten Mechanismen zur Ent-stehung nicht-sezernierter CLU-Isoformen in gestressten Zellen verifiziert werden. Die Mistranslokation von sCLU-Vorläuferproteinen, welche entscheidend zum Auftreten der nicht-sezernierten CLU-Formen beiträgt, die Alternative Translationsinitiation an distinkten Startcodons sowie das alternative Splicing von CLU-mRNA-Variante 1. Weiterführende Experimente bestätigten, dass alle nicht-sezernierten CLU-Isoformen im Cytosol der Zellen lokalisiert sind und keine Glykosylierungen tragen. Somit konnte ein weiterer, in der Literatur kontrovers diskutierter Punkt bezüglich dieser Proteine geklärt werden. Abschließend wurde die physiologische Funktion der einzelnen CLU-Isoformen analysiert. Dabei zeigte sich, dass ausschließlich sCLU eine Chaperonaktivität zukommt, die es ermöglicht, durch Hitze denaturierte Zielproteine in Lösung zu halten. Diese Funktion konnte nicht für die cytosolischen Iso¬formen bestätigt werden. Weiterhin konnte keine Auswirkung einzelner CLU-Formen auf die intrinsische Apoptose oder auf den NF κB-vermittelten Signaltransduktionsweg festgestellt werden, obgleich entsprechende Einflüsse von anderen Arbeitsgruppen postuliert wurden. Die hier gemachten Beobachtungen werfen daher die Frage auf, ob den nicht-sezernierten, cytosolischen CLU-Isoformen überhaupt eine physiologische Funktion zukommt und stellen aktuelle Hypothesen bezüglich der Rolle von CLU bei pathophysiologischen Prozessen infrage.

Untersuchung der räumlichen Expression und subzellulären Lokalisation von CtBP1/BARS50- und CtBP2-Isoformen im adulten Nagerhirn

Magdeburg, Univ., Fak. für Naturwiss., Diss., 2012

Clusterin in neurological disorders: molecular perspectives and clinical relevance.

Firstly discovered in rete testis fluid, clusterin is a glycoprotein present in most of the other biological fluids. Several isoforms of clusterin are encoded from a single gene located on chromosome 8 in human species. Among the different isoforms, the secreted form of clusterin is expressed by a variety of tissues, including the nervous system under normal conditions. This form is presumed to play an anti-apoptotic role and seems to be a major determinant in cell survival and neuroplasticity after stroke. In animal models of this pathology, both neuronal and astroglial subpopulations express high levels of clusterin early after the ischemic damage. Recent lines of evidence point also to its possible involvement in neurodegenerative disorders. It is thought that in Alzheimer's disease the association between amyloidogenic peptides and clusterin contributes to limit Aβ species misfolding and facilitates their clearance from the extracellular space. Thus, intercellular and intracellular factors that modulate local clusterin expression in the nervous system may represent potent targets for neurodegenerative disease therapies. In this review we provide a critical overview of the most recent data on the involvement of clusterin in neurodegenerative diseases with special reference to their putative clinical relevance.

Untersuchungen zur Rolle von Isoformen katalytischer Untereinheiten der PKA

ZUSAMMENFASSUNG: Proteinkinasen übernehmen zentrale Aufgaben in der Signaltransduktion höherer Zellen. Dabei ist die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) bezüglich ihrer Struktur und Funktion eine der am besten charakterisierten Proteinkinasen. Trotzdem ist wenig über direkte Interaktionspartner der katalytischen Untereinheiten (PKA-C) bekannt. In einem Split-Ubiquitin basiertem Yeast Two Hybrid- (Y2H-)System wurden potenzielle Interaktionspartner der PKA-C identifiziert. Als Bait wurden sowohl die humane Hauptisoform Cα (hCα) als auch die Proteinkinase X (PrKX) eingesetzt. Nach der Bestätigung der Funktionalität der PKA-C-Baitproteine, dem Nachweis der Expression und der Interaktion mit dem bekannten Interaktionspartner PKI wurde ein Y2H-Screen gegen eine Mausembryo-cDNA-Expressionsbibliothek durchgeführt. Von 2*10^6 Klonen wurden 76 Kolonien isoliert, die ein mit PrKX interagierendes Preyprotein exprimierten. Über die Sequenzierung der enthaltenen Prey-Vektoren wurden 25 unterschiedliche, potenzielle Interaktionspartner identifiziert. Für hCα wurden über 2*10^6 S. cerevisiae-Kolonien untersucht, von denen 1.959 positiv waren (1.663 unter erhöhter Stringenz). Über die Sequenzierung von ca. 10% der Klone (168) konnten Sequenzen für 67 verschiedene, potenzielle Interaktionspartner der hCα identifiziert werden. 15 der Preyproteine wurden in beiden Screens identifiziert. Die PKA-C-spezifische Wechselwirkung der insgesamt 77 Preyproteine wurde im Bait Dependency Test gegen largeT, ein Protein ohne Bezug zum PKA-System, untersucht. Aus den PKA-C-spezifischen Bindern wurden die löslichen Preyproteine AMY-1, Bax72-192, Fabp3, Gng11, MiF, Nm23-M1, Nm23-M2, Sssca1 und VASP256-375 für die weitere in vitro-Validierung ausgewählt. Die Interaktion von FLAG-Strep-Strep-hCα (FSS-hCα) mit den über Strep-Tactin aus der rekombinanten Expression in E. coli gereinigten One-STrEP-HA-Proteinen (SSHA-Proteine) wurde über Koimmunpräzipitation für SSHA-Fabp3, -Nm23-M1, -Nm23-M2, -Sssca1 und -VASP256-375 bestätigt. In SPR-Untersuchungen, für die hCα kovalent an die Oberfläche eines CM5-Sensorchips gekoppelt wurde, wurden die ATP/Mg2+-Abhängigkeit der Bindungen sowie differentielle Effekte der ATP-kompetitiven Inhibitoren H89 und HA-1077 untersucht. Freie hCα, die vor der Injektion zu den SSHA-Proteinen gegeben wurde, kompetierte im Gegensatz zu FSS-PrKX die Bindung an die hCα-Oberfläche. Erste kinetische Analysen lieferten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten im µM- (SSHA-Fabp3, -Sssca1), nM- (SSHA-Nm23-M1, –M2) bzw. pM- (SSHA-VASP256-375) Bereich. In funktionellen Analysen konnte eine Phosphorylierung von SSHA-Sssca1 und VASP256-375 durch hCα und FSS-PrKX im Autoradiogramm nachgewiesen werden. SSHA-VASP256-375 zeigte zudem eine starke Inhibition von hCα im Mobility Shift-Assay. Dieser inhibitorische Effekt sowie die hohe Affinität konnten jedoch auf eine Kombination aus der Linkersequenz des Vektors und dem N-Terminus von VASP256-375 zurückgeführt werden. Über die Wechselwirkungen der hier identifizierten Interaktionspartner Fabp3, Nm23-M1 und Nm23-M2 mit hCα können in Folgeuntersuchungen neue PKA-Funktionen insbesondere im Herzen sowie während der Zellmigration aufgedeckt werden. Sssca1 stellt dagegen ein neues, näher zu charakterisierendes PKA-Substrat dar.

Molekulare Charakterisierung der Centrin-Isoformen in der Retina von Säugetieren

Centrine sind Mitglieder einer hoch konservierten Überfamilie von Ca2+-bindenden Proteinen mit EF-Hand Motiven. Bislang sind vier Centrin-Isoformen bei Säugern beschrieben worden, die in diversen Zellen in der Regel mit Centriolen von Centrosomen oder Centrosomen-verwandten Strukturen assoziiert sind. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die vier Centrin-Isoformen bezüglich der Expression in verschiedenen Geweben untersucht. Dabei lag der Hauptfokus auf Untersuchungen der Centrine in den Photorezeptorzellen der Retina. Analysen auf subzellulärer Ebene brachten Klarheit über die differenzielle Lokalisation der verschiedenen Isoformen in der Retina. Mit Hilfe von verschiedenen Methoden konnten Wechselwirkungspartner in der Retina identifiziert werden, die eine Rolle in der visuellen Signaltransduktionskaskade spielen. Dabei könnten Centrine einem Regelmechanismus angehören, der wichtige Translokationsprozesse dieser Proteine regelt. In den Photorezeptorzellen der Säugetierretina werden die vier Isoformen exprimiert, die in den Strukturen des Cilienapparates differenziell lokalisiert sind. Dabei beschränkt sich ihre Lokalisation entweder auf den Basalkörper (Centrin 4), auf das Verbindungscilium (Centrin 1) oder sie sind in beiden Strukturen zu finden (Centrin 2 und 3). In den nicht- Photorezeptorzellen der Retina sind die Isoformen Centrin 2 und 3 zudem an den Centriolen der Centrosomen lokalisiert. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass alle Centrin-Isoformen in ein und derselben Zelle, der Photorezeptorzelle, koexprimiert werden und dabei subzellulär kolokalisiert sind. Im Weiteren konnte die ubiquitäre Expression von Centrin 2 und 3 in allen untersuchten Geweben an Centrosomen bestätigt werden. Centrin 1 und 4 hingegen werden nur in Geweben mit Cilien-tragenden Zellen exprimiert. Die Funktion der Centrine wird nicht nur durch Bindung von Ca2+, sondern auch durch Phosphorylierungen reguliert. Alle Sequenzen der Centrine weisen diverse mögliche Phosphorylierungsstellen für unterschiedliche Proteinkinasen auf. Die Ergebnisse aller durchgeführten in vitro und ex vivo Phosphorylierungs „Assays“ zeigen eine licht-abhängige Phosphorylierung der Centrin-Isoformen in der Retina. Dabei war in der dunkel-adaptierten Retina die Phosphorylierung vor allem von Centrin 1 und 2 erhöht. Weiterführende Experimente mit Kinase-Inhibitoren wiesen darauf hin, dass vor allem die Proteinkinase CKII eine bedeutende Rolle bei der Centrin-Phosphorylierung in der Retina einnimmt. Centrine sind die ersten Cytoskelettkomponenten, deren Phosphorylierungsgrad lichtabhängig moduliert wird. Diese Ergebnisse weisen auf einen Signalweg, der zwischen der visuellen Signaltransduktionskaskade und der Regulation der Centrin-Aktivität vermittelt, hin. Bei der Suche nach Centrin-Bindungspartnern gelang mit Hilfe von Centrin 1 Blot „Overlay Assays“ der Durchbruch. Der neuartige Ansatz zeigte, dass ausschließlich Ca2+-aktiviertes Centrin 1 mit Proteinen aus der Retina interagierte. Nach der Identifikation eines 37 kDa-Proteins als die β-Untereinheit des visuellen G-Proteins Transducin wurden die Untersuchungen auf diesen Interaktionspartner fokussiert. Die Ergebnisse der hier durchgeführten biochemischen und biophysikalischen Protein-Protein Interaktionsexperimente zeigen insgesamt folgendes: ⇒ Alle vier Centrine interagieren mit Transducin, wobei Centrin 3 die geringste Affinität zu Transducin hat. ⇒ Die Assemblierung der Centrin•G-Protein-Komplexe ist strikt Ca2+-abhängig. ⇒ Die Centrine binden sowohl an das isolierte Gtβγ-Heterodimer als auch an den heterotrimeren Gt-holo-Proteinkomplex, nicht aber an Gtα. Die quantitativen immunoelektronenmikroskopischen Analysen zeigen im Weiteren, dass sich die Komplexe aus Transducin und Centrin 1 bis 3 wahrscheinlich in einer Subdomäne des Verbindungsciliums der Photorezeptorzellen ausbilden. Dabei dürfte die Ausbildung der Komplexe an der Regulation der lichtinduzierten Translokation von Transducin zwischen Innen- und Außensegment der Photorezeptorzellen beteiligt sein. Dieser Translokationsmechanismus wird als ein wichtiger Bestandteil der Langzeitadaption der Signaltransduktionskaskade der Säugerretina diskutiert. Der neuartige Regelmechanismus der molekularen Translokationen, in dem Centrine involviert sind, ist außergewöhnlich und dürfte über die speziellen Photorezeptorzellen hinaus von weit reichender Bedeutung sein.

Charakterisierung funktioneller Domänen von Centrin-Isoformen

Centrine sind kleine Ca2+-bindende Proteine aus der Familie der EF-Hand Proteine. Erstmals wurden Centrine als Hauptbestandteil der kontraktilen Flagellenwurzeln von Grünalgen beschrieben. Mittlerweile konnten Centrine in nahezu allen eukaryotischen Organismen nachgewiesen werden. In Säugetieren wurden bis zu vier Isoformen identifiziert, die an Centrosomen oder davon abgeleiteten Strukturen, wie Spindelpolkörpern und Basalkörper, aber auch in Übergangszonen von Cilien exprimiert werden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Centrine im zellulären Kontext der Photorezeptorzellen nicht nur durch die Bindung von Ca2+ reguliert werden, sondern auch durch reversible Phosphorylierungen. Die Phosphorylierung der Centrin-Isoformen findet in der Retina von Vertebraten lichtabhängig während der Dunkeladaption statt. Die Protein Kinase CK2 (CK2) ist für die beschriebenen lichtabhängigen Phosphorylierungen hauptverantwortlich. Obwohl alle Centrin-Isoformen mehrere mögliche Zielsequenzen für die CK2 besitzen, kommt es nur zur Phosphorylierung einer einzigen Aminosäure in Cen1p, Cen2p und Cen4p. Im Gegensatz dazu stellt die Isoform Cen3p kein Substrat für die CK2 dar. Zudem wurden hier erstmals Phosphatasen identifiziert, die in der Lage sind Centrine zu dephosphorylieren. Die Dephosphorylierung durch die PP2Cund PP2C ist sehr spezifisch, da keine andere Phosphatase der Retina die CK2-vermittelte Phosphorylierung der Centrine rückgängig machen kann. Hoch auflösende licht- und elektronenmikroskopische Analysen zeigten erstmals, dass die Centrine sowohl mit der CK2 als auch mit der PP2C im Verbindungscilium der Photorezeptorzellen colokalisiert sind. Cen1p und CK2 sind in der Lage, direkt an Mikrotubuli zu binden, was die notwendige räumliche Nähe zwischen Enzymen und Substrat herstellt. Bisherige Arbeiten zeigten, dass alle Centrine Ca2+-abhängig mit dem visuellen G-Protein Transducin interagieren. Diese Wechselwirkung dürfte an der Regulation der lichtabhängigen Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Außen- und dem Innensegment der Photorezeptorzelle beteiligt sein. In der vorliegenden Arbeit zeigten Interaktionsstudien, dass die Bindungsaffinitäten der Centrine für Transducin durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung drastisch verringert wurden. Dieser beobachtete Effekt beruht auf deutlich verringerten Ca2+-Affinitäten der Centrin-Isoformen nach der CK2-vermittelten Phosphorylierung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiger Regulationsmechanismus der Centrine in den Photorezeptorzellen der Vertebraten beschrieben. Centrine werden nicht nur durch Ca2+-Bindung zur Bildung von Protein Komplexen stimuliert, sondern durch die Phosphorylierung zum Auflösen dieser Komplexe angeregt. Damit reguliert die CK2-vermittelte, lichtabhängige Phosphorylierung der Centrine möglicherweise ebenfalls die adaptive Translokation des visuellen G-Proteins Transducin zwischen dem Außen- und Innensegment der Photorezeptorzellen.

Transthyretin Amyloidosis: Chaperone Concentration Changes and Increased Proteolysis in the Pathway to Disease

Transthyretin amyloidosis is a conformational pathology characterized by the extracellular formation of amyloid deposits and the progressive impairment of the peripheral nervous system. Point mutations in this tetrameric plasma protein decrease its stability and are linked to disease onset and progression. Since non-mutated transthyretin also forms amyloid in systemic senile amyloidosis and some mutation bearers are asymptomatic throughout their lives, non-genetic factors must also be involved in transthyretin amyloidosis. We discovered, using a differential proteomics approach, that extracellular chaperones such as fibrinogen, clusterin, haptoglobin, alpha-1-anti-trypsin and 2-macroglobulin are overrepresented in transthyretin amyloidosis. Our data shows that a complex network of extracellular chaperones are over represented in human plasma and we speculate that they act synergistically to cope with amyloid prone proteins. Proteostasis may thus be as important as point mutations in transthyretin amyloidosis.

Role of gene methylation in antitumor immune response: Implication for tumor progression

Cancer immunosurveillance theory has emphasized the role of escape mechanisms in tumor growth. In this respect, a very important factor is the molecular characterization of the mechanisms by which tumor cells evade immune recognition and destruction. Among the many escape mechanisms identified, alterations in classical and non-classical HLA (Human Leucocyte Antigens) class I and class II expression by tumor cells are of particular interest. In addition to the importance of HLA molecules, tumor-associated antigens and accessory/co-stimulatory molecules are also involved in immune recognition. The loss of HLA class I antigen expression and of co-stimulatory molecules can occur at genetic, transcriptional and post-transcriptional levels. Epigenetic defects are involved in at least some mechanisms that preclude mounting a successful host-antitumor response involving the HLA system, tumor-associated antigens, and accessory/co-stimulatory molecules. This review summarizes our current understanding of the role of methylation in the regulation of molecules involved in the tumor immune response.

Novel multicast protocols in ad-hoc networks

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Regenerative potential of corneal endothelium from patients with fuchs endothelial corneal dystrophy

La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques.

Biochemische und Zellbiologische Charakterisierung der humanen Proteinkinase X

Diese Dissertation befasst sich mit der Charakterisierung der humanen Proteinkinase (PRKX) mittels zellbiologischer (rekombinante Expression in Baculovirus, endogenes Protein, BRET) wie auch biochemischer Elemente (Aktivitaetsassays, Biacore). Dabei wurde die humane PRKX mit den Drosophila- und Maus-Isoformen DC2 und PKARE verglichen, wie auch putative Phosphorylierungsstellen durch andere Kinasen identifiziert, welche einen Einfluss auf Interaktion und Lokalisation des Enzyms haben koennten.

Die Rolle von Fibronektin in der Leber und im Knochen

In der vorliegenden Arbeit sollten der Einfluss des Fibronektins auf eine Leberfibrose und die Wirkung veränderter Fibronektin-Isoformen auf den Knochen experimentell untersucht werden. Dazu wurden konditionelle Fibronektin Knockout-Mäuse verwendet. Die spezifische Ausschaltung in hepatischen Sternzellen konnte sowohl auf der Ebene der DNA und RNA als auch anhand der gebildeten Proteinmenge bewiesen werden. Fehlendes Fibronektin hatte bereits bei gesunden Mäusen einen leichten Anstieg der Kollagenmenge zur Folge. Durch die Induktion einer Fibrose mit der Chemikalie DMN kam es zu einer auffällig starken Akkumulation von Kollagen in den konditionellen Knockout-Mäusen. Zusätzlich ließ sich eine Häufung des Fibronektins in fibrotischen Bereichen erkennen. Nachfolgend konnte die erhöhte Kollagenmenge auf eine vermehrte Aktivierung der hepatischen Sternzellen zurückgeführt werden, außerdem kam es zu einer erhöhten Proliferation dieser Zellen. In vitro Untersuchungen bestätigten eine Grundaktivierung der konditionellen Knockout-Sternzellen, welche sich durch eine Stimulation mit TGF-β noch erheblich verstärkte. Diese verstärkte Aktivierung ließ sich auf eine erhöhte Menge von TGF-β Rezeptor Typ II auf der Zellmembran zurückführen, was eine zunehmende Aktivierung der Signalmoleküle im Inneren der Sternzellen zur Folge hatte. Dabei konnte anhand von Untersuchungen des Smad4 und der p38 Kinase bewiesen werden, dass beide Wege zu einer verstärkten Kollagen Typ I Expression in den konditionellen Knockout-Sternzellen beitrugen. Letztlich zeigte sich, dass es durch fehlendes Fibronektin zu einer verstärkten Freisetzung von aktivem TGF-β kam, wodurch sich die oben beschriebenen profibrotischen Effekte erklären lassen. Durch eine Leberfibrose kommt es zur Bildung veränderter Fibronektin-Isoformen, welche über den Blutstrom andere Organe erreichen und ihre Funktion beeinflussen könnten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Differenzierungsfähigkeit kultivierter muriner Osteoblasten durch die Gegenwart des Fibronektins oFN, einer Isoform, die in Patienten mit der Lebererkrankung primäre biliäre Zirrhose erhöht ist, nahezu vollständig inhibiert wurde. Dies wurde anhand der Knotenbildung sowie durch die Prüfung der Differenzierungsmarker Osteokalzin und alkalische Phosphatase belegt. Außerdem konnte eine Rolle der EDA-Domäne des Fibronektins zusätzlich ausgeschlossen werden. Desweiteren führte die Injektion von amniotischem Fibronektin, das oFN enthielt in gesunde Mäuse zu einer erheblichen Beeinträchtigung des Knochens, was an einer Verminderung der Knochendichte erkennbar war. Die histomorphometrische Auswertung der Knochen ergab, dass die Gegenwart von aFN eine starke Reduktion der Knochenneubildung verursachte, die durch eine drastisch verminderte Zahl von Osteoblasten hervorgerufen wurde. Zusammenfassend zeigte sich, dass fehlendes Fibronektin die Entwicklung einer Leberfibrose verstärkt und dass eine Isoform die von der erkrankten Leber vermehrt produziert wird eine schädigende Wirkung auf den Knochen ausübt.

Untersuchungen zur Bedeutung der PKA für die Spermatogenese in Drosophila melanogaster

Für die cAMP-abhängige Proteinkinase (Proteinkinase A, PKA) in Drosophila melanogaster sind zwei regulatorische Untereinheiten (R1 und R2) und drei katalytische Untereinheiten (C1, C2 und C3) beschrieben. Außerdem gibt es eine weitere mögliche katalytische Untereinheit mit einer auffälligen Ähnlichkeit zu C2, dementsprechend C2-like genannt. Für R2, C2 und C2-like konnte bereits gezeigt werden, dass sie im Hodengewebe synthetisiert werden. Die Expression der verbleibenden PKA-Untereinheiten im Hodengewebe wurde in dieser Arbeit mit Hilfe von RT-PCR, Northern-Hybridisierungen, GFP-Reporter- bzw. GFP-Fusionskonstrukten untersucht. So konnte gezeigt werden, dass alle PKA-Untereinheiten im Hoden exprimiert werden. Dabei wird von jeder Untereinheit mindestens eine Isoform in den Keimzellen synthetisiert. R2 und C1 treten außerdem in den die Keimzellen umschließenden Zystenzellen auf, wobei R2 während der gesamten Spermatogenese exprimiert wird, C1 jedoch nur am Ende des Prozesses während des Stadiums der elongierten Spermatiden. In BRET-Analysen sind die beiden Untereinheiten in der Lage, miteinander zu interagieren. Somit könnten sie zusammen eine Funktion in den Zystenzellen vermitteln, die während der Differenzierungsphase stattfindet. Die katalytischen Untereinheiten C2, C2-like und zwei Isoformen von C3 (B und B') werden keimzellspezifisch exprimiert. Die BRET-Analysen lassen darauf schließen, dass C2 und C3 B’ möglicherweise keine funktionellen PKA-Untereinheiten sind. Auch der Versuch, durch Antisense- und RNAi-Konstrukte einen mutanten Phänotyp zu erzeugen, schlug fehl. Das könnte ein Hinweis darauf sein, dass die beiden Untereinheiten C2 und C3 B’ gar keine oder zumindest keine essentielle Funktion während der Spermatogenese haben. Das C2-like as-Konstrukt führte hingegen zu einem starken Phänotyp. Schon eine geringe Reduktion der endogenen c2-like-mRNA führte zu einer starken Beeinträchtigung der männlichen Fertilität. Die elongierten Spermatiden zeigten einen Defekt in der Kernmorphologie und waren nicht in der Lage, Individualisierungskomplexe auszubilden. Dementsprechend fand keine Individualisierung statt und es konnten keine reifen Spermien in die Samenblase entlassen werden. Der mutante Phänotyp weist darauf hin, dass C2-like an mehreren Prozessen während der Keimzelldifferenzierung beteiligt ist. Gao et al. veröffentlichten 2008 Listen mit potentiellen PKA-Substraten für alle bekannten katalytischen Untereinheiten verschiedener Organismen. Zwei Substrat-Kandidaten für C2-like sind die testisspezifischen Serin/Threonin-Kinasen (TSSK) CG9222 und CG14305. Beide Proteine werden exklusiv im Hoden exprimiert. CG9222-GFP lokalisierte in die Individualisierungskomplexe (ICs) elongierter Spermatiden. Das entsprechende RNAi-Konstrukt zeigte allerdings keinen Effekt auf den Zusammenbau der ICs. Dagegen zeigte CG14305-GFP keine subzelluläre Lokalisierung, sondern war cytoplasmatisch über die gesamten Spermatiden verteilt. Das entsprechende RNAi-Konstrukt führte aber dazu, dass keine ICs ausgebildet werden. Beide Proteine spielen dementsprechend eine Rolle während der Individualisierung. Dies ist in Übereinstimmung mit dem Phänotyp der C2-like as-mutanten Männchen. So ist es vorstellbar, dass CG9222 und CG14305 von C2-like phosphoryliert werden müssen, um ihre Funktion während der Individualisierung der Spermatiden erfüllen zu können. Ein direkter Nachweis, dass C2-like die beiden Proteine tatsächlich phosphorylieren kann, steht allerdings noch aus.

Identifizierung und funktionelle Charakterisierung neuer A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs) im Modellorganismus C. elegans

In dieser Arbeit sollten neue Interaktionspartner der regulatorischen Untereinheit (R-UE) der Proteinkinase A (PKA) und des Modellorganismus C. elegans identifiziert und funktionell charakterisiert werden. Im Gegensatz zu Säugern (vier Isoformen), exprimiert der Nematode nur eine PKA-R-Isoform. Mittels in silico Analysen und so genannten „Pulldown“ Experimenten, wurde insbesondere nach A Kinase Ankerproteinen (AKAP) in C. elegans gesucht. Aus in silico Recherchen resultiert das rgs5 Protein als mögliches Funktionshomolog des humanen AKAP10. Rgs5 enthält eine potenzielle, amphipathische Helix (AS 421-446, SwissProt ID A9Z1K0), die in Peptide-SPOT-Arrays (durchgeführt im Biotechnologie Zentrum in Oslo, AG Prof. K. Taskén) eine Bindung an RI und RII-UE zeigt. Eine ähnliche Lokalisation von rgs5 und hAKAP10 in der Zelle, sowie vergleichende BRET² Studien, weisen auf eine mögliche Funktionshomologie zwischen AKAP10 und rgs5 hin. Die hier durchgeführten Analysen deuten darauf hin, dass es sich bei rgs5 um ein neues, klassisches AKAP mit „RII bindender Domäne“ Motiv im Modellorganismus C. elegans handelt. Basierend auf so genannten „pulldown“ Versuchen können, neben „klassischen“ AKAPs (Interaktion über amphipathische Helices), auch Interaktionspartner ohne typische Helixmotive gefunden werden. Dazu gehört auch RACK1, ein multifunktionales Protein mit 7 WD40 Domänen, das ubiquitär exprimiert wird und bereits mehr als 70 Interaktionspartner in unterschiedlichsten Signalwegen komplexiert (Adams et al., 2011). Durch BRET² Interaktionsstudien und Oberflächenplasmonresonanz (SPR) Analysen konnten hRI und kin2 als spezifische Interaktionspartner von RACK1 verifiziert werden. Untersuchungen zur Identifikation der Interaktionsflächen der beiden Proteine RACK1 und hRI zeigten im BRET² System, dass RACK1 über die WD40 Domänen 1-2 und 6-7 interagiert. Die Analyse unterschiedlicher hRI-Deletionsmutanten deutet auf die DD-Domäne im N-Terminus und zusätzlich auf eine potenzielle BH3 Domäne im C-Terminus des Proteins als Interaktionsfläche mit RACK1 hin. Die Koexpression von hRI BH3 und RACK1 zeigt einen auffälligen ein Phänotyp in Cos7 Zellen. Dieser zeichnet sich unter anderem durch eine Degradation des Zellkerns, DNA Kondensation und eine starke Vakuolisierung aus, was beides als Anzeichen für einen programmierten Zelltod interpretiert werden könnte. Erste Untersuchungen zum Mechanismus des ausgelösten Zelltods deuten auf eine Caspase unabhängige Apoptose (Paraptose) hin und einen bislang unbekannten Funktionsmechanismus der PKA hin.