Garlic viral complex: identification of Potyviruses and Carlavirus in Central Brazil

Garlic viruses often occur in complex infections in nature. In this study, a garlic virus complex, collected in fields in Brazil, was purified. RT-PCR was performed using specific primers designed from the consensus regions of the coat protein genes of Onion yellow dwarf virus, a garlic strain (OYDV-G) and Leek yellow stripe virus (LYSV). cDNA of Garlic common latent virus (GCLV) was synthesized using oligo-dT and random primers. By these procedures individual garlic virus genomes were isolated and sequenced. The nucleotide sequence analysis associated with serological data reveals the presence of two Potyvirus OYDV-G and LYSV, and GCLV, a Carlavirus, simultaneously infecting garlic plants. Deduced amino acid sequences of the Brazilian isolates were compared with related viruses reported in different geographical regions of the world. The analysis showed closed relations considering the Brazilian isolates of OYDV-G and GCLV, and large divergence considering LYSV isolate. The detection of these virus species was confirmed by specific reactions observed when coat protein genes of the Brazilian isolates were used as probes in dot-blot and Southern blot hybridization assays. In field natural viral re-infection of virus-free garlic was evaluated.

Detection and partial characterization of a carlavirus causing stem necrosis of soybean in Brazil

Stunting and stem necrosis were noticed in soybeans (Glycine max) grown in 2000/2001 in West Central Brazil the same condition was also observed in the following year in plantations as far as 2,000 km from the initial area. Based on transmission (mechanical, graft, insect vector), purification and serology, electron microscopy and molecular studies the causal agent was determined to be a whitefly-borne carlavirus which is possibly related to Cowpea mild mottle virus (CpMMV).

Evidence supporting the recognition of Cole latent virus as a distinct carlavirus

Some molecular properties are described of Cole latent virus (CoLV), hitherto designated a tentative species of the Carlavirus genus. CoLV genomic RNA (Ribonucleic acid) of 8.3 Kb is polyadenylated. Two unencapsidated polyadenylated subgenomic RNAs (2.6 and 1.3 Kb) and three double-stranded RNAs (dsRNAs) (8.3, 2.6 and 1.3 Kbp), which are twice the size of the genomic and subgenomics ssRNAs, are produced in CoLV-infected plants, two additional dsRNAs (7.2 and 6.3 Kbp) were also detected plant extracts. By using a Carlavirus specific primer and a CoLV cDNA, a-3'-terminus fragment of 116 bp was amplified; it had homology with the carlaviruses Potato virus M (62%)., Hop latent virus (37%) and Blueberry scorch virus (36%) but no significant homology with 11 other carlaviruses. These results support the classification of CoLV as a distinct species of the Carlavirus genus.

A degenerate primer allows amplification of part of the 3 '-terminus of three distinct carlavirus species

Sequences of the coat protein amino acids of definitive and tentative species of carlaviruses deposited in GenBank were aligned and a region of seven amino acids (GLGVPTE) was found to be conserved. The corresponding nucleotides were aligned, allowing the design of a degenerate primer that together with an oligo dT anti-sense primer, was effective for the detection of three distinct carlavirus species, two transmitted by aphids and one by whitefly. These primers have the advantage that about 940 nt from the 3'-terminus, comprising part of the CP gene (about 60%), the 11 K gene, and the terminal untranslated region can be amplified for sequencing. The fact that this amino acid sequence is conserved in almost all of the sequenced carlaviruses, allows the prediction that this primer pair will be useful as a diagnostic tool for carlavirus species. (C) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Detection and partial characterization of a carlavirus causing stem necrosis of soybean in Brazil

No ano agrícola de 2000/2001, ocorreu um surto de nanismo e necrose da haste em soja (Glycine max) plantada em duas áreas do Brasil Central e na safra seguinte, esta anomalia foi constatada em outras regiões produtoras, mesmo distantes mais de 2.000 km de onde fora inicialmente constatada. Estudos envolvendo ensaios de transmissão (enxertia, mecânica e insetos vetores), microscopia eletrônica, purificação, sorologia e ensaios moleculares indicaram que a enfermidade foi causada por um carlavirus transmitido por mosca branca, possivelmente relacionado ao Cowpea mild mottle virus (CpMMV).

Levantamento das principais viroses na cultura do alho (Allium sativum L.) e caracterização de carlavirus em algumas regiões produtoras do Brasil

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Incidence of Garlic common latent virus in Argentina, and phylogenetic and recombination analyses of isolates

The objective of this work was to estimate the incidence and prevalence of Garlic common latent virus (GarCLV) in the main production regions of garlic (Allium sativum) in Argentina, and to perform phylogenetic and recombination analyses in isolates from these regions. Leaf samples (3,050) were taken from four garlic commercial types, in 13 departments of the four main garlic-producing provinces of Argentina, in a 1,175-ha sampling area. Virus infection was evaluated with DAS-Elisa test using specific antiserum, and the phylogenetic and recombination analyses were done with capsid protein (CP) nucleotide sequence of seven GarCLV isolates from the provinces. The incidence of GarCLV in the evaluated provinces varied between 6.7 and 22% of the samples, whereas the prevalence varied between 52.6 and 70%. In the analysis of garlic commercial types, Morado showed the highest incidence of the virus, in the province of San Juan, whereas Rosado Paraguayo had the lowest incidence, in the province of Cordoba. Nucleotide identity in the CP sequences ranged between 80.3 and 97.6%. The phylogenetic analysis shows the presence of two main groups of GarCLV and of a possible third group that would include only a German isolate. The recombination analysis between isolates from different parts of the world evidences the presence of recombinant isolates from Poland and Australia.

Coat protein and RNAs of Cole latent virus are not present within chloroplasts of Chenopodium quinoa-infected cells

Cole latent virus (CoLV), genus Carlavirus, was studied by electron microscopy and biochemical approaches with respect both to the ultrastructure of the Chenopodium quinoa infected cells and to its association with chloroplasts. The CoLV was observed to be present as scattered particles interspersed with membranous vesicles and ribosomes or as dense masses of virus particles. These virus particles reacted by immunolabelling with a polyclonal antibody to CoLV. Morphologically, chloroplasts, mitochondria and nuclei appeared to be unaltered by virus infection and virus particles were not detected in these organelles. However, virus particle aggregates were frequently associated with the outer membrane of chloroplasts and occasionally with peroxisomes. Chloroplasts were purified by Percoll gradient, and the coat protein and virus-associated RNAs were extracted and analyzed by Western and Northern blots respectively. Coat protein and CoLV-associated RNAs were not detected within this organelle. The results presented in this work indicate that the association CoLV/chloroplasts, observed in the ultrastructural studies, might be a casual event in the host cell, and that the virus does not replicate inside the organelle.

Transmissão do Cowpea mild mottle virus pela mosca branca Bemisia tabaci biótipo B para plantas de feijão e soja

A necrose da haste da soja é causada por um vírus do gênero Carlavirus transmitido pela mosca branca Bemisia tabaci, também infectante de feijão e identificado como Cowpea mild mottle virus (CpMMV). Neste trabalho foram realizados testes para determinação do número de moscas-brancas B. tabaci biótipo B necessários para transmissão do vírus em feijoeiro e soja. Na sequência foram realizados dois outros testes, com 10 insetos por planta. Avaliaram-se períodos de acesso à aquisição (PAA) de 'Jalo' para 'Jalo', e o efeito de períodos de acesso à inoculação (PAI). Foram visualmente constatados sintomas típicos do carlavírus como mosaico, clareamento de nervuras, necrose sistêmica e redução de crescimento. Houve transmissão do vírus para 'BT-2' de feijão e 'BRS-132' de soja com apenas um inseto por planta, sendo mais eficaz nesta última espécie. A taxa de transmissão do vírus foi maior com o aumento do número de insetos por planta. E o PAA foi determinado após 15' de tempo para aquisição, e o PAI com 5 min e aumentando os períodos de acesso a aquisição e inoculação aumentou-se a taxa de transmissão.

Análise da presença de vírus em alho semente da segunda e quarta gerações, produzidos por termoterapia e cultura de tecido

O alho (Allium sativum L.) pode estar naturalmente infectado por um complexo de vírus filamentosos pertencentes aos gêneros Potyvirus, Carlavirus e Allexivirus. O acúmulo destes vírus se dá, principalmente, pela sua propagação vegetativa através dos bulbilhos. Como a planta de alho cultivada não produz semente verdadeira em todo o mundo, a única forma de se obter plantas livres de vírus se dá pela cultura de tecidos dos ápices caulinares e termoterapia. Utilizando estas técnicas, alhos sementes foram produzidos na FCA- UNESP de Botucatu e avaliados via RT-PCR para a presença de potyvirus, carlavirus e allexivirus. Na segunda geração dos microbulbilhos propagados em casa de vegetação, 6,6% de infecção foi verificada por allexivirus. Já na quarta geração foi observada incidência de 60% com allexivirus, 35% com potyvirus e todas foram negativas para carlavirus. A alta taxa de infecção por allexivirus pode estar relacionada à maior dificuldade de remoção de espécies de vírus pertencentes a este gênero, como também já observado por outros autores, pela infecção e transmissão de vírus pelo ácaro, Aceriatulipae, durante o armazenamento dos bulbos de um ano a outro. O alho na quarta geração corresponde a bulbilhos com peso inferior a 1 grama e que não haviam sido selecionados para multiplicação comercial. A seleção para tamanho do bulbilho tem efeito positivo na escolha de bulbilhos com menores taxas de infecção por vírus, já que a técnica de termoterapia e cultura de tecidos não elimina totalmente os vírus. Os resultados também enfatizam a necessidade de se realizar fumigação no alho semente armazenado de um ano a outro a fim de evitar a transmissão de allexivirus durante o armazenamento.

Bulbilhos aéreos de alho, provenientes de escapes florais, são infectados por vírus

Em campos de produção comercial de alho é comum observar plantas naturalmente infectadas por vírus dos gêneros Allexivirus, Carlavirus e Potyvirus. Os bulbilhos aéreos podem ser uma alternativa para a propagação de plantas de alho livres de vírus. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi analisar a taxa de perpetuação dos vírus de plantas infectadas para os bulbilhos aéreos. Os bulbilhos aéreos obtidos de plantas infectadas foram analisados por RT-PCR utilizando oligonucleotídeos universais para os gêneros Allexivirus, Carlavirus e Potyvirus. A taxa de perpetuação foi de 65% para allexivírus, 20% para carlavírus e 82,22% para potyvírus. Os resultados demonstraram que a perpetuação dos diferentes vírus do bulbo para os bulbilhos aéreos é elevada, inviabilizando a utilização direta dos bulbilhos aéreos provenientes de plantas matrizes infectadas por vírus. Esta metodologia deve ser utilizada somente a partir de plantas isentas de vírus.

Transmissão do Cowpea mild mottle virus pela mosca branca Bemisia tabaci biótipo B para plantas de feijão e soja

A necrose da haste da soja é causada por um vírus do gênero Carlavirus transmitido pela mosca branca Bemisia tabaci, também infectante de feijão e identificado como Cowpea mild mottle virus (CpMMV). Neste trabalho foram realizados testes para determinação do número de moscas-brancas B. tabaci biótipo B necessários para transmissão do vírus em feijoeiro e soja. Na sequência foram realizados dois outros testes, com 10 insetos por planta. Avaliaram-se períodos de acesso à aquisição (PAA) de 'Jalo' para 'Jalo', e o efeito de períodos de acesso à inoculação (PAI). Foram visualmente constatados sintomas típicos do carlavírus como mosaico, clareamento de nervuras, necrose sistêmica e redução de crescimento. Houve transmissão do vírus para 'BT-2' de feijão e 'BRS-132' de soja com apenas um inseto por planta, sendo mais eficaz nesta última espécie. A taxa de transmissão do vírus foi maior com o aumento do número de insetos por planta. E o PAA foi determinado após 15' de tempo para aquisição, e o PAI com 5 min e aumentando os períodos de acesso a aquisição e inoculação aumentou-se a taxa de transmissão.

Coat protein and RNAs of Cole latent virus are not present within chloroplasts of Chenopodium quinoa-infected cells

O vírus latente da couve (Cole latent virus, CoLV), gênero Carlavirus, foi estudado, por microscopia eletrônica de transmissão e técnicas bioquímicas, em relação à ultra-estrutura das células infetadas de Chenopodium quinoa, e de sua associação com os cloroplastos. O CoLV foi observado como partículas dispersas pelo citoplasma entremeadas com vesículas membranosas e ribossomos e/ou como densas massas de partículas. Estes partículas reagiram por imunomarcação com anti-soro policlonal para o CoLV. Morfologicamente, cloroplastos, mitocôndrias e núcleos mostraram-se inalterados e partículas virais não foram encontradas dentro dessas organelas. Entretanto, agregados de partículas virais foram freqüentemente vistos em associação com a membrana externa dos cloroplastos e ocasionalmente com peroxissomos. Cloroplastos foram purificados em gradiente de Percoll e as proteínas e os RNA foram extraídos e analisados, respectivamente, por Western blot e Northern blot. Proteína capsidial e RNA associados ao CoLV não foram detectados nessa organela. Os resultados aqui obtidos indicam que a associação CoLV/cloroplastos, observada nos estudos de microscopia eletrônica, é possivelmente um evento casual dentro da célula hospedeira e que o vírus não se multiplica dentro dessa organela.

Caracterização de allexivirus em alho nas regiões sul, sudeste e centro-oeste brasileiro e análise da sanidade vegetal do alho obtido por cultura de meristema e termoterapia na FCA/UNESP

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Viroses do alho: métodos de diagnose e degenerescência do alho semente livre de vírus

Pós-graduação em Agronomia (Proteção de Plantas) - FCA