Analysis of the circadian system of the cockroach Rhyparobia (Leucophaea) maderae

Biologische Rhythmen bestimmen das gesamte Leben auf der Erde. Dabei scheint der circadiane Rhythmus der bekannteste zu sein, welcher durch eine Periodendauer von etwa (lat. circa) 24 Stunden gekennzeichnet ist. Dieser seit Jahrmillionen täglich stattfindende Wechsel von Hell- und Dunkelphasen führte zur Entwicklung von inneren Uhren in nahezu allen Organismen, welche die Physiologie und das Verhalten steuern. In der Schabe Rhyparobia (Leucophaea) maderae, einem etablierten Modellorganismus der circadianen Rhythmusforschung, konnte die innere Uhr auf die akzessorischen Medulla (AMe) eingegrenzt werden. Da neben klassischen Neurotransmittern auch Neuropeptide unablässig für die Aufrechterhaltung des endogenen Rhythmus oder aber für Synchronisationsprozesse sind, bestand der Hauptfokus der Arbeit in der Analyse einer möglichen Beteiligung des myoinhibitorischen Neuropeptids (MIP) am circadianen System von R. maderae. Mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie konnten fünf Rhyparobia-MIPs in Präparationen der AMe identifiziert und zwei vollständig sequenziert werden. Immunzytochemische Analysen zeigten neben einer weiten MIP-Immunreaktivität im Gehirn eine dichte Innervierung der AMe und mit ihr assoziierten Neuronengruppen. Kolokalisation von MIP- und Pigment-dispersing Faktor-Immunreaktivitäten wurden in mindestens zwei circadianen Schrittmacherzellen beobachtet. Immunreaktivitäten in diversen Kommissuren lassen den Schluss zu, dass Rhyparobia-MIPs als Kopplungsfaktoren beider akzessorischen Medullae agieren. Immunzytochemische Kolokalisationsexperimente mit anderen neuroaktiven Kandidaten für den Lichteingangsweg zeigen, dass Rhyparobia-MIPs auch an der Übermittlung photischer Eingänge in die AMe vom ipsi- und kontralateralen Komplexauge beteiligt sein könnten. Darüber hinaus konnte durch Injektionsexperimente kombiniert mit Verhaltensassays gezeigt werden, dass mindestens Rhyparobia-MIP-1 und -2 Eingangssignale in die AMe sind. Des Weiteren konnte mittels enzyme-linked immunosorbent Assays gezeigt werden, dass MIP in der AMe und dem optischen Lobus mindestens über G-Protein gekoppelte Rezeptoren agiert. Diese Rezeptoren scheinen zudem tageszeitabhängig unterschiedlich exprimiert oder aber unterschiedlich sensitiv zu sein.

A molecular and cellular analysis of the circadian system of the cockroach Rhyparobia (Leucophaea) maderae

Circadiane Schrittmacher koordinieren die täglichen Rhythmen in Physiologie und Verhalten in lebenden Organismen. Die Madeira Schabe Rhyparobia maderae (Synonym: Leucophaea maderae) ist ein gut etabliertes Modell, um die neuronalen Mechanismen der circadianen Rhythmen bei Insekten zu studieren. Die akzessorische Medulla (AME) in den optischen Loben des Gehirns wurde als das circadiane Schrittmacherzentrum der Madeira Schabe identifiziert, das circadiane Rhythmen in der Laufaktivität steuert. Über die Neurotransmitter der Eingangswege in das circadiane System der Madeira Schabe ist noch nicht viel bekannt. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, mögliche Eingangssignale in die innere Uhr der Madeira Schabe zu bestimmen. An primären Zellkulturen von AME-Neuronen wurden Calcium-Imaging Experimente durchgeführt, um die Neurotransmitter-abhängigen Veränderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration zu messen. Darüber hinaus wurde die Signalkaskade des Neuropeptids Pigment Dispersing Factor (PDF), dem wichtigsten Kopplungsfaktor in circadianen Schrittmachern von Insekten, in Calcium-Imaging und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Experimenten untersucht. Acetylcholin (ACh) erhöht die intrazelluläre Calcium-Konzentration in der Mehrzahl der circadianen Schrittmacherneurone der Madeiraschabe. Applikation von GABA, Serotonin und Octopamin erhöhten oder reduzierten die intrazelluläre Calcium-Konzentration in den AME-Neuronen, während Histamin und Glutamat die intrazelluläre Calcium-Konzentration ausschließlich reduzierten. Pharmakologische Experimente zeigten, dass die AME-Neurone ACh über ionotrope nikotinische ACh-Rezeptoren detektierten, während GABA über ionotrope GABAA-Rezeptoren und metabotrope GABAB-Rezeptoren detektiert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die circadiane Aktivität der Schabe durch verschiedene Eingänge, einschließlich ACh, GABA, Glutamat, Histamin, Octopamin und Serotonin, moduliert wird. Bei den FRET Studien wurde ein Proteinkinase A (PKA)-basierter FRET Sensor zur Detektion von cyclischem AMP (cAMP) verwendet. Es wurde gezeigt, dass PDF über Adenylylcyclase-abhängige und -unabhängige Signalwege wirken kann. Zusätzlich wurden Laufrad-Assays durchgeführt, um Phasenverschiebungen im Rhythmus der circadianen Laufaktivität zu detektieren, nachdem der Neurotransmitter Histamin zu verschiedenen circadianen Zeiten injiziert wurde. Histamin-Injektionen durch die Komplexaugen der Schabe ergaben eine biphasische Phasenantwortkurve (phase response curve) mit Phasenverzögerungen in der Laufaktivität am späten subjektiven Tag und am Beginn der subjektiven Nacht und Phasenbeschleunigungen in der späten subjektiven Nacht. Schließlich wurde eine extrazelluläre Ableittechnik an lebenden Schaben etabliert, die gleichzeitige Langzeit-Ableitungen von der AME, des Komplexauges (Elektroretinogramm = ERG), und der Beinmuskulatur (Elektromyogramm = EMG) für mehrere Tage ermöglichte. Diese Methode bietet einen Ausgangspunkt für weitere elektrophysiologische Untersuchungen des circadianen Systems der Schabe, in denen Substanzen (z.B. Neurotransmitter und Neuropeptide) analysiert werden können, die einen Einfluss auf den circadianen Rhythmus in der Laufaktivität haben

The function of SIFamide, PDF, and further neuropeptides in the circadian system of Rhyparobia maderae

Der täglich Wechsel von Hell- und Dunkelphasen führte während der Evolution zur Entwicklung innerer Uhren in nahezu allen Organismen. In der Schabe Rhyparobia maderae lokalisierten Läsions- und Transplantationsexperimente die innere Uhr in der akzessorischen Medulla (AME). Dieses kleine birnenförmige Neuropil am ventromedianen Rand der Medulla ist mit etwa 240 Neuronen assoziiert, die eine hohe Anzahl an zum Teil kolokalisierten Neuropeptiden und Neurotransmittern exprimieren. Diese Signalstoffe scheinen essentiell zu sein für die Synchronisation der inneren Uhr mit der Umwelt, der Kopplung der beiden bilateralen AME, der Aufrechterhaltung des circadianen Rhythmus sowie der zeitlichen Steuerung bestimmter Verhaltensweisen. Während die Funktion einiger dieser neuronalen Botenstoffe bereits gut untersucht ist, fehlt sie für andere. Zudem ist noch ungeklärt, wann einzelne Botenstoffe im circadianen Netzwerk agieren. Im Fokus dieser Studie lag daher die Erforschung der Funktion von SIFamide und Corazonin im circadianen Netzwerk sowie die weitere Untersuchung der Funktionen der Neuropeptide MIP und PDF. Es konnte gezeigt werden, dass SIFamide auch in R. maderae in vier großen neurosekretorischen Zellen in der pars intercerebralis exprimiert wird. Varikosenreiche SIFamide-immureaktive (-ir) Fasern innervieren eine Vielzahl an Neuropilen und finden sich auch in der Hüllregion der AME. Injektionsexperimente resultierten in einer monophasischen Phasen-Antwort-Kurve (PRC) mit einer Verzögerung zur frühen subjektiven Nacht. SIFamide ist also ein Eingangssignal für das circadiane Netzwerk und könnte in der Kontrolle der Schalf/Wach-Homöostase involviert sein. Auch Corazonin fungiert als Eingangssignal. Da die Injektionsexperimente in einer monophasischen PRC mit einem Phasenvorschub zur späten subjektiven Nacht resultierten, ist davon auszugehen, dass die Corazonin-ir AME-Zelle Bestandteil des Morning-Oszillator-Netzwerkes in R. maderae ist. Darüber hinaus zeigten Backfill-Experimente, dass MIP an der Kopplung beider AMAE beteiligt ist. ELISA-Quantifizierungen der PDF-Level im Tagesverlauf ergaben Schwankungen in der Konzentration, die auf eine Ausschüttung des Peptids während des Tages hindeuten – ähnlich wie es in Drosophila melanogaster der Fall ist. Dies spiegelt sich in der vervollständigten bimodalen PDF-PRC wieder. Hier führen Injektionen zu einem Phasenvorschub, bevor maximale Peptidlevel erreicht werden, sowie zu einer Phasenverzögerung, sobald die Peptidlevel wieder zu sinken beginnen. Die PRCs erlauben somit Rückschlüsse auf den Zeitpunkt der maximalen Peptidfreisetzung. PDF-ir Neuriten findet sich zudem in sämtlichen Ganglien des ventralen Strickleiternervensystems, was eine Funktion in der Kontrolle der Prozesse impliziert, die durch die Mustergeneratoren in Thorakal- und Abdominalganglien gesteuert werden.

The circadian oscillator gene GIGANTEA mediates a long-term response of the Arabidopsis thaliana circadian clock to sucrose.

Circadian clocks are 24-h timing devices that phase cellular responses; coordinate growth, physiology, and metabolism; and anticipate the day-night cycle. Here we report sensitivity of the Arabidopsis thaliana circadian oscillator to sucrose, providing evidence that plant metabolism can regulate circadian function. We found that the Arabidopsis circadian system is particularly sensitive to sucrose in the dark. These data suggest that there is a feedback between the molecular components that comprise the circadian oscillator and plant metabolism, with the circadian clock both regulating and being regulated by metabolism. We used also simulations within a three-loop mathematical model of the Arabidopsis circadian oscillator to identify components of the circadian clock sensitive to sucrose. The mathematical studies identified GIGANTEA (GI) as being associated with sucrose sensing. Experimental validation of this prediction demonstrated that GI is required for the full response of the circadian clock to sucrose. We demonstrate that GI acts as part of the sucrose-signaling network and propose this role permits metabolic input into circadian timing in Arabidopsis.

Exercise elicits phase shifts and acute alterations of melatonin that vary with circadian phase

To examine the immediate phase-shifting effects of high-intensity exercise of a practical duration (1 h) on human circadian phase, five groups of healthy men 20-30 yr of age participated in studies involving no exercise or exposure to morning, afternoon, evening, or nocturnal exercise. Except during scheduled sleep/dark and exercise periods, subjects remained under modified constant routine conditions allowing a sleep period and including constant posture, knowledge of clock time, and exposure to dim light intensities averaging (±SD) 42 ± 19 lx. The nocturnal onset of plasma melatonin secretion was used as a marker of circadian phase. A phase response curve was used to summarize the phase-shifting effects of exercise as a function of the timing of exercise. A significant effect of time of day on circadian phase shifts was observed (P < 0.004). Over the interval from the melatonin onset before exercise to the first onset after exercise, circadian phase was significantly advanced in the evening exercise group by 30 ± 15 min (SE) compared with the phase delays observed in the no-exercise group (-25 ± 14 min, P < 0.05). Phase shifts in response to evening exercise exposure were attenuated on the second day after exercise exposure and no longer significantly different from phase shifts observed in the absence of exercise. Unanticipated transient elevations of melatonin levels were observed in response to nocturnal exercise and in some evening exercise subjects. Taken together with the results from previous studies in humans and diurnal rodents, the current results suggest that 1) a longer duration of exercise exposure and/or repeated daily exposure to exercise may be necessary for reliable phase-shifting of the human circadian system and that 2) early evening exercise of high intensity may induce phase advances relevant for nonphotic entrainment of the human circadian system.

Evolutionary History of the PER3 Variable Number of Tandem Repeats (VNTR): Idiosyncratic Aspect of Primate Molecular Circadian Clock

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Genetic Algorithms for Parameter Estimation in Circadian Model

This paper proposes an algorithm to estimate two parameter values vs, transcription of frq gene, and vd, maximum rate of FRQ protein degradation for an existing 3rd order Neurospora model in literature. Details of the algorithm with simulation results are shown in this paper.

Locomotor activity rhythm in the Japanese eel Anguilla japonica elvers

Under artificial LD cycles (6, 12, 18 L), the elvers of Japanese eel, Anguilla japonica, showed a 24 h cycle of locomotor activity rhythm being most active at light transitions: the eels' activity rose to a primary peak after lights-off, followed by a quiescent period during which they buried into the shelters or lying motionlessly on sand for most of the time, and then reached a secondary peak before lights-on. Elvers could resynchronize their activity rhythm with a new photo cycle within 4 d. Moreover, their activity level at dark phase significantly increased as the light period was prolonged: higher activity levels during shorter dark period. However, the elvers did not display clearly the existence of a circadian rhythm under constant light or dark conditions. The timing of daily activity rhythm evidenced in the Japanese eels may occur through the action of the LD cycles with a weak participation of an endogenous circadian system. In all the LD cycles, over 99% of the activity occurred in the dark phase, indicating that the eels were always nocturnally active no matter what time of day it might be. Under 12 L conditions, the eels' activity level and the time outside sand were significantly elevated both at light and dark phases as temperature increased from 10 similar to 15 to 20 similar to 25 degrees C. The activity rhythm pattern (i.e., two peaks occurring around light transitions) did not apparently change among temperatures. However, in contrast with the primary activity peaks immediately after lights-off at 20 and 25 degrees C, the timing of the primary peaks at 10 and 15 degrees C showed a latency of a few hours following lights-off, indicating the inhibiting effect of low temperature on the eels' activity.

Regulation of gene expression in the dinoflagellate Lingulodinium polyedrum

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires que l’on retrouve autant en eau douce qu’en milieu marin. Ils sont particulièrement connus pour causer des fleurs d’algues toxiques nommées ‘marée-rouge’, ainsi que pour leur symbiose avec les coraux et pour leur importante contribution à la fixation du carbone dans les océans. Au point de vue moléculaire, ils sont aussi connus pour leur caractéristiques nucléaires uniques, car on retrouve généralement une quantité immense d’ADN dans leurs chromosomes et ceux-ci sont empaquetés et condensés sous une forme cristalline liquide au lieu de nucléosomes. Les gènes encodés par le noyau sont souvent présents en multiples copies et arrangés en tandem et aucun élément de régulation transcriptionnelle, y compris la boite TATA, n’a encore été observé. L’organisation unique de la chromatine des dinoflagellés suggère que différentes stratégies sont nécessaires pour contrôler l’expression des gènes de ces organismes. Dans cette étude, j’ai abordé ce problème en utilisant le dinoflagellé photosynthétique Lingulodinium polyedrum comme modèle. L. polyedrum est d’un intérêt particulier, car il a plusieurs rythmes circadiens (journalier). À ce jour, toutes les études sur l’expression des gènes lors des changements circadiens ont démontrées une régulation à un niveau traductionnel. Pour mes recherches, j’ai utilisé les approches transcriptomique, protéomique et phosphoprotéomique ainsi que des études biochimiques pour donner un aperçu de la mécanique de la régulation des gènes des dinoflagellés, ceci en mettant l’accent sur l’importance de la phosphorylation du système circadien de L. polyedrum. L’absence des protéines histones et des nucléosomes est une particularité des dinoflagellés. En utilisant la technologie RNA-Seq, j’ai trouvé des séquences complètes encodant des histones et des enzymes modifiant les histones. L polyedrum exprime donc des séquences conservées codantes pour les histones, mais le niveau d’expression protéique est plus faible que les limites de détection par immunodétection de type Western. Les données de séquençage RNA-Seq ont également été utilisées pour générer un transcriptome, qui est une liste des gènes exprimés par L. polyedrum. Une recherche par homologie de séquences a d’abord été effectuée pour classifier les transcrits en diverses catégories (Gene Ontology; GO). Cette analyse a révélé une faible abondance des facteurs de transcription et une surprenante prédominance, parmi ceux-ci, des séquences à domaine Cold Shock. Chez L. polyedrum, plusieurs gènes sont répétés en tandem. Un alignement des séquences obtenues par RNA-Seq avec les copies génomiques de gènes organisés en tandem a été réalisé pour examiner la présence de transcrits polycistroniques, une hypothèse formulée pour expliquer le manque d’élément promoteur dans la région intergénique de la séquence de ces gènes. Cette analyse a également démontré une très haute conservation des séquences codantes des gènes organisés en tandem. Le transcriptome a également été utilisé pour aider à l’identification de protéines après leur séquençage par spectrométrie de masse, et une fraction enrichie en phosphoprotéines a été déterminée comme particulièrement bien adapté aux approches d’analyse à haut débit. La comparaison des phosphoprotéomes provenant de deux périodes différentes de la journée a révélée qu’une grande partie des protéines pour lesquelles l’état de phosphorylation varie avec le temps est reliées aux catégories de liaison à l’ARN et de la traduction. Le transcriptome a aussi été utilisé pour définir le spectre des kinases présentes chez L. polyedrum, qui a ensuite été utilisé pour classifier les différents peptides phosphorylés qui sont potentiellement les cibles de ces kinases. Plusieurs peptides identifiés comme étant phosphorylés par la Casein Kinase 2 (CK2), une kinase connue pour être impliquée dans l’horloge circadienne des eucaryotes, proviennent de diverses protéines de liaison à l’ARN. Pour évaluer la possibilité que quelques-unes des multiples protéines à domaine Cold Shock identifiées dans le transcriptome puissent moduler l’expression des gènes de L. polyedrum, tel qu’observé chez plusieurs autres systèmes procaryotiques et eucaryotiques, la réponse des cellules à des températures froides a été examinée. Les températures froides ont permis d’induire rapidement un enkystement, condition dans laquelle ces cellules deviennent métaboliquement inactives afin de résister aux conditions environnementales défavorables. Les changements dans le profil des phosphoprotéines seraient le facteur majeur causant la formation de kystes. Les phosphosites prédits pour être phosphorylés par la CK2 sont la classe la plus fortement réduite dans les kystes, une découverte intéressante, car le rythme de la bioluminescence confirme que l’horloge a été arrêtée dans le kyste.

Characterization of the molecular clockwork in the cockroach Rhyparobia maderae

Der Wechsel von Tag und Nacht erzeugt einen regelmäßigen Rhythmus von verschiedenen Umweltreizen, allen voran Licht und Temperatur. Fast jedes bis zum heutigen Tage untersuchte Lebewesen besitzt einen endogenen Mechanismus zur Zeitwahrnehmung, und diese "innere Uhr" befähigt Lebewesen dazu, sich vorausschauend an rhythmische Umwelt-Änderungen anzupassen. Circadiane Rhythmen bestehen auch ohne jegliche äußere Reize und basieren auf einem molekularen Rückkopplungs-Mechanismus, der Rhythmen in Genexpression und Proteinkonzentration von etwa 24 Stunden erzeugt. Obwohl sich die grundsätzlichen Mechanismen und Komponenten dieses molekularen Uhrwerks in allen Insekten ähneln, zeigte sich jedoch immer mehr, dass es im Detail doch wesentliche Unterschiede zwischen verschiedenen Insektengruppen gibt. Während das molekulare Uhrwerk der Fruchtfliege Drosophila melanogaster inzwischen sehr gut untersucht ist, fehlen bei den meisten Insektengruppen immernoch eingehende Untersuchungen. Fast nichts ist über die molekulare Basis von circadianen Rhythmen bei der Schabe Rhyparobia maderae bekannt, obwohl diese Art bereits seit Langem als Modellorganismus in der Chronobiologie dient. Um mit der Forschung am molekularen, circadianen System von R. maderae zu beginnen, wurde die Struktur und das Expressionsprofil der core feedback loop Gene per, tim1 und cry2 analysiert. Mittels degenerierten Primern und RACE konnte das vollständige offene Leseraster (OLR) von rmPer und rmCry2, und ein Teil des rmTim1 OLR kloniert werden. Eine phylogenetische Analyse gruppierte rmPER und rmCRY2 gemeinsam mit den Orthologa hemimetaboler Insekten. Viele bei D. melanogaster funktionell charakterisierte Domänen sind bei diesen Proteinen konserviert, was auf eine ähnliche Funktion in der inneren Uhr von R. maderae hinweist. Mittels quantitativer PCR konnte gezeigt werden, dass die mRNA von rmPer, rmTim1 und rmCry2 in verschiedenen Lichtregimen in der gleichen Phasenlage Tageszeit-abhängig schwankt. Die Phasenlage stellte sich bei unterschiedlichen Photoperioden jeweils relativ zum Beginn der Skotophase ein, mit Maxima in der ersten Hälfte der Nacht. Auch im Dauerdunkel zeigen sich Rhythmen in der rmTim1 und rmCry2 Expression. Die Amplitude der rmPer Expressionsrhythmen war jedoch so gering, dass keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Zeitgeberzeiten (ZT) festgestellt werden konnten. Mittels Laufrad-Assays wurde untersucht wie Kurz- und Langtag Lichtregime die Verhaltensrhythmen beeinflussen. Es konnten nur Unterschiede in der Periodenlänge unter freilaufenden Bedingungen festgestellt werden, wenn höhere Lichtintensitäten (1000lx) zur Synchronisation (entrainment) genutzt wurden. Die Periode des freilaufenden Rhythmus war bei Tieren aus dem Kurztag länger. Die photoperiodische Plastizität zeigte sich also auch auf Verhaltensebene, obwohl höhere Lichtintensitäten notwendig waren um einen Effekt zu beobachten. Basierend auf den Sequenzen der zuvor klonierten OLR wurden gegen rmPER, rmTIM1 und rmCRY2 gerichtete Antikörper hergestellt. Die Antikörper gegen rmPER und rmTIM1 erkannten in western blots sehr wahrscheinlich spezifisch das jeweilige Protein. Zeitreihen von Gehirngewebe-Homogenisaten zeigten keinen offensichtlichen circadianen Rhythmus in der Proteinkonzentration, wahrscheinlich auf Grund einer Oszillation mit niedriger Amplitude. In Immunhistochemischen Färbungen konnte nur mit dem gegen rmPER gerichteten Antikörper aus Kaninchen ein Signal beobachtet werden. Beinahe jede Zelle des Zentralnervensystems war rmPER-immunreaktiv im Zellkern. Es konnten keine Unterschiede zwischen den untersuchten ZTs festgestellt werden, ähnlich wie bei den western blot Zeitreihen. In dieser Studie konnten erstmals molekulare Daten der circadianen Uhr von R. maderae erfasst und dargestellt werden. Die Uhrgene per, tim1 und cry2 werden in dieser Schabenart exprimiert und ihre Domänenstruktur sowie das circadiane Expressionsmuster ähneln dem hypothetischen ursprünglichen Insektenuhrwerk, welches der circadianen Uhr von Vertebraten nahesteht. Das molekulare Uhrwerk von R. maderae kann sich an unterschiedliche Photoperioden anpassen, und diese Anpassungen manifestieren sich im Expressionsprofil der untersuchten Uhrgene ebenso wie im Verhalten.

Clock Genes, Melanopsins, Melatonin, and Dopamine Key Enzymes and Their Modulation by Light and Glutamate in Chicken Embryonic Retinal Cells

The avian circadian system is composed of the retina, the mammalian homolog region of the suprachiasmatic nucleus (SNC), and the pineal gland. The retina, itself, displays many rhythmic physiological events, such as movements of photoreceptor cells, opsin expression, retinal reisomerization, and melatonin and dopamine production and secretion. Altogether, these rhythmic events are coordinated to predict environmental changes in light conditions during the day, optimizing retina function. The authors investigated the expression pattern of the melanopsin genes Opn4x and Opn4m, the clock genes Clock and Per2, and the genes for the key enzymes N-Acetyltransferase and Tyrosine Hidroxylase in chicken embryo dispersed retinal cells. Primary cultures of chicken retina from 8-day-old embryos were kept in constant dark (DD), in 12-h light/12-h dark (12L:12D), in 12L:12D followed by DD, or in DD in the absence or presence of 100 mu M glutamate for 12 h. Total RNA was extracted throughout a 24-h span, every 3 h starting at zeitgeber time 0 (ZT0) of the 6th day, and submitted to reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) followed by quantitative PCR (qPCR) for mRNA quantification. The data showed no rhythmic pattern of transcription for any gene in cells kept in DD. However under a light-dark cycle, Clock, Per2, Opn4m, N-Acetyltransferase, and Tyrosine Hydroxylase exhibited rhythmic patterns of transcription. In DD, 100 mu M glutamate was able to induce rhythmic expression of Clock, strongly inhibited the expression of Tyrosine Hydroxylase, and, only at some ZTs, of Opn4x and Opn4m. The neurotransmitter had no effect on Per2 and N-Acetyltransferase transcription. The authors confirmed the expression of the protein OPN4x by immunocytochemistry. These results suggest that chicken embryonic retinal cells contain a functional circadian clock, whose synchronization requires light-dark cycle or glutamate stimuli. (Author correspondence: amdlcast@ib.usp.br).

DAILY VARIATION OF CONSTITUTIVELY ACTIVATED NUCLEAR FACTOR KAPPA B (NFKB) IN RAT PINEAL GLAND

In mammals, the production of melatonin by the pineal gland is mainly controlled by the suprachiasmatic nuclei (SCN), the master clock of the circadian system. We have previously shown that agents involved in inflammatory responses, such as cytokines and corticosterone, modulate pineal melatonin synthesis. The nuclear transcription factor NFKB, detected by our group in the rat pineal gland, modulates this effect. Here, we evaluated a putative constitutive role for the pineal gland NFKB pathway. Male rats were kept under 12 h: 12 h light-dark (LD) cycle or under constant darkness (DD) condition. Nuclear NFKB was quantified by electrophoretic mobility shift assay on pineal glands obtained from animals killed throughout the day at different times. Nuclear content of NFKB presented a daily rhythm only in LD-entrained animals. During the light phase, the amount of NFKB increased continuously, and a sharp drop occurred when lights were turned off. Animals maintained in a constant light environment until ZT 18 showed diurnal levels of nuclear NFKB at ZT15 and ZT18. Propranolol (20 mg/kg, i.p., ZT 11) treatment, which inhibits nocturnal sympathetic input, impaired nocturnal decrease of NFKB only at ZT18. A similar effect was observed in free-running animals, which secreted less nocturnal melatonin. Because melatonin reduces constitutive NFKB activation in cultured pineal glands, we propose that this indolamine regulates this transcription factor pathway in the rat pineal gland, but not at the LD transition. The controversial results regarding the inhibition of pineal function by constant light or blocking sympathetic neurotransmission are discussed according to the hypothesis that the prompt effect of lights-off is not mediated by noradrenaline, which otherwise contributes to maintaining low levels of nuclear NFKB at night. In summary, we report here a novel transcription factor in the pineal gland, which exhibits a constitutive rhythm dependent on environmental photic information. (Author correspondence: rpmarkus@usp.br)

Immunocytochemical characterization of the pregeniculate nucleus and distribution of retinal and neuropeptide Y terminals in the suprachiasmatic nucleus of the Cebus monkey

Circadian rhythms generated by the suprachiasmatic nucleus (SCN) are modulated by photic and non-photic stimuli. In rodents, direct photic stimuli reach the SCN mainly through the retinohypothalamic tract (RHT), whereas indirect photic stimuli are mainly conveyed by the geniculohypothalamic tract (GHT). In rodents, retinal cells form a pathway that reaches the intergeniculate leaflet (IGL) where they establish synapses with neurons that express neuropeptide Y (NPY), hence forming the GHT projecting to the SCN. In contrast to the RHT, which has been well described in primates, data regarding the presence or absence of the IGL and GHT in primates are contradictory. Some studies have suggested that an area of the pregeniculate nucleus (PGN) of primates might be homologous to the IGL of rodents, but additional anatomical and functional studies on primate species are necessary to confirm this hypothesis. Therefore, this study investigated the main histochemical characteristics of the PGN and the possible existence of the GHT in the SCN of the primate Cebus, comparing the distribution of NPY immunoreactivity, serotonin (5-HT) immunoreactivity and retinal terminal fibers in these two structures. The results show that a collection of cell bodies containing NPY and serotonergic immunoreactivity and retinal innervations are present within a zone that might be homologous to the IGL of rodents. The SCN also receives dense retinal innervations and we observed an atypical distribution of NPY- and 5-HT-immunoreactive fibers without regionalization in the ventral part of the nucleus as described for other species. These data may reflect morphological differences in the structures involved in the regulation of circadian rhythms among species and support the hypothesis that the GHT is present in some higher primates (diurnal animals). (C) 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.

"O núcleo supraquiasmático e o folheto intergeniculado do mocó (Kerodon rupestris): Projeções retinianas e caracterização imuno-histoquímica

In this study, two circadian related centres, the suprachiasmatic nucleus (SCN) and the intergeniculate leaflet (IGL) were evaluated in respect to their cytoarchitecture, retinal afferents and chemical content of major cells and axon terminals with a tract tracer and immunohistochemical techniques in the rock cavy (Kerodon rupestris), a Brazilian caviidae rodent species. The rock cavy SCN is innervated in its ventral portion by terminals from the predominantly contralateral retina. It also contains neurophisin and vasoactive intestinal polypeptide immunoreactive cell bodies and neuropeptide Y and enkephalin immunopositive fibres and terminals and is marked by intense GFAP immunoreactivity. The IGL receives a predominantly contralateral retinal projection, contains neuropeptide Y and nitric oxide synthase producing neurons and enkephalin immunopositive terminals and is characterized by dense GFAP immunoreactivity. This is the first report examining the neural circadian system in a crepuscular rodent species for which circadian properties have been described. The results are discussed comparing with what has been described for other species and in the context of the functional significance of these centres

Saguis (Callithrix jacchus) sob ciclo claro-escuro de 21 h: um modelo de dessincronização forçada em primata diurno

The circadian system consists of multiple oscillators organized hierarchically, with the suprachiasmatic nucleus (SCN) as the master oscillator to mammalians. There are lots of evidences that each SCN cell is an oscillator and that entrainment depends upon coupling degree between them. Knowledge of the mechanism of coupling between the SCN cells is essential for understanding entrainment and expression of circadian rhythms, and thus promote the development of new treatments for circadian rhythmicity disorders, which may cause various diseases. Some authors suggest that the dissociation model of circadian rhythm activity of rats under T22, period near the limit of synchronization, is a good model to induce internal desynchronization, and in this way, enhance knowledge about the coupling mechanism. So, in order to evaluate the pattern of the motor activity circadian rhythm of marmosets, Callithrix jacchus, in light-dark cycles at the lower limit of entrainment, two experiments were conducted: 1) 6 adult females were submitted to the LD symmetric cycles T21, T22 and T21.5 for 60, 35 and 48 days, respectively; 2) 4 male and 4 female adults were subjected to T21 for 24 days followed by 18 days of LL, and then back to T21 for 24 days followed by 14 days of LL. Vocalizations of all animals and motor activity of each one of them were continuously recorded throughout the experiments, but the vocalizations were recorded only in Experiment 1. Under the Ts shorter than 24 h, two simultaneous circadian components appeared in motor activity, one with the same period of LD cycle, named light-entrained component, and the other in free-running, named non-light-entrained component. Both components were displayed for all the animals in T21, five animals (83.3%) in T21.5 and two animals (33.3%) in T22. For vocalizations both components were observed under the three Ts. Due to the different characteristics of these components we suggest that dissociation is result of partial synchronization to the LD cycle, wherein at least one group oscillator is synchronized to the LD by relative coordination and masking processes, while at least another group of oscillators is in free-running, but also under the influence of masking by the LD. As the T21 h was the only cycle able to promote the emergence of both circadian components in circadian rhythms of all Callithrix jacchus, this was then considered the lower entrainment limit of LD cycle promoter of dissociation in circadian rhythmicity of this species, and then suggested as a non-human primate model for forced desynchronization