Vakzinierung gegen die murine kutane Leishmaniose mit TAT-LACK transduzierten dendritischen Zellen

In der murinen kutanen Leishmaniose ist die Ausheilung der Infektion mit dem Auftreten von sch��tzenden CD4+ Th1- sowie CD8+ Tc1-Immunantworten assoziiert. Daher sollte eine wirksame Vakzine beide T-Zell-Populationen induzieren. Im Rahmen dieser Dissertation konnte gezeigt werden, da�� mit TAT-LACK Fusionsproteinen effektiv gegen eine progressiv verlaufende Infektion mit Leishmania major in empfindlichen BALB/c sowie resistenten C57BL/6 M��usen vakziniert werden kann. TAT-LACK konnte hierbei sowohl im DC- als auch im proteinbasierten Ansatz protektive Immunit��t verleihen. Das TAT-Peptid ist in der Lage, Proteine direkt in das Zytosol von DC zu schleusen und so den f��r die CD8+ T-Zell-Antworten erforderlichen MHC Klasse I Pr��sentationsweg einzuschlagen. Stammesspezifische Untersuchungen des inflammatorischen Infiltrates in L��sion und Lymphknoten best��tigten die physiologische Relevanz von DC und CD8+ T-Zellen im Verlauf einer etablierten Leishmania-Infektion in beiden Mausst��mmen und rechtfertigten somit den Einsatz einer DC basierten Vakzine, die vermehrt CD8+ T-Zellen induzieren sollte. Tats��chlich konnte mit TAT-LACK transduzierten DC in beiden Mausst��mmen effektiv gegen eine progressiv verlaufende Leishmania-Infektion vakziniert werden. Der Vakzinierungserfolg lie�� sich anhand verringerter L��sionsvolumina, reduzierter Parasitenlasten und einer Verschiebung des Zytokinprofils in Richtung einer Th1 dominierten Immunantwort best��tigen. In allen Ans��tzen war die i.d. Vakzinierung mit TAT-LACK transduzierten DC der Injektion von LACK gepulsten DC ��berlegen. Experimente mit DC aus IL-12p40 defizienten M��usen belegten die IL-12 Abh��ngigkeit der Vakzine. Mit Hilfe von in vitro Restimulierungsexperimenten konnte nachgewiesen werden, da�� nach Applikation TAT-LACK transduzierter DC in beiden Mausst��mmen vermehrt CD8+ T-Zellen induziert werden. Des weiteren waren TAT-LACK transduzierte DC in Restimulationsexperimenten st��rkere Aktivatoren der CD8+ T-Zell-Proliferation als LACK gepulste DC. Depletionsexperimente best��tigten die T-Zell-Abh��ngigkeit der Vakzine. Weitere in vivo Versuche belegten zudem die protektive Wirkung von TAT-LACK Fusionsproteinen im direkten, proteinbasierten Vakzinierungsansatz. Floreszenzmikroskopische Analysen der Epidermis best��tigten hierbei Aktivierung und Auswanderung von LC nach i.d. TAT-LACK Applikation.

In vitro generation and characterization of acute myeloid leukemia-reactive CD8 + cytotoxic T-lymphocyte clones from healthy donors

Donor-derived CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) eliminating host leukemic cells mediate curative graft-versus-leukemia (GVL) reactions after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). The leukemia-reactive CTLs recognize hematopoiesis-restricted or broadly expressed minor histocompatibility and leukemia-associated peptide antigens that are presented by human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on recipient cells. The development of allogeneic CTL therapy in acute myeloid leukemia (AML) is hampered by the poor efficiency of current techniques for generating leukemia-reactive CTLs from unprimed healthy donors in vitro. In this work, a novel allogeneic mini-mixed lymphocyte/leukemia culture (mini-MLLC) approach was established by stimulating CD8+ T cells isolated from peripheral blood of healthy donors at comparably low numbers (i.e. 10e4/well) with HLA class I-matched primary AML blasts in 96-well microtiter plates. Before culture, CD8+ T cells were immunomagnetically separated into CD62L(high)+ and CD62L(low)+/neg subsets enriched for naive/central memory and effector memory cells, respectively. The application of 96-well microtiter plates aimed at creating multiple different responder-stimulator cell compositions in order to provide for the growth of leukemia-reactive CTLs optimized culture conditions by chance. The culture medium was supplemented with interleukin (IL)-7, IL-12, and IL-15. On day 14, IL-12 was replaced by IL-2. In eight different related and unrelated donor/AML pairs with complete HLA class I match, numerous CTL populations were isolated that specifically lysed myeloid leukemias in association with various HLA-A, -B, or -C alleles. These CTLs recognized neither lymphoblastoid B cell lines of donor and patient origin nor primary B cell leukemias expressing the corresponding HLA restriction element. CTLs expressed T cell receptors of single V-beta chain families, indicating their clonality. The vast majority of CTL clones were obtained from mini-MLLCs initiated with CD8+ CD62L(high)+ cells. Using antigen-specific stimulation, multiple CTL populations were amplified to 10e8-10e10 cells within six to eight weeks. The capability of mini-MLLC derived AML-reactive CTL clones to inhibit the engraftment of human primary AML blasts was investigated in the immunodeficient nonobese diabetic/severe combined immune deficient IL-2 receptor common ��-chain deficient (NOD/SCID IL2R��null) mouse model. The leukemic engraftment in NOD/SCID IL2R��null was specifically prevented if inoculated AML blasts had been pre-incubated in vitro with AML-reactive CTLs, but not with anti-melanoma control CTLs. These results demonstrate that myeloid leukemia-specific CTL clones capable of preventing AML engraftment in mice can be rapidly isolated from CD8+ CD62L(high)+ T cells of healthy donors in vitro. The efficient generation and expansion of these CTLs by the newly established mini-MLLC approach opens the door for several potential applications. First, CTLs can be used within T cell-driven antigen identification strategies to extend the panel of molecularly defined AML antigens that are recognizable by T cells of healthy donors. Second, because these CTLs can be isolated from the stem cell donor by mini-MLLC prior to transplantation, they could be infused into AML patients as a part of the stem cell allograft, or early after transplantation when the leukemia burden is low. The capability of these T cells to expand and function in vivo might require the simultaneous administration of AML-reactive CD4+ T cells generated by a similar in vitro strategy or, less complex, the co-transfer of CD8-depleted donor lymphocytes. To prepare clinical testing, the mini-MLLC approach should now be translated into a protocol that is compatible with good manufacturing practice guidelines.

Identification of preferentially targeted tumor-associated antigens in melanoma patients via mRNA stimulation of CD8+ blood lymphocytes

Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individual���s HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination.

Evaluation der Leuk��mie-Reaktivit��t von PRAME- und p53-spezifischen T-Zellen bei lymphoh��matopoetischen Neoplasien im Rahmen einer adoptiven Immuntherapie

Der Transplantat-gegen-Leuk��mie (GVL) Effekt als immuntherapeutisches Mittel bei der allogenen h��matopoetischen Stammzell Transplantation (HSZT) ist haupts��chlich durch Spender Lymphozyten vermittelt, welche h��matopoetische Minor-Histokompatibilit��ts Antigene bzw. Leuk��mie-assoziierte Antigene (z. B.: PRAME, p53) erkennen. Der adoptive Transfer von Leuk��mie-spezifischen T-Zellen kann den GVL-Effekt, ohne ein Auftreten einer Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung (GVHD), steigern. Unter Verwendung von HLA-A2 und human CD8 transgenen M��usen (CD8yCyA2Kb) konnten in dieser Arbeit PRAME spezifische CD8+ zytotoxischen T-Zellen generiert werden. Diese zytotoxischen CD8+ T-Zellen zeigten in Chromfreisetzungsuntersuchungen lytische Aktivit��t gegen eine Vielzahl von Zelllinien, die PRAME endogen prozessieren sowie gegen das spezifische PRAME-Peptid. Des Weiteren wurden die hier generierten T-Zellen auf ihre zytotoxische Aktivit��t gegen akute myeloische Leuk��mie Blasten hin untersucht, und diese Untersuchungen zeigten AML-Reaktivit��t der PRAME-spezifischen sowie der als Vergleich genutzten p53- und HLA-A2-spezifischen T-Zellen. Das Potenzial der PRAME-spezifischen ZTL die GVL-Immunit��t in vivo zu erh��hen ohne das Vorkommen einer GVHD wurde in einem Tumor-Protektions-Model unter der Nutzung von NOD/SCIDgcnull M��usen untersucht. Die PRA100- bzw. p53-ZTL wurden adoptiv in NOD/SCIDgcnull Rezipienten transferiert und gleichzeitig wurden die Tiere mit PRAME-, oder p53-exprimierende Tumorzelllinien inokuliert. Die Reduktion des Tumorwachstums best��tigte die Spezifit��t der T-Zellen auch in vivo. In weiteren in vivo Experimenten wurden NOD/SCIDgcnull M��use mit AML-Blasten rekonstituiert. Durch die Applikation von nur CD34 positiven Zellen aus einer AML-Probe, oder einer CD56 depletierten Probe, konnten Rekonstitutionen in 95 % aller Versuche erfolgreich beendet werden. Wurde eine Rekonstitution mittels PCR- und FACS-Analysen diagnostiziert, so folgten mehrere Applikationen der PRAME- oder p53-spezifischen ZTL. In diesen Untersuchungen konnten wir in einem therapeutischen AML-in vivo-Modell zeigen, dass die in diesen Untersuchungen generierten/verwandten ZTL in der Lage sind AML-Blasten in vivo zu bek��mpfen und so die leuk��mische Last der Tiere im Blut sowie in der Milz auf unter 1 % zu regulieren. Der prozentuale Anteil humaner AML Zellen im Knochenmark konnte deutlich gesenkt werden (< 10 %). Zusammenfassend sind die von uns generierten PRAME-spezifischen T-Zellen in der Lage, in vitro und auch in vivo, endogen prozessiertes Protein auf Zelllinien und AML-Blasten zu erkennen und zu lysieren. Auch die p53-ZTL, welche als eine weitere Antigen-spezifische ZTL-Population in vivo getestet wurden, zeigten GVL-Effekte. Die Kenntnis von Tumor- bzw. Leuk��mie assoziierten Antigenen und die daraus erwachsene M��glichkeit der Generierung krankheitsspezifischer ZTL bietet die Grundlage f��r eine spezifische Immuntherapie maligner Erkrankungen.

Die Rolle CD4 + CD25 + regulatorischer T-Zellen in der Niedrigzonentoleranz gegen��ber Kontaktallergenen

Die allergische Kontaktdermatitis ist eine der h��ufigsten Berufserkrankungen, die durch die Exposition mit hohen Mengen eines Kontaktallergens ausgel��st wird. In Mausmodellen sehen wir, dass mittels einer Niedrigzonentoleranz (NZT) die Bildung einer Kontaktsensibilisierung unterdr��ckt werden kann. Bei der NZT f��hrt die epikutane Applikation von subimmunogenen Dosen zu einer systemischen Toleranzentwicklung, die durch CD8+ Suppressor-T-Zellen Hapten-spezifisch vermittelt wird. F��r die Generierung dieser CD8+ Suppressor-T-Zellen sind IL-10-sezernierende CD4+ regulatorischen T-Zellen (Tregs) notwendig. Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollte in dieser Arbeit ��berpr��ft werden, ob nat��rlichen Tregs (nTregs) bei der NZT eine Rolle spielen und die Funktion und Aufgaben dieser Zellen w��hrend der NZT untersucht werden. rnWir konnten keine erh��hte Anzahl von nTregs w��hrend der Niedrigzonentoleranz gegen��ber Kontaktallergenen im Vergleich zur CHS charakterisieren. Weiterhin haben wir gezeigt, dass eine Reduktion der nTregs durch Depletion mittels anti-CD25-Anik��rper oder durch Cyclophosphamid-Gabe die Entstehung der CD8+ Suppressor-T-Zellen der NZT unterdr��ckt und damit die Entwicklung der Toleranzreaktion verhindert wird. Ferner wurde beobachtet, dass eine epikutane NZT Hapten-spezifisch durch CD8+ T-Zellen ��bertragen werden kann, w��hrend CD4+CD25+ T-Zellen eine Hapten-unspezifische Wirkung zeigten.rn

Studying MHC I-dependent CD8 + T cell responses in the model of murine cutaneous leishmaniasis

Der Ausheilung von Infektionen mit Leishmania major liegt die Sekretion von IFN-��� von sowohl CD4+ als auch CD8+ T Zellen zugrunde.rnAktuell konnte in der Literatur nur ein Epitop aus dem parasit��ren LACK Protein f��r eine effektive CD4+ T Zell-vermittelte Immunantwort beschrieben werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, m��gliche MHC I abh��ngige CD8+ T Zell Antworten zu untersuchen. rnF��r diesen Ansatz wurde als erstes der Effekt einer Vakzinierung mit LACK Protein fusioniert an die Protein-Transduktionsdom��ne des HIV-1 (TAT) analysiert. Die Effektivit��t von TAT-LACK gegen��ber CD8+ T Zellen wurde mittels in vivo Protein-Vakzinierung von resistenten C57BL/6 M��usen in Depletions-Experimenten gezeigt.rnDie Prozessierung von Proteinen vor der Pr��sentation immunogener Peptide gegen��ber T Zellen ist unbedingt erforderlich. Daher wurde in dieser Arbeit die Rolle des IFN-���-induzierbaren Immunoproteasoms bei der Prozessierung von parasit��ren Proteinen und Pr��sentation von Peptiden gebunden an MHC I Molek��le durch in vivo und in vitro Experimente untersucht. Es konnte in dieser Arbeit eine Immunoproteasom-unabh��ngige Prozessierung aufgezeigt werden.rnWeiterhin wurde Parasitenlysat (SLA) von sowohl Promastigoten als auch Amastigoten fraktioniert. In weiterf��hrenden Experimenten k��nnen diese Fraktionen auf immunodominante Proteine/Peptide hin untersucht werden. rnLetztlich wurden Epitop-Vorhersagen f��r CD8+ T Zellen mittels computergest��tzer Software von beiden parasit��ren Lebensformen durchgef��hrt. 300 dieser Epitope wurden synthetisiert und werden in weiterf��hrenden Experimenten zur Charakterisierung immunogener Eigenschaften weiter verwendet. rnIn ihrer Gesamtheit tr��gt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verst��ndnis ��ber die komplexen Mechanismen der Prozessierung und letztendlich zur Identifikation von m��glichen CD8+ T Zell Epitopen bei. Ein detailiertes Verst��ndnis der Prozessierung von CD8+ T Zell Epitopen von Leishmania major ��ber den MHC Klasse I Weg ist von h��chster Bedeutung. Die Charakterisierung sowie die Identifikation dieser Peptide wird einen ma��geblichen Einfluss auf die weiteren Entwicklungen von Vakzinen gegen diesen bedeutenden human-pathogenen Parasiten mit sich bringen. rn

Regulation der Funktion dendritischer Zellen im immunologischen steady state

Dendritische Zellen sind professionelle Antigenpr��sentierende Zellen und ��bernehmen sowohl in der Aktivierung naiver T-Zellen als auch in der Aufrechterhaltung peripherer Toleranz eine zentrale Funktion. Ruhende Dendritische Zellen im immunologischen Steady State induzieren antigenspezifisch Toleranz in autoreaktiven T-Zellen, welche bei der negativen Selektion im Thymus nicht eliminiert wurden und verhindern somit die Entstehung von Autoimmunit��t. Mit Hilfe eines transgenen Maus Modells, welches die induzierbare Expression transgen kodierter CD8+ T-Zell-Epitope auf ruhenden Dendritischen Zellen erlaubt, konnten wir zeigen, dass die periphere Toleranz Induktion durch Dendritische Zellen in Abwesenheit von regulatorischen T-Zellen beeintr��chtigt ist. Wir konnten verdeutlichen, dass f��r die Suppression von steady-state Dendritischen Zellen die Erkennung von MHC Klasse II Molek��len auf Dendritischen Zellen durch den T-Zell-Rezeptor regulatorischer T-Zellen zwingend erforderlich ist. In Abwesenheit dieser suppressiven Interaktion hatten Dendritische Zellen einen aktivierten Ph��notyp und l��sten eine funktionale T-Zell-Antwort aus, anstatt periphere Toleranz zu induzieren. Als Folge dessen entwickelten M��use, in denen Dendritische Zellen nicht antigenspezifisch mit suppressiven CD4+ T-Zellen interagieren konnten, spontane Autoimmunit��t, welche durch CD8+ T-Zellen mediiert wurde. Wir konnten weiterhin zeigen, dass der Verlust peripherer T-Zell Toleranz durch basale Level an Typ I Interferonen mediiert wird sowie durch CD40 Signale, welche von adaptiven Immunzellen geliefert werden.

CD137-selektierte leuk��miereaktive T-Zellen gesunder Spender zur adoptiven Immuntherapie stammzelltransplantierter Leuk��miepatienten = CD137-selected leukaemia-reactive T Cells from healthy donors for adoptive immunotherapy in stem-cell-transplanted leukaemia-patients

Bei stammzelltransplantierten Patienten, die ein Rezidiv ihrer Leuk��mie erleiden, kann eine Donor-Lymphozyten-Infusion (DLI) dauerhafte vollst��ndige Leuk��mieremissionen induzieren. T-Zellen in der DLI vermitteln sowohl den potentiell kurativen Graft-versus-Leukaemia (GVL) Effekt, als auch die potentiell lebensbedrohliche Graft-versus-Host Disease (GVHD). Hingegen k��nnte die Infusion von leuk��miereaktiven T-Zellen einen selektiven GVL Effekt und einen Langzeitschutz vor Rezidiven durch eine spezifisch gegen die Leuk��mie gerichtete Immunantwort und Immunit��t vermitteln. Unsere Arbeitsgruppe hat Protokolle zur in vitro Generierung leuk��miereaktiver T-Zellen entwickelt, die hohe zytotoxische Aktivit��t gegen akute myeloische Leuk��mie-Blasten (AML) bei minimaler Reaktion auf m��gliche GVHD Zielstrukturen zeigen. F��r die klinische Anwendung sind diese Protokolle jedoch zu aufw��ndig, wobei vor allem eine erhebliche Verk��rzung der Kulturzeit auf wenige Wochen erforderlich ist. Diese Verk��rzung der in vitro Kulturzeit k��nnte das Wachstum von T-Zellen vom central memory oder fr��hen effector memory Ph��notyp f��rdern, f��r die eine bessere in vivo Effektorfunktion und l��ngere Persistenz im Rezipienten verglichen mit T-Zellen aus Langzeitkultur gezeigt werden konnte. Der Aktivierungsmarker und Kostimulations-Rezeptor CD137 kann zur Erkennung und Isolation antigenspezifischer T-Zellen genutzt werden, ohne dass daf��r das von den T-Zellen erkannte Peptidepitop bekannt sein muss. Eine CD137-vermittelte Anreicherung mit Hilfe von clinical grade Materialien k��nnte verwendet werden, um DLI-Produkte mit leuk��miespezifischen T-Zellen herzustellen, die sich sowohl durch eine effizientere T-Zell Generierung durch in vitro Selektion und Kostimulation, als auch durch eine verbesserte Spezifit��t des T-Zell-Produkts auszeichnen. Lymphozyten-Leuk��mie Cokulturen (mixed lymphocyte leukaemia cultures) wurden mit CD8 T-Zellen gesunder Spender und HLA-identischen oder einzel-HLA-mismatch AML-Blasten angesetzt und w��chentlich restimuliert. Nach zwei Wochen wurden die T-Zellen 12 Stunden nach Restimulation ��ber den Marker CD137 positiv isoliert und anschlie��end separat weiterkultiviert. Die isolierten Fraktionen und unseparierten Kontrollen wurden im ELISPOT-Assay und im Chrom-Freisetzungstest an Tag 5 nach der Restimulation getestet. Es wurden keine konsistent nachweisbaren Vorteile im Hinblick auf Wachstum und Funktion der isolierten CD137-positiv Fraktion im Vergleich zur unseparierten Kontrolle gefunden. Verschiedene Isolationsmethoden, Patient-Spender-Systeme, Methoden zur Restimulation, Temperaturbedingungen, Zytokinkombinationen und Methoden der Zytokinzugabe sowie zus��tzliche Feeder-Zellen oder AML-Blasten konnten Wachstum, funktionelle Daten und die deutlichen Zellverluste w��hrend der Isolation nicht entscheidend beeinflussen. Vitalf��rbungen zeigten, dass aktivierungsinduzierter Zelltod CD137-positiver Zellen zu diesen Ergebnissen beitragen k��nnte. Im Gegensatz zur Stimulation mit AML-Blasten wurden erfolgreiche CD137-Anreicherungen f��r peptidstimulierte T-Zellen publiziert. Unterschiedliche CD137-Expressionskinetiken, aktivierungsinduzierter Zelltod und regulatorische T-Zellen sind m��gliche Faktoren aufgrund derer die CD137-Anreicherung in diesem spezifischen Kontext ungeeinet sein k��nnte. Der stimulatorische Effekt eines CD137-Signals auf AML-reaktive CD8 T-Zellen wurde mit Hilfe von CD3/CD28 und CD3/CD28/CD137 Antik��rper-beschichteten magnetischen beads untersucht. F��r Nierenzellkarzinom-reaktive T-Zellen war die Stimulation mit CD3/CD28/CD137 beads genauso effektiv wie mit Tumorzellen und effektiver als mit CD3/CD28 beads. Beide Arten von beads waren f��r eine Stimulation w��hrend der ersten Wochen der Zellkultur geeignet, sodass ein zus��tzliches CD137-Signal f��r die l��nger anhaltende Expansion tumorreaktiver T-Zellen zur klinischen Anwendung n��tzlich sein k��nnte. Die bead-Expansion ver��nderte die IFN-Sekretion im ELISPOT nicht, aber verursachte eine m����ige Verschlechterung der Zytotoxizit��t im Chrom-Freisetzungstest. Im Gegensatz dazu zeigten bei AML-reaktiven T-Zellen beide Arten von beads einen nicht apoptosevermittelten, dosisabh��ngigen zellsch��digenden Effekt, der zu einer raschen Abnahme der Zellzahl in Kulturen mit beads f��hrte. Unerw��nschte Effekte auf die T-Zell-Funktionalit��t durch bead-Stimulation sind in der Literatur beschrieben, dennoch gibt es aktuell keine Ver��ffentlichungen, die eine fundierte Erkl��rung f��r den Effekt auf AML-reaktive T-Zellen bieten k��nnten. Abgesehen von Literaturdaten, die darauf hindeuten, dass CD137 ein vielversprechendes Kandidatenmolek��l f��r die Anreicherung und Expansion von AML-reaktiven T-Zellen sein k��nnte, zeigen die eigenen Daten sowohl zur CD137-Isolation als auch zur bead-Stimulation, dass f��r diese spezielle Anwendung CD137 ein ungeeigneter Aktivierungsmarker und Kostimulations-Ligand ist.

Einfluss Zelltod-inhibierender Proteine des murinen Cytomegalovirus auf die Initiation der antiviralen CD8 T-Zellantwort

Die Inhibition des programmierten Zelltods ist ein essentieller Faktor der viralen Replikationsf��higkeit. Das murine Cytomegalovirus kodiert deshalb f��r verschiedene Zelltod-inhibierende Gene, um dem programmierten Zelltod zu entgehen bis die Virusproduktion abgeschlossen ist. Da die Expression des viralen anti-apoptotischen Gens M36 infizierte Makrophagen vor der Apoptose sch��tzt (Menard et al., 2003), wurde in der vorliegenden Arbeit unter Verwendung der Deletionsmutante mCMV-��M36 (��M36) der Einfluss von Apoptose auf das Priming Epitop-spezifischer CD8 T-Zellen untersucht.rnInteressanterweise waren die Frequenzen mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen nach Infektion mit ��M36 f��r alle getesteten Epitope sowohl im Haplotyp H-2d als auch im Haplotyp H-2b deutlich erh��ht. Zus��tzlich konnte mit Hilfe der mCMV-ORF-Library eine Verbreiterung des CD8 T-Zellepitop-Repertoire nach Infektion mit ��M36 nachgewiesen werden, was neben der quantitativen auch eine qualitative Steigerung des CD8 T-Zell-Primings aufzeigt.rnIn der funktionellen Revertante ��M36-FADDDN wird die anti-apoptotische Funktion durch eine dominant-negative Form des zellul��ren Adapterproteins FADD (FADDDN) substituiert (Cicin-Sain et al., 2008), die das Apoptose-Signaling verhindert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression von FADDDN nicht nur den Apoptose-Ph��notyp wieder revertiert, sondern auch die Verbesserung des CD8 T-Zell-Primings aufhebt. Diese Beobachtung belegt eindeutig, dass das verbesserte CD8 T-Zell-Priming auf einer verst��rkten Apoptose-Induktion beruht.Bemerkenswerterweise konnte das verbesserte Priming auch nach Deletion des anti-nekroptotischen Gens M45 nachgewiesen werden. So konnte nach Infektion mit mCMV-M45-BamX (M45-BamX) (Brune et al., 2001) gezeigt werden, dass auch die Induktion der Nekroptose zu einem verbesserten CD8 T-Zell-Priming sowie zu einer Verbreiterung des CD8 T-Zellepitop-Repertoires f��hrt.Nach Infektion von Cross-Priming-defizienten 3d-M��usen (Tabeta et al., 2006) konnte eine Steigerung mCMV-spezifischer CD8 T-Zell-Frequenzen in Abwesenheit von M36 oder M45 nicht beobachtet werden. Dieser Befund l��sst auf ein erh��htes Cross-Priming von CD8 T-Zellen durch ��M36 oder M45-BamX infolge einer verst��rkten Induktion des programmierten Zelltods schlie��en.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Inhibition des programmierten Zelltods durch die mCMV-Gene M36 und M45 das CD8 T-Zell-Priming limitiert. Somit f��rdern virale Zelltod-inhibierende Gene die virale Replikationsf��higkeit, indem sie die Virusproduktion per se in der individuellen Zelle steigern und zus��tzlich die Immunkontrolle reduzieren, was wiederum eine verbesserte Dissemination in vivo erm��glicht.

Mechanismen der Antigenpr��sentation bei der Induktion der CD8-T-Zellantwort gegen das murine Cytomegalovirus

Die Kontrolle der Cytomegalovirus(CMV)-Infektion durch CD8 T-Zellen ist abh��ngig von der effizienten MHC-Klasse-I-Pr��sentation viraler Peptide auf der Zelloberfl��che. Um die Erkennung infizierter Zellen zu unterdr��cken, interferieren w��hrend der Early (E)-Phase der murinen CMV (mCMV)-Infektion virale Immunevasine mit dem intrazellul��ren Transport von Peptid-MHC-I (pMHC-I) Komplexen. Den Immunevasinen gelingt es allerdings nicht, ein Priming mCMV-spezifischer CD8 T-Zellen zu verhindern. Daher wurde angenommen, dass die Initiation der antiviralen CD8 T-Zellantwort prim��r auf der Cross-Pr��sentation viraler Peptide auf nicht-infizierten, professionellen Antigen-pr��sentierenden Zellen (profAPC) beruht und damit unabh��ngig von viralen Immunevasionsmechanismen ist.rnIm Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde mittels BAC-Mutagenese eine mCMV-Rekombinante generiert, um die direkte Pr��sentation viraler Peptide durch die zus��tzliche Expression des zentralen Immunevasins m152 bereits in der Immediate Early (IE)-Phase verst��rkt zu unterdr��cken. Wie erwartet reduzierte die verst��rkte m152-Expression sowohl in der IE- als auch in der E-Phase die pMHC-I-Pr��sentation in vitro. Dies f��hrte ��berraschenderweise nach Infektion immunkompetenter BALB/c-M��use (Haplotyp H-2d) zu einer verminderten CD8 T-Zellantwort und damit zur Verschlechterung der Kontrolle der Infektion im drainierenden Lymphknoten. Diese Beobachtungen weisen erstmals auf einen wichtigen Beitrag der direkten Antigenpr��sentation bei der Initiation der mCMV-spezifischen CD8 T-Zellantwort im immunkompetenten Wirt hin. Zus��tzlich konnte auch nach mCMV-Infektion von Cross-Pr��sentations-defizienten M��usen (Haplotyp H-2b) eine antivirale CD8 T-Zellantwort initiiert werden. Diese Beobachtung best��tigt, dass durch direkte Antigenpr��sentation auf infizierten profAPC trotz viraler Immunevasionsmechanismen eine CD8 T-Zellantwort induziert werden kann. Allerdings wurde weder die antivirale CD8 T-Zellantwort noch die Kontrolle der Infektion im Haplotyp H-2b durch die verst��rkte m152-Expression moduliert.rnIn einem weiteren Teil der Arbeit konnte im klinisch relevanten Modellsystem der mCMV-Infektion von Knochenmarktransplantations (KMT)-Rezipienten (Haplotyp H-2d) gezeigt werden, dass die verst��rkte m152-Expression die Rekrutierung IE1-spezifischer CD8 T-Zellen in die infizierte Lunge unterdr��ckt. Dies konnte sowohl fr��h nach Infektion, als auch w��hrend der viralen Latenz nachgewiesen werden. Zus��tzlich war die Rekrutierung IE1-spezifischer CD8 T-Zellen in die Lunge deutlich vermindert in Ld--Rezipienten von Ld+-h��matopoetischen Zellen, die das IE1-pr��sentierende MHC-I-Molek��l Ld nicht auf den nicht-h��matopoetischen Gewebszellen exprimieren. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Rekrutierung antiviraler CD8 T-Zellen in ein peripheres Organ von der direkten Antigenpr��sentation auf nicht-h��matopoetischen, infizierten Gewebszellen bestimmt wird.rnIn der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass trotz viraler Immunevasionsmechanismen nach mCMV-Infektion des immunkompetenten Wirtes und des KMT-Rezipienten die antivirale CD8 T-Zellantwort von der direkten Antigenpr��sentation bestimmt wird.

Einfluss des Treg-Aktivierungsmarkers GARP auf die Differenzierung und Funktion von T-Zellen

CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen (Treg) spielen eine essentielle Rolle bei der Unterdr��ckung von sch��dlichen Immunreaktionen. Da aktivierte CD4+ T-Helferzellen auch CD25 und FoxP3 exprimieren, k��nnen diese nicht als spezifische Marker zur Identifikation von Treg verwendet werden. Die Analyse der Membranproteinexpression beider Populationen f��hrte zur Identifikation von GARP (glycoprotein A repetitions predominant) als spezifischer Marker auf aktivierten Treg. GARP bindet LAP und TGF-beta, welches f��r die Unterdr��ckung von entz��ndlichen T-Zellantworten von Bedeutung ist. Um die Funktion von GARP unabh��ngig von Treg zu untersuchen, wurde ein l��sliches GARP Protein (sGARP) synthetisiert und sein Effekt auf die Aktivierung und Differenzierung von humanen T-Zellen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass sGARP die Proliferation von naiven CD4+ T-Zellen supprimiert und zu einer Phosphorylierung von SMAD2/3 sowie zu der Induktion von FoxP3 f��hrt. Zus��tzlich inhibiert sGARP die Produktion von Effektorzytokinen wie IL-2 und IFN-gamma. Die Stimulation von naiven CD4+ T-Zellen mit sGARP induziert die Differenzierung zu Treg, welche in Kokultur die Aktivierung von T-Effektorzellen supprimieren. Die Wirkung war vergleichbar in naiven CD4+ und ruhenden CD4+CD45RA+ T-Zellen, konnte aber in differenzierten CD4+CD45RO+ T-Zellen nicht nachgewiesen werden. Die Induktion von FoxP3 und die Phosphorylierung von SMAD2/3 konnte durch eine Blockade des TGF-beta-Signalweges inhibiert werden. Dies l��sst vermuten, dass die Funktion von sGARP zumindest teilweise von TGF-beta abh��ngig ist. Zus��tzlich zu seiner passiven Rolle als TGF-beta-Transporter, induzierte sGARP die TGF-beta-Produktion in naiven T-Zellen und tr��gt so zum Mechanismus der infekti��sen Toleranz bei. Des Weiteren f��rdert die Stimulation von sGARP in Anwesenheit von IL-6 und IL-23 die Differenzierung zu Th17 Zellen. rnNeben dem Einfluss von sGARP auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, supprimiert sGARP die Proliferation und Granzyme B-Expression in CD8+ T-Zellen. rnF��r die Analyse der immunmodulatorischen Funktion von sGARP in vivo wurde ein Modell einer xenogenen GvHD (graft-versus-host disease) verwendet. Der Transfer von humanen PBMC in neugeborene, immundefiziente Rag2-/-gamma-chain-/--M��use f��hrt zu einer letalen GvHD, welche durch die Applikation von humanen Treg dosisabh��ngig unterdr��ckt werden kann. In diesem Modell konnte die repetitive Gabe von sGARP, ohne zus��tzliche Zugabe von Treg, ebenfalls die GvHD unterdr��cken. Dies l��sst auf einen synergistischen Effekt von sGARP und Treg bei der Suppression inflammatorischer T-Zellantworten schlie��en. rnZusammengefasst lassen die Ergebnisse auf eine entscheidende Rolle von GARP in der Modulation der peripheren Toleranz folgern und zeigen sGARP als potentes Biological f��r die Behandlung von unerw��nschten inflammatorischen Immunantworten.

Optimierte biologische Aktivit��t allo- und tumorreaktiver CD8-+-T-Lymphozyten im humanisierten Mausmodell durch IL-15-Superagonisten

Interleukin 15 (IL-15) gilt als eines der vielversprechendsten zuk��nftigen Medikamente f��r die Krebstherapie. Es f��rdert die Proliferation, Persistenz und Funktion von CD8+ T-Zellen und vermittelt zahlreiche Effekte, die es als ��berlegene Alternative f��r das derzeit in der Klinik verwendete IL-2 erscheinen lassen. F��r den Einsatz von IL-15 in der vorliegenden Arbeit wurde zun��chst ein Protokoll zur Herstellung von rekombinantem IL-15 in E. coli etabliert. Das hergestellte Protein hatte eine zu kommerziellen Produkten vergleichbare Bioaktivit��t und beg��nstigte die Persistenz und Aktivit��t antigenspezifischer, humaner CD8+ T Zellen nach adoptivem Transfer in NSG-M��use, wobei unter anderem ein verst��rkter Effekt auf T Zellen mit TSCM-Ph��notyp beobachtet wurde. Um die Bioaktivit��t von IL-15 zu steigern, wurden super-agonistische IL-15-Fusions��proteine entworfen und im Expi293-System hergestellt. Dabei wurde IL 15 kovalent mit der Sushi-Dom��ne, der IL-15R��-Kette und einer IgG1-Fc-Dom��ne verbunden, was zu einer gesteigerten Affinit��t der IL 15-Superagonisten zum physiologischen, niederaffinen IL 15R���� und zu einer stark erh��hten Halbwertszeit in Mausserum f��hrte. Die gesteigerte Affinit��t der IL-15-Super��agonisten wurde durch die IL 15R��-Sushi-Dom��ne vermittelt. Eine um 13 Amino��s��uren verl��ngerte Sushi-Dom��ne zeigte im Vergleich zur normalen Form eine nochmals ge��steigerte Affinit��t. Die l��ngere Halbwertszeit wurde von der Sushi- und der IgG1-Fc-Dom��ne vermittelt. Die IgG1-Fc-Dom��ne verst��rkte die Wirkung der Fusionsproteine zus��tzlich ��ber einen Mechanismus, der wahrscheinlich mit der Transpr��sentation durch Fc Re��ze��ptoren zusammen���h��ngt. Die gesteigerte Bioaktivit��t der IL-15-Superagonisten wurde im Tiermodell mit humanen und murinen T-Zellen best��tigt und ILR13+-Fc wurde als das Fusionsprotein mit der h��chsten Bioaktivit��t identifiziert. Im Vergleich zu anderen IL-15-Superagonisten vereint es alle derzeit bekannten Eigenschaften zur Bioaktivit��tssteigerung in einem einzigen Protein. In therapeutischen Versuchen mit adoptivem Transfer tumorreaktiver T-Zellen konnte der Antitumoreffekt durch ILR13+-Fc ma��geblich verst��rkt werden. Als Modellsysteme wurden NSG-M��use, die mit humanen AML-Blasten oder einem soliden Ovarialkarzinom engraftet wurden, verwendet. Dabei wurden sowohl antigenspezifische als auch unspezifische Effekte beobachtet. Die unspezifischen Effekte wurden wahrscheinlich durch eine ILR13+-Fc-vermittelte ��berexpression von NKG2D, einem Rezeptor der angeborenen Immunantwort, auf den adoptiv transferierten T Zellen vermittelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IL-15 und die IL-15-Superagonisten die Proliferation und Reaktivit��t von CD8+ T-Zellen im Rahmen der Immuntherapie f��rdern k��nnen. Aufgrund der hohen Bioaktivit��t und potenzierten Wirksamkeit, k��nnten vor allem die IL 15-Superagonisten in Zukunft bei der Entwicklung effizienter Therapiemethoden eingesetzt werden und dadurch einen wichtigen Beitrag zu Behandlung von Krebs leisten. rnrn

Analyse und Modulation kontaktallergischer Reaktionen

Analyse und Modulation kontaktallergischer Reaktionen In der vorliegenden Arbeit wurde in einem ersten Teil die Bedeutung des Tumor-Necrosis-Faktors auf eine Kontaktallergie anhand von TNFR1- und TNFR2-defizienten M��usen untersucht. Mit Hilfe des Ohrschwellungsverlaufs einer von DNFB ausgel��sten kontaktallergischen Reaktion konnte bei TNFR1-defizienten M��usen eine leichte ��berreaktivit��t und bei TNFR2-defizienten M��usen eine statistisch abgesicherte ��berreaktivit��t festgestellt werden. Eine ebenfalls ��berreaktive Schwellungsreaktion konnte bei TNFR2-defizienten M��usen, die vorher mit Oxazolon behandelt worden waren, beobachtet werden. In den anschlie��end durchgef��hrten histologischen Untersuchungen der Langerhans-Zellen aus den TNFR-defizienten M��usen zeigten sich keine sichtbaren Differenzen in bezug auf MHC II-Expression und Verteilung der Zellen. Eine unterschiedliche Stimulationskapazit��t konnte bei Langerhans-Zellen, die aus TNFR1- bzw. TNFR2-defizienten M��usen isoliert worden waren, nicht beobachtet werden.In Migrationsstudien, bei denen FITC als Kontaktallergen von Langerhans-Zellen aufgenommen, prozessiert und nach der Wanderung in die Lymphknoten pr��sentiert wurde, konnte keine verringerte Anzahl der migrierenden Zellen bei TNFR1-defizienten M��usen festgestellt werden. Jedoch wurde eine reduzierte Anzahl FITC- und MHC II-doppelt-positiver Zellen aus TNFR2-defizienten M��usen beobachtet.Um Aufschl��sse ��ber die Expression von TNF-Rezeptoren auf murinen Langerhans-Zellen gewinnen zu k��nnen, wurde mit Hilfe von Epidermal Sheets, zytofluorometrischen Analysen und RT-PCR-Analysen von Langerhans-Zellen die Expression der TNF-Rezeptoren untersucht. In Vorversuchen konnte die Expression von TNF-Rezeptoren auf Fibroblasten und T-Zellen gefunden werden. Weiterhin konnten beide TNF-Rezeptoren auf der Keratinozyten-Zellinie PAM 212 nachgewiesen werden. Auf frisch isolierten Langerhans-Zellen, die mittels MicroBeads aus epidermalen Zellsuspensionen gewonnen wurden, konnten keine TNF-Rezeptoren beobachtet werden. Bei kultivierten Langerhans-Zellen konnte dagegen die Expression des TNFR2 festgestellt werden. Mit Hilfe von RT-PCR-Analysen konnte die mRNA des TNFR1 sowohl bei frisch isolierten als auch bei kultivierten Langerhans-Zellen nachgewiesen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Wirkung des Immunmodulators Leflunomid (LF) auf eine Kontaktallergie untersucht. Es konnte eine signifikant geringere Schwellungsreaktion im Zuge einer DNFB-induzierten Kontaktallergie bei LF-behandelten M��usen festgestellt werden. Bei Experimenten zur Untersuchung des Wirkungszeitraums der inhibitorischen Wirkung von LF bei einer kontaktallergischen Reaktion konnte ein langanhaltender Effekt beobachtet werden. Weiterhin konnte die inhibitorische Wirkung von LF auf eine von Oxazolon induzierte kontaktallergische Schwellungsreaktion und auf eine irritative Schwellungsreaktion beobachtet werden. Wie in einem weiteren Experiment festgestellt werden konnte, wirkte LF gr����enteils antigenspezifisch.Der Wirkungszeitpunkt von LF konnte in verschiedenen Experimenten, bei dem LF vor, w��hrend oder nach der Sensibilisierungsreaktion verabreicht worden war, festgestellt werden. Eine suppressive Wirkung von LF war nur dann zu beobachten, wenn LF w��hrend der Sensibilisierungsphase gegeben worden war. Weiterhin konnte in Transfer-Experimenten festgestellt werden, da�� die Inhibition der kontaktallergischen Schwellungsreaktion auf naive Tiere ��bertragbar ist. Au��erdem wurden Hinweise gefunden, da�� CD8+-T-Zellen als Effektorzellen bei der Suppression eine Rolle spielen. Desweiteren konnten anhand von Untersuchungen von Epidermal Sheets von LF-behandelten M��usen, die mit DNFB konfrontiert worden waren, keine morphologischen Unterschiede gefunden werden. Nach Erstellung von Migrationsanalysen f��r die zum Einsatz gekommenen Versuchsgruppen, d.h. sowohl f��r die LF-behandelten als auch f��r die Kontroll-M��use, konnte kein Einflu�� von LF auf die Wanderungsf��higkeit von LC konstatiert werden. Anhand von FACS-Analysen konnte bei einer mit LF kultivierten T-Zellinie eine reduzierte Expression des IL-2-, und Transferrin-Rezeptors, sowie von CD44 beobachtet werden. Schlie��lich wurde bei Untersuchungen einer topischen Applikationsform von LF festgestellt, da�� LF nur oral appliziert wirksam war.

Generierung und Charakterisierung von rekombinanten Cytomegaloviren mit Punktmutationen in antigenen Peptiden

Die Kontrolle der produktiven Cytomegalovirus- (CMV) Infektion ist von der effizienten Rekonstitution antiviraler CD8 T-Zellen abh��ngig. Dies f��hrt jedoch nicht zur vollst��ndigen Eliminierung des viralen Genoms aus den Zielorganen, sondern das Virus verbleibt in einem nicht-replikativen Zustand: der Latenz. Es ist bekannt, dass w��hrend der Latenz nur ein geringer Anteil latenter mCMV-Genome in der Lunge die Major Immediate Early (MIE) Gene ie1 und ie2 exprimiert, die Latenz aber dennoch bestehen bleibt, weil das differentielle Splicing des prim��ren IE1/3-Transkripts zum Transaktivator-Transkript IE3 nicht erfolgt. Damit war neben der Initiation der IE-Genexpression am MIE-Promotor-Enhancer das IE1/3-Splicing als zweiter molekularer Latenz-Kontrollpunkt identifiziert. Parallel zur Latenz-assoziierten IE1-Genexpression sind in der Lunge aktivierte CD62L-low CD8 T-Zellen mit Spezifit��t f��r das immundominante IE1-Peptid 168-YPHFMPTNL-176 angereichert. Dies legte die Hypothese nahe, dass neben der molekularen Kontrolle der Latenz auch eine immunologische Kontrolle, beispielsweise durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen besteht. Zur Evaluierung dieser Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit mittels BAC-Mutagenese erstmals ein rekombinantes mCMV generiert, in dem das IE1-Peptid durch Punktmutation der C-terminalen MHC-Ankeraminos��ure L176A zerst��rt ist. Dazu musste zun��chst die Technik der BAC-Mutagenese herpesviraler Genome (in Anlehnung an die publizierten Arbeiten von Messerle et al., 1997; Borst et al., 1999, 2004; Wagner et al., 1999) in der Arbeitsgruppe etabliert werden. Neben der Funktionsverlust-Mutante (mCMV-IE1-L176A) wurden zur Kontrolle zwei Revertanten (mCMV-IE1-A176L und mCMV-IE1-A176L*) generiert. In letzterer, als Wobble-Revertante bezeichnet, wird wieder die authentische MHC-Ankeraminos��ure L eingesetzt, es verbleibt aber ein singul��rer Nukleotidaustausch A->T in der Wobble-Position des Codons als Marker zur Unterscheidung zum WT-mCMV zur��ck. Der immunologische Ph��notyp der Funktionsverlust-Mutante, also die funktionelle Ausl��schung des antigenen IE1-Peptids im Priming einer CD8 T-Zell-Antwort, entsprach der Erwartung. Entsprechend konnte nach Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante keine Reaktivit��t gegen das IE1-Peptid nachgewiesen werden. In den Revertanten hingegen war die Erkennung des IE1-Peptids wieder hergestellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen weiter, dass die Funktionsverlust-Mutante sowie die Revertanten ohne signifikante Beeinflussung in vitro in permissiven Fibroblasten und in vivo in verschiedenen Geweben replizieren. Wie aktuelle Daten nach Knochenmarktransplantation und Infektion mit der Funktionsverlust-Mutante im Vergleich zu den Revertanten zeigen, ist die Frequenz Latenz-assoziierter IE1-Transkriptionsereignisse bei der Funktionsverlust-Mutante signifikant erh��ht. Damit konnte erstmalig der Beweis f��r eine Kontrolle der Latenz-assoziierten IE1-Genexpression durch IE1-Epitop-spezifische CD8 T-Zellen und damit f��r eine Pr��sentation des IE1-Peptids w��hrend der Latenz erbracht werden.

RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endg��ltige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abh��ngig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter f��r die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schl��sselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilit��t und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabh��ngigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem k��rzeren, ein freies 3�� poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte ��-globin 3�� UTR, unabh��ngig voneinander zu einer Erh��hung der IVT-RNA Stabilit��t und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erh��hten Proteinexpression f��hrten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination f��hrte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erh��hten Dichte und Stabilit��t von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfl��che transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform f��r die Induktion einer verst��rkten Antik��rperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verst��rkung der Antik��rperantwort f��hren, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell best��tigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verst��rkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verst��rkung der Antik��rperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA f��hrte zu einer signifikant st��rkeren Antik��rperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. F��r die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen f��hrt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe f��r eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.