Marcação da Anexina V para imagem funcional da apoptose celular

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Contribuição para o estudo da anexina V na apoptose celular em concentrados de eritrócitos

A hemoterapia moderna baseia-se na utilização correcta dos diversos componentes sanguíneos, associados a um maior controle de qualidade do sangue, o que a torna mais segura e, actualmente, muitos doentes sao beneficiados pois, a transfusão de componentes sanguineos, em situaçoes várias, está na linha da frente na manutenção da vida e em casos extremos, o último recurso que salva vidas. A qualidade e a segurança nas transfusões de sangue são grandes preocupações da área médica, autoridades de saúde e doente1. O sangue obtido pelos Centros de Sangue provem de dadores voluntários, dotados de uma enorme sensibilidade social, que periodicamente assumem uma postura benevola e altruista e consequentemente mantêm os bancos de sangue providos de um produto imprescindivel no tratamento de diversas patologias. O produto final disponível – concentrado de eritrócitos (CE´s), plasma e concentrado plaquetário – tem de assumir um carácter seguro e viável de modo a que os riscos para o doente sejam diminutos2. O controlo de qualidade aplicado a todo o sangue doado realiza provas de conformidade nas unidades com especificações previamente definidas, sendo a hémolise um dos parâmetros importantes na avaliação da qualidade dos concentrados de eritrócitos, pois, pode ocasionar implicações clinicas para o receptor. Para além disso a avaliação da concentração de hemoglobina (Hg) no sangue doado mostra-se um controlo imprescindivel que salvaguarda a qualidade e segurança do componente a transfundir3;4.Até se obter um CE há todo um processo moroso e de responsabilidade vital. Todo o sangue obtido passa por várias etapas fundamentais até à obtenção do componente pretendido (analise, produção e armazenamento). Os CE’s obtidos quando armazenados, num ambiente de refrigeração, têm uma vida útil de 42 dias. Após este período, o sangue deve ser inutilizado por se verificar alterações bioquímicas, biomecânicas, e imunológicas nos CE’s e por consequência a sua instabilidade vital no que ao tratamento de patologias, para as quais este componente está indicado, diz respeito5. Foi realizado um estudo experimental com o objetivo de avaliar a contribuição da Anexina V na apoptose celular nos concentrados de eritrócitos, constatando a degradação dos mesmos ao longo de todo o período de armazenamento e validar o paradigma que a ciência preconiza: “Os CE’s após os 42 dias armazenados, em condições específicas (2 a 6º centígrados), são inviaveis para transfundir”6;7. A avaliação dos níveis de apoptose por citometria de fluxo é geralmente realizada por métodos que utilizam Anexina V como marcador vital, que se associa aos resíduos de fosfatidilserina, externalizados no início do processo apoptótico. A Anexina V é uma proteína humana endógena dependente do ião Ca+2, amplamente distribuída intracelularmente em altas concentrações na placenta e em concentrações mais baixas nos eritrócitos, plaquetas e monócitos. Apresenta como principal característica a capacidade de se ligar à fosfatidilserina, um fosfolipído presente na camada interna da bicamada lipídica, que durante a apoptose celular é translocada para a camada externa da membrana celular. A determinação da Anexina V é normalmente utilizada para verificar se as células são viáveis, apoptóticas ou necróticas por meio de diferenças na integridade da membrana plasmática. Assim, ao conjugar a Anexina V ao FITC (Isotiocianato de fluoresceína) é possível identificar e quantificar as células apoptóticas por citometria de fluxo7. Numa amostra de 15 CE’s, a qual foi induzida a hemólise, verificou-se, por citometria de fluxo, que a viabilidade deste componente se desvanesce ao longo do tempo, confirmando assim que o tratamento, manuseamento e armazenamento do sangue compromete a vitalidade terapeutica deste insubstituivel produto vital.

Associação do índice de proliferação e de apoptose celular com características clínicas, epidemiológicas e histopatológicas do câncer mamário de cadelas sem raça definida

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Modelo experimental de perfusão pulmonar ex vivo em ratos: avaliação histopatológica e de apoptose celular em pulmões preservados com solução de baixo potássio dextrana vs. solução histidina-triptofano-cetoglutarato

OBJETIVO: Comparar os achados histopatológicos e de apoptose em pulmões de ratos preservados em soluções low-potassium dextran (LPD, baixo potássio dextrana), histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK, histidina-triptofano-cetoglutarato) ou salina normal (SN) em 6 h e 12 h de isquemia pela utilização de um modelo experimental de perfusão pulmonar ex vivo. MÉTODOS: Sessenta ratos Wistar foram anestesiados, randomizados e submetidos à perfusão anterógrada pela artéria pulmonar com uma das soluções preservadoras. Após a extração, os blocos cardiopulmonares foram preservados por 6 ou 12 h a 4ºC, sendo então reperfundidos com sangue homólogo em um sistema de perfusão ex vivo durante 60 min. Ao final da reperfusão, fragmentos do lobo médio foram extraídos e processados para histopatologia, sendo avaliados os seguintes parâmetros: congestão, edema alveolar, hemorragia alveolar, hemorragia, infiltrado inflamatório e infiltrado intersticial. O grau de apoptose foi avaliado pelo método TdT-mediated dUTP nick end labeling. RESULTADOS: A histopatologia demonstrou que todos os pulmões preservados com SN apresentaram edema alveolar após 12 h de isquemia. Não houve diferenças em relação ao grau de apoptose nos grupos estudados. CONCLUSÕES: No presente estudo, os achados histopatológicos e de apoptose foram semelhantes com o uso das soluções LPD e HTK, enquanto a presença de edema foi significativamente maior com o uso de SN.

Apoptose na infecção experimental de cães domésticos com Ehrlichia canis

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Efeito do soro fetal bovino e do etossulfato de fenazina sobre o acúmulo lipídico, apoptose e resposta à vitrificação em embriões bovinos produzidos in vitro

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Avaliação da indução de apoptose pela desintegrina recombinante DisBa-01 em macrófagos e células tumorais

O câncer é causado pela proliferação descontrolada de células, demonstrando uma capacidade coletiva de invasão e metástase. Durante a metástase, as células malignas precisam resistir a anoikis, uma apoptose celular gerada por falta de adesão. No câncer, as integrinas influenciam as células do hospedeiro associadas ao tumor bem como as próprias células tumorais, tendo o potencial de modular a progressão tumoral, a sobrevivência celular, a invasão e a metástase. A integrina αvβ3 é expressa em diversos tumores humanos, mas está em níveis muito reduzidos ou mesmo ausente nos tecidos normais, sendo considerada um alvo privilegiado na terapia anti-tumoral. Células derivadas da medula óssea, como o monócito/macrófago, também expressam esta integrina, ainda que em níveis reduzidos. A desintegrina recombinante DisBa-01 atua principalmente sobre as integrinas αvβ3 e αIIbβ3, e parece possuir a capacidade de inibir a adesão celular de linhagens possuindo a integrina αvβ3 à vitronectina. Sendo assim, observou-se a apoptose que pode ser gerada pela inibição da adesão celular ou pela própria presença da desintegrina, um antagonista de integrina que afeta a adesão celular, em linhagem neoplásica e em linhagem imortalizada de macrófagos, utilizando os métodos de marcação com anexina V e técnica de TUNEL, bem como a presença de células viáveis através da técnica de MTT. As linhagens celulares utilizadas nesse experimento foram expostas a desintegrina DisBa-01 por 24 horas para realização dos testes e as populações celulares aderentes e não aderentes foram analisadas separadamente. Verificou-se uma diminuição na viabilidade celular quando ocorre perda de adesão e na presença da proteína, mas foi observado um resultado não significativo para a ocorrência de apoptose. A desintegrina DisBa-01 ocasiona uma diminuição na viabilidade celular, entretanto parece não ser por apoptose gerando anoikis

Expressão gênica de bcl2, receptor de estradiol e receptores de progesterona A e B em endométrio eutópico e ectópico de pacientes inférteis sem e com endometriose

A endometriose caracteriza-se pela presença de tecido endometriótico – glândulas e estroma – fora da cavidade uterina. A doença acomete superfícies peritoniais da pélvis, ovários e septo rectovaginal, sendo mais comum a endometriose pélvica. Embora os dados sobre a prevalência exata de endometriose sejam incertos, as evidências indicam uma prevalência em torno de 5 a 10% das mulheres em idade reprodutiva. Dor, dismenorréia, dispareunia e infertilidade são sintomas freqüentes da doença. Além de apresentar dependência aos hormônios sexuais, a endometriose está associada a um conjunto de desordens de diferentes etiologias, sendo considerada uma doença multifatorial de caráter genético e imune. Neste sentido, a carência de respostas imunológicas adequadas, aliada a um provável desequilíbrio entre os processos de proliferação e apoptose celular, pode ter um papel importante na instalação e manutenção das lesões endometrióticas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a expressão de genes relacionados aos processos de proliferação e diferenciação celular em implantes endometrióticos e endométrio eutópico de mulheres inférteis sem e com endometriose, através da análise semiquantitativa por RT-PCR. Foram estudadas 34 pacientes consultando por infertilidade e submetidas à laparoscopia diagnóstica. Quinze pacientes (31,7 ± 1,5 anos) apresentavam endometriose e 19 (32,9 ± 0,9 anos) foram consideradas controles inférteis sem endometriose. Os dois grupos apresentaram IMC e SHBG similares. As biópsias de endométrio foram realizadas, em fase folicular, nas pacientes do grupo controle (C) e nas pacientes com endometriose (endométrio eutópico (EUT) e ectópico (ECT)). A presença do mRNA para os receptores de estrogênio e progesterona detectada nos 3 grupos estudados, sustenta a existência de sensibilidade tecidual local aos hormônios sexuais. Nas condições experimentais do presente estudo não foi observada diferença estatística na expressão gênica de bcl2 entre os grupos. A expressão do gene do ER endometrial também foi similar entre os grupos controle, eutópico e ectópico. Contudo, o endométrio ectópico apresentou níveis de mRNA mais elevados para PR-A (0,84  0,02 UA) em relação aos grupos controle e eutópico (0,60  0,04 UA e 0,63  0,04 UA; p < 0,05). A expressão gênica do PR-B não foi estatisticamente diferente entre os grupos do presente trabalho. Porém, houve forte correlação negativa entre a expressão dos genes bcl2 e PR-B nas amostras de endométrio sem e com endometriose (r = - 0,795 e p = 0,018), sugerindo que um papel anti-proliferativo do PR-B possa ser operativo neste modelo de estudo.

Aspectos da patogenia e análise da variabilidade da glicoproteína S do Coronavirus dos Perus isolado no Brasil

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efeitos da toxina botulínica do tipo A isolada ou em associação com a finasterida sobre a próstata do cão e rato Sprague-Dawley

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Influência dos níveis de ferritina sérica, das mutações no gene da beta globina e dos valores das enzimas de detoxificação Catalase e Glutationa S -Transferase na expressão fenotípica de Beta Talassemia Heterozigota

Pós-graduação em Genética - IBILCE

Iogurte de soja como coadjuvante no tratamento de câncer de mama

Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAR

Ação do forskolin em diferentes fases da produção in vitro: implicação na meiose oocitária e na vitrificação de embriões bovinos

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

Dopplervelocimetria da artéria umbilical e controle glicêmico materno como marcadores de alterações vasculares e apoptóticas placentárias

Pós-graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia - FMB

O efeito da carga oclusal no processo de reparo do ligamento periodontal após reimplante imediato em molar de ratos: avaliação histológica e imunoistoquímica

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)