Comparison of splice sites in mammals and chicken

We have carried out an initial analysis of the dynamics of the recent evolution of the splice-sites sequences on a large collection of human, rodent (mouse and rat), and chicken introns. Our results indicate that the sequences of splice sites are largely homogeneous within tetrapoda. We have also found that orthologous splice signals between human and rodents and within rodents are more conserved than unrelated splice sites, but the additional conservation can be explained mostly by background intron conservation. In contrast, additional conservation over background is detectable in orthologous mammalian and chicken splice sites. Our results also indicate that the U2 and U12 intron classes seem to have evolved independently since the split of mammals and birds; we have not been able to find a convincing case of interconversion between these two classes in our collections of orthologous introns. Similarly, we have not found a single case of switching between AT-AC and GT-AG subtypes within U12 introns, suggesting that this event has been a rare occurrence in recent evolutionary times. Switching between GT-AG and the noncanonical GC-AG U2 subtypes, on the contrary, does not appear to be unusual; in particular, T to C mutations appear to be relatively well tolerated in GT-AG introns with very strong donor sites.

The quest for a message: budding yeast, a model organism to study the control of pre-mRNA splicing

Removal of introns during pre-mRNA splicing is a critical process in gene expression, and understanding its control at both single-gene and genomic levels is one of the great challenges in Biology. Splicing takes place in a dynamic, large ribonucleoprotein complex known as the spliceosome. Combining Genetics and Biochemistry, Saccharomyces cerevisiae provides insights into its mechanisms, including its regulation by RNA-protein interactions. Recent genome-wide analyses indicate that regulated splicing is broad and biologically relevant even in organisms with a relatively simple intronic structure, such as yeast. Furthermore, the possibility of coordination in splicing regulation at genomic level is becoming clear in this model organism. This should provide a valuable system to approach the complex problem of the role of regulated splicing in genomic expression.

Deciphering 3'ss selection in the yeast genome reveals an RNA thermosensor that mediates alternative splicing

Poor understanding of the spliceosomal mechanisms to select intronic 3' ends (3'ss) is a major obstacle to deciphering eukaryotic genomes. Here, we discern the rules for global 3'ss selection in yeast. We show that, in contrast to the uniformity of yeast splicing, the spliceosome uses all available 3'ss within a distance window from the intronic branch site (BS), and that in 70% of all possible 3'ss this is likely to be mediated by pre-mRNA structures. Our results reveal that one of these RNA folds acts as an RNA thermosensor, modulating alternative splicing in response to heat shock by controlling alternate 3'ss availability. Thus, our data point to a deeper role for the pre-mRNA in the control of its own fate, and to a simple mechanism for some alternative splicing.

Differentiated evolutionary rates in alternative exons and the implications for splicing regulation

Background: Alternatively spliced exons play an important role in the diversification of gene function in most metazoans and are highly regulated by conserved motifs in exons and introns. Two contradicting properties have been associated to evolutionary conserved alternative exons: higher sequence conservation and higher rate of non-synonymous substitutions, relative to constitutive exons. In order to clarify this issue, we have performed an analysis of the evolution of alternative and constitutive exons, using a large set of protein coding exons conserved between human and mouse and taking into account the conservation of the transcript exonic structure. Further, we have also defined a measure of the variation of the arrangement of exonic splicing enhancers (ESE-conservation score) to study the evolution of splicing regulatory sequences. We have used this measure to correlate the changes in the arrangement of ESEs with the divergence of exon and intron sequences. Results: We find evidence for a relation between the lack of conservation of the exonic structure and the weakening of the sequence evolutionary constraints in alternative and constitutive exons. Exons in transcripts with non-conserved exonic structures have higher synonymous (dS) and non-synonymous (dN) substitution rates than exons in conserved structures. Moreover, alternative exons in transcripts with non-conserved exonic structure are the least constrained in sequence evolution, and at high EST-inclusion levels they are found to be very similar to constitutive exons, whereas alternative exons in transcripts with conserved exonic structure have a dS significantly lower than average at all EST-inclusion levels. We also find higher conservation in the arrangement of ESEs in constitutive exons compared to alternative ones. Additionally, the sequence conservation at flanking introns remains constant for constitutive exons at all ESE-conservation values, but increases for alternative exons at high ESE-conservation values. Conclusion: We conclude that most of the differences in dN observed between alternative and constitutive exons can be explained by the conservation of the transcript exonic structure. Low dS values are more characteristic of alternative exons with conserved exonic structure, but not of those with non-conserved exonic structure. Additionally, constitutive exons are characterized by a higher conservation in the arrangement of ESEs, and alternative exons with an ESE-conservation similar to that of constitutive exons are characterized by a conservation of the flanking intron sequences higher than average, indicating the presence of more intronic regulatory signals.

Desenvolvimento de um novo sistema portátil de detecção de sequências específicas de ADN/ARN a partir de nanossondas de ouro com integração de sensores ópticos baseados na tecnologia do silício nanocristalino

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Nanotecnologias e Nanociências pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia.

ARN helicasas en dos procesos de desarrollo: variación antigénica y enquistamiento de giardia lamblia.

Además de su importancia médica y veterinaria al ser una de las mayores causas de enfermedad intestinal con origen en el consumo de agua, Giardia es un excelente modelo para estudiar la evolución de importantes procesos celulares, ya que es una de las células eucariotas más primitivas que se conocen. Giardia utiliza dos mecanismos de adaptación a los cambios ambientales que confronta durante su ciclo de vida, ya sea para sobrevivir dentro del intestino del huésped como es la variación de sus antígenos de superficie, o fuera del mismo como es la diferenciación a quiste o enquistamiento. El Objetivo General de nuestro proyecto de investigación es el de comprender los mecanismos de adaptación y diferenciación celular en Giardia lamblia y utilizar esos conocimientos para el desarrollo de metodologías que permitan evitar la enfermedad y/o la transmisión del parásito así como también para definir nuevas técnicas diagnósticas. Las ARN Helicasas están presentes en muchas Archaea, casi todas las Eubacterias y todos los organismos eucariotas, y son necesarias o están involucradas en muchos procesos diferentes del metabolismo del ARN. En células eucariotas se las ha asociado desde la transcripción hasta la degradación del ARN, incluyendo pre-ARNm splicing, exportación del ARNm, biogénesis del ribosoma, iniciación de la traducción y expresión génica en organelas. Resultados previos indican que el mecanismo por el cual Giardia regula la expresión de sus proteínas variables de superficie es a nivel post-transcripcional, utilizando un mecanismo similar a ARN de interferencia. La presencia de los complejos de doble hebra de ARN promueve la acción de ARN Helicasas y ARNasas III que cortan el dsRNA en fragmentos cortos de 21-23 nt. Sin dudas ésta es la primera evidencia de un mecanismo de este tipo que participa fisiológicamente en la regulación génica diferencial. Por otro lado, se ha descripto la interacción de helicasas con deacetilasas de histonas (HDAC), las cuales según estudios realizados en nuestro laboratorio estarían involucradas en la regulación epigenética de la variación antigénica y el enquistamiento. Se busca por lo tanto comprender la participación de ARN Helicasas en ambos procesos de adaptación del parásito, evaluando el grado e importancia de las mismas. En particular se focalizará en la localización subcelular, la interacción con otros componentes de la maquinaria regulatoria y determinación de los dominios involucrados, como también la relación entre sus niveles de expresión y los diferentes fenotipos asociados a estos procesos de adaptación del parásito.

Bioinformàtica de ARNs: simulacions d'evolució de viroids i xarxes de molècules de ARN

L'objectiu pràctic principal d'aquest projecte va consistir en la construcció d'un codi informàtic destinat a efectuar simulacions de poblacions de molècules de ARN que es repliquen i evolucionen en el temps. Encara que el projecte es va dirigir cap a la investigació de la interacció entre els viroids i els mecanismes de defensa de la planta, els resultats finals del treball efectuat ens van conduir a conclusions aplicables a l'escala del genoma sencer i no només als viroids o ARNs. En aquest estudi es van analitzar, en l’àmbit de la genètica de poblacions, les conseqüències de la selecció natural endarrerida. Estudis clàssics de la evolució en aquest àmbit han considerat que un individu genera fills en proporció amb la seva superioritat reproductiva (o fitness), un procés en que es poden produir mutacions. L'adquisició de mutacions que produeixen en el individu una fitness molt baixa (mutacions deletèries) impliquen l'impossibilitat de reproducció. En la hipòtesi de selecció endarrerida, els individus que adquireixen mutacions deletèries encara es poden reproduir amb normalitat unes quantes generacions. Durant aquest retard o "compte enrere", els danys transmesos als fills podrien ser reparats mitjançant ulteriors mutacions compensatòries. En l'absència d'aquest tipus de mutacions compensatòries, el fill esdevé estèril i per tant no es podrà reproduir. En aquest treball s’ha estudiat les conseqüències genètiques al nivell poblacional d'aquest retard mitjançant simulacions numèriques i modelitzacions teòriques. Els resultats mostren que la selecció amb retard abaixa el llindar d'error (error threshold), posant en perill la supervivència de la població. De l'altra banda, sorprenentment, aquest retard no deixa cap traça al nivell de la diversitat de les seqüències genòmiques en la població. Aquestes conclusions suggereixen que la selecció endarrerida és difícilment detectada en les dades genètiques i per tant, podria ser un fenomen comú però rarament detectat.

Descripción del ARN de transferencia mitocondrial para Serina (UCN) de Lutzomyia columbiana (Diptera, Psychodidae)

Lutzomyia columbiana es un flebotomíneo considerado como vector sospechoso de Leishmania mexicana y Leishmania braziliensis en Colombia. Este insecto pertenece al grupo verrucarum, que incluye algunos taxones isomórficos, lo que ha estimulado la búsqueda de marcadores moleculares que permitan, además de diferenciar las especies, estudiar sus relaciones de parentesco. En este artículo se describe por primera vez la estructura putativa del ARN de transferencia mitocondrial para serina que reconoce el codón UCN (ARNtSer) de Lu. columbiana. El ADN genómico fue extraído, amplificado y secuenciado a partir de seis especímenes colectados con cebo humano. La estructura secundaria del ARNtSer fue inferida con el programa tRNAscan-SE 1.21. El gen ARNts consistió de 67 pares de bases (pb), encontrándose un solo haplotipo en los seis individuos secuenciados. El ARNtSer de Lu. columbiana mostró 7 apareamientos intracatenarios en el brazo aceptor del aminoácido, 3 en el brazo dihidrouridina (DHU), 5 en el brazo del anticodón y 5 en el brazo ribotimidina-pseudouridina-citosina (TøC). El tamaño de las lupas correspondió a 5 nucleótidos en la DHU, 7 en la anticodón, 4 en la variable y 7 en la TøC. Lu. columbiana se distingue del resto de especies de Lutzomyia y Phlebotomus secuenciadas a la fecha por la presencia de una guanina en la posición nucleotídica 64, que produce un apareamiento no canónico tipo uracilo-guanina en el brazo aceptor. Se necesitan más estudios para confirmar la utilidad del ARNtSer como marcador molecular para la discriminación de especies de flebotomíneos.

Identidad colectiva y lengua en contextos pluriculturales y plurilingües: el caso del Valle de Arán (Lleida, España)

La comarca del Valle de Arán (Cataluña) presenta unas peculiaridades lingüísticas y sociodemográficas que la convierten en un escenario ideal para el estudio del proceso de construcción de la identidad colectiva y su relación con la lengua. En este artículo presentamos un análisis de la construcción de la identidad colectiva en este territorio y el papel de la lengua en este proceso. Partiendo de una concepción basada en que la importancia de la lengua propia en el proceso de construcción de la identidad colectiva no es un fenómeno categórico y universal, más bien obedece a una construcción social que convierte la lengua en expresión y vehículo de la pertenencia al colectivo, se demuestra que efectivamente la lengua aranesa desempeña un importante papel tanto en la formación como en la configuración de la identidad, pero el significado que se le otorga entre los residentes en la comarca difiere en gran medida, en función principalmente de que los sujetos se identifiquen o no con el universo aranés.

Uso de imágenes satélite Landsat para la detección de rodales de Pinus nigra Arn. y Pinus sylvestris L. afectados por escolítidos

El uso de imágenes procedentes de sensores multiespectrales de resolución media como es el caso de Landsat TM ha sido ampliamente utilizado desde décadas para detectar, entre otras variables, el decaimiento y la defoliación provocada por plagas y enfermedades forestales. El presente trabajo evalúa la utilidad del uso de estas imágenes en la detección de rodales de pino laricio (Pinus nigra Arn.) y pino silvestre (Pinus sylvestris L.) afectados por escolítidos. El área de estudio se localizó en el Solsonés (prepirineo de Lleida) seleccionando 34 áreas de entrenamiento (17 rodales afectados por la plaga y 17 rodales sanos). El análisis exploratorio de las imágenes se realizó mediante el programa ERDAS® IMAGINE 8.x. Los resultados del estudio mostraron una significación espectral en 5 de las 7 bandas analizadas, siendo TM5 y TM7 las que mejor comportamiento presentaron. Los niveles digitales obtenidos y los espacios de características creados señalaron sendas tendencias al agrupamiento de rodales afectados versus sanos, consiguiéndose plantear mejoras en el procedimiento metodológico.

Caracterización de rodales irregulares de Abies alba Mill. capitalizados en existencias del Valle de Arán (Pirineos, España) y de las cortas de entresaca practicadas

Se describe, en una zona de la vertiente norte de los Pirineos españoles, la estructura dasocrática de rodales irregulares de abeto excesivamente capitalizados en existencias volumétricas, así como la naturaleza de las intervenciones de entresaca que se les aplican al objeto de contrarrestar la tendencia hacia una indeseable uniformidad de la masa. La situación inicial revela una elevada espesura, con importantes excedentes de individuos pertenecientes a las clases diamétricas de madera gruesa, y que conduce a formas selvícolas tipológicas en avanzado proceso de regularización. Empero, la estabilidad mecánica de los pies se manifiesta alejada de sus umbrales críticos en todos los estratos, y la capacidad de regeneración del sistema resulta aceptable. El tratamiento de entresaca realizado, cuya severidad se centró fundamentalmente sobre los pies de diámetro superior a 30 cm, mantiene todavía una situación de espesura excesiva que impide la adscripción de los rodales a estructuras equilibradas, pero ha permitido la liberación de la competencia vertical de los pies en edad de latizal.

Evolución del crecimiento radial en un rodal adulto de Pinus nigra Arn. de la provincia de Lleida

Se ha estudiado un rodal adulto (edad media = 139 años) de Pinus nigra ssp. salzmannii var. pyrenaica en el W de la comarca del Solsonès (Lérida). Se han medido y extraído testigos de madera de 97 árboles adultos, a partir de los cuales se han medido e interdatado 13.340 anillos anuales, construyendo una cronología de crecimientos que abarca desde 1818 a 1996. Se han analizado las relaciones entre diversos parámetros dendrométricos medidos y los crecimientos observados, encontrándose en general muy bajas correlaciones. Se han construido tres series medias de crecimiento (cronología media, estandarizada, y en función de la edad) a partir de las cuales se ha analizado la evolución del rodal. Se ha observado un prolongado período de ralentización y estancamiento del crecimiento que se mantiene cerca de ochenta años, seguido de una fuerte corta a la que la masa reacciona con un notable incremento del crecimiento radial en un momento en que la edad media era ya de 101 años.

Le coeur des ARN non codants - Un long chemin à découvrir [In the heart of noncoding RNA: a long way to go].

The identification and characterization of long noncoding RNA in a variety of tissues represent major achievements that contribute to our understanding of the molecular mechanisms controlling gene expression. In particular, long noncoding RNA play crucial roles in the epigenetic regulation of the adaptive response to environmental cues via their capacity to target chromatin modifiers to specific locus. In addition, these transcripts have been implicated in controlling splicing, translation and degradation of messenger RNA. Long noncoding RNA have also been shown to act as decoy molecules for microRNA. In the heart, a few long noncoding RNA have been demonstrated to regulate cardiac commitment and differentiation during development. Furthermore, recent findings suggest their involvement as regulators of the pathophysiological response to injury in the adult heart. Their high cellular specificity makes them attractive target molecules for innovative therapies and ideal biomarkers.