991 resultados para ADN
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Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obteno do grau de Mestre em Engenharia Biomdica
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Mestrado em Engenharia da Computao e Instrumentao Mdica
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RESUMO A Esclerose Mltipla (EM) uma doena desmielinizante crnica do Sistema Nervoso Central (SNC), provocada, em grande parte, por um ataque imuno-mediado contra diversos elementos da bainha de mielina. Dentro dos alvos antignicos desta resposta autoimune, vrios componentes proteicos e lipdicos da mielina tm vindo a ser identificados ao longo dos anos, entre os quais se destacam a protena bsica de mielina(MBP), glicoprotena ligodendrocitria da mielina (MOG), protena proteolipdica (PLP) e glicoprotena associada mielina (MAG). Com o desenvolvimento do modelo animal de Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE), diversas terapias antignio-especficas foram desenhadas, baseadas na modificao benfica da resposta autoimune contra a mielina, tais como a administrao de mielina ou seus componentes, os copolmeros teraputicos, os ligandos peptdeos alterados e, recentemente, a vacinao com cido desoxirribonucleico (ADN) codificador de protenas de mielina, integrado em plasmdeos e purificado para administrao parentrica. Neste trabalho, apresentamos os resultados de um extenso conjunto de experincias, subordinadas a dois temas fundamentais: 1) avaliao do potencial teraputico, e dos mecanismos de aco, da vacinao tolerizadora com ADN codificador de protenas de mielina (MBP, MOG, PLP, MAG) na EAE, e da associao desta vacinao com a administrao de ADN de citocinas Th2, ou de oligonucletidos imunomoduladores; 2) identificao e caracterizao da resposta imune contra um novo componente da mielina com potencial antignico, a protena inibidora do recrescimento axonal, Nogo-A. No que respeita vacinao com ADN, os nossos resultados comprovam a eficcia desta teraputica antignio-especfica na preveno e tratamento da EAE. Os seus mecanismos de aco incluem, entre outros, a supresso anrgica da proliferao antignioespecfica dos linfcitos T anti-mielina (no modo de preveno da doena), o enviesamento Th2 da resposta imune (quando co-administrada com a vacina de ADN codificadora da citocina IL-4, funcionando como terapia gnica local), e a reduo da diversificao de eptopos da resposta humoral anti-mielina, avaliada atravs de myelin spotted arrays. A associao das vacinas de ADN com oligonucletidos imunomoduladores GpG, desenvolvidos para contrariar as sequncias CpG imunoestimuladoras presentes no vector de vacinao, levou melhoria da sua eficcia teraputica, devida, provavelmente, ao efeito estimulador preferencial dos oligonucletidos GpG sobre linfcitos Th2 e sobre clulas reguladoras NK-T. Com base nestes resultados a vacinao com ADN foi desenvolvida para o tratamento da EM em humanos, com ensaios clnicos a decorrerem neste momento. Em relao protena Nogo-A, estudos de estrutura primria e de previso de antigenicidade identificaram a regio Nogo-66 como alvo antignico potencial para a EAE. Nas estirpes de ratinho SJL/J e C57BL/6, fomos capazes de induzir sinais clnicos e histolgicos de EAE aps imunizao com os eptopos encefalitognicos Nogo1-22, Nogo23- 44 e Nogo45-66, utilizando protocolos de quebra de tolerncia imune. Ao mesmo tempo, identificmos e caracterizmos uma resposta linfocitria T especfica contra os antignios contidos na regio Nogo-66, e uma resposta linfocitria B com diversificao intra e intermolecular a vrios determinantes presentes noutras protenas da mielina. A transferncia adoptiva de linhas celulares Th2 anti-Nogo45-66, levou melhoria clnica e histolgica da EAE em animais recipientes induzidos com outros antignios de mielina, aps migrao destas clulas para o SNC. Estes dados comprovam a importncia da Nogo-66 como antignio na EAE, e a eficcia de terapias antignio-especficas nela baseadas. No seu conjunto, os nossos resultados confirmam o potencial teraputico das vacinas de ADN codificadoras de protenas de mielina, bem como a importncia dos encefalitognios contidos na protena Nogo-A para a fisiopatologia da EAE e da EM, com eventual relevncia para o desenvolvimento de novas terapias antignio-especficas. O aperfeioamento futuro destas terapias poder levar, eventualmente, a uma capacidade de manipulao da resposta imune que permita o tratamento eficaz das doenas inflamatrias desmielinizantes, como a Esclerose Mltipla. ABSTRACT Multiple Sclerosis (MS) is a chronic demyelinating disease of the Central Nervous System (CNS), caused, mainly, by an immune-mediated attack against several elements of the myelin sheath. Among the antigenic targets for this autoimmune response, several proteic and lipidic myelin components have been identified throughout the years, of which myelin basic protein (MBP), myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), proteolipidic protein (PLP), and myelin associated glycoprotein (MAG) are the best characterized. With the development of the animal model for MS, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), several antigen-specific therapies have been designed, based on beneficial modifications of the autoimmune response against myelin. These have included myelin and myelin component administration, therapeutic copolymers, altered peptide ligands and, more recently, vaccination with myelin-protein encoding deoxyribonucleic acid (DNA), integrated into plasmids and purified for parenteral administration. In this work we present the results of an extensive series of experiments, subordinate to two fundamental areas: 1) evaluating the therapeutic potential, and mechanisms of action, of tolerizing myelin protein (MBP, MOG, PLP, MAG) DNA vaccination in EAE, alone and in association with Th2 cytokine DNA administration, or immunomodulatory oligonucleotides; 2) identifying and characterizing the immuneresponse against a new myelin component with antigenic potential, the axonal regrowth inhibitor Nogo-A. Regarding DNA vaccination, our results prove the efficacy of this antigen-specific therapy for the prevention and treatment of EAE. Its mechanisms of action include, among others, anergic suppression of antigen-specific T-cell proliferation against myelin (in prevention mode), Th2 biasing of the immune response (when co-administered with the IL- 4 codifying DNA vaccine, acting as local gene therapy), and reduction of epitope spreading of the anti-myelin antibody response, assessed by myelin spotted arrays. The combination of myelin DNA vaccination with the administration of GpG immunomodulatory oligonucleotides, designed to counteract immunostimulatory CpG motifs present in the vaccination vector, led to an improvement in therapeutic efficacy, probably due to the preferential stimulatory effect of GpG oligonucleotides on Th2 lymphocytes and on regulatory NK-T cells. Based on these results, tolerizing DNA vaccination is being developed for human use, with ongoing clinical trials. As concerns the Nogo-A protein, based on studies of primary structure and prediction of antigenicity, we identified the Nogo-66 region (responsible for the most of the inhibitory capacity of this protein) as a potential antigenic target for EAE. In the SJL/Jand C57BL/6 mouse strains, we were able to induce clinical and histological signs of EAE,after immunization with the encefalitogenic epitopes Nogo1-22, Nogo23-44 and Nogo45-66,using a tolerance breakdown protocol. Concomitantly, we identified and characterized a specific T cell response against these antigens, together with a B cell response which showed extensive intra and intermolecular epitope spread to several determinants present in other myelin proteins. Adoptive transfer of nti-Nogo45-66 Th2 cell lines resulted in clinical and histological improvement of EAE in recipient animals induced with other myelin antigens, after intraparenchymal CNS migration of anti-Nogo cells. These data confirm the relevance of Nogo-66 as an antigen in EAE, as well as the efficacy of antigenspecific therapies based on the response against this protein.In conclusion, our results substantiate the therapeutic potential of myelin-encoding DNA vaccination, as well as the importance of encefalitogenic epitopes present in the Nogo-A protein for the pathophysiology of EAE and MS, with potential relevance for the creation of new antigen specific-therapies. The future development of these therapies may eventually lead to a degree of manipulation of the immune response that allows the effective treatment of autoimmune, inflammatory, demyelinating diseases, such as Multiple Sclerosis.
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Dissertao apresentada para obteno do Grau de Doutor em Nanotecnologias e Nanocincias pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Cincias e Tecnologia.
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No dia-a-dia, os organismos vivos esto sujeitos a vrios tipos de agresses de origem endgena e exgena. A produo endgena exagerada de agentes oxidantes que ocorre nos processos metablicos dos seres vivos est intimamente associada ao aparecimento e desenvolvimento de vrias patologias. Por outro lado, e devido s atividades antropognicas, muitos agentes oxidantes de origem ambiental e alimentar entram por via exgena no organismo dos seres vivos provocando igualmente danos a nvel celular. De modo a protegerem-se dos efeitos pejorativos provocados por estes compostos, os organismos vivos desenvolveram mecanismos complexos de defesa antioxidante. Este trabalho consistiu no estudo eletroqumico do dano oxidativo induzido por agentes oxidantes (PAH (hidrocarbonetos aromticos policclicos), H2O2, NO e HClO) e do efeito protetor, ao dano oxidativo, promovido por antioxidantes no material baseado no ADN recorrendo utilizao de um biossensor de bases pricas, adenina-EPC (eltrodo pasta de carbono) e dA20-EPC, utilizando a voltametria de onda quadrada (VOQ) como tcnica de deteo. A aplicao da eletroqumica apresenta vrias vantagens para a quantificao da capacidade antioxidante total (CAT) pois, permite a reduo da quantidade de reagentes e amostra em anlise, elimina a etapa de remoo de cor (a cor um interferente nos mtodos ticos) e no requer equipamentos dispendiosos. Foram seguidas diferentes abordagens para a construo dos biossensores. A primeira consistiu na construo de um adenina-EPC em trs etapas: i) condicionamento do EPC, ii) eletrodeposio da adenina no EPC e iii) leitura do sinal eletroqumico. Assim, foram otimizados diversos parmetros: concentrao de adenina (150,0 mg/L), potencial de condicionamento (Ec) (+ 1,80 V), potencial de deposio (Ed) (+ 0,40 V), tempo de condicionamento (tc) (180 s) e tempo de deposio (td) (240 s). Foi aplicado o adenina-EPC no estudo do dano oxidativo provocado por PAH (benzo (g,h,i) perileno) e constatou-se que era necessrio transformar o benzo (g,h,i) perileno num radical para se possvel observar danos oxidativos induzidos no biossensor. A nova estratgia consistiu na construo de um dA20-EPC, atravs da adsoro fsica de uma gota de dA20 na superfcie do EPC, com posterior secagem e leitura do sinal eletroqumico. Neste procedimento foi otimizada a concentrao de dA20 (100,0 mg/L). O dano oxidativo provocado pelo H2O2, NO e HClO foi estudado sobre o dA20-EPC e verificou-se que os trs agentes oxidantes induziam dano oxidativo no dA20-EPC. Confirmou-se a capacidade do cido ascrbico (AA) em proteger o dA20-EPC do dano oxidativo induzido por H2O2 e NO. O biossensor desenvolvido (dA20-EPC) foi aplicado na avaliao da CAT de diferentes amostras reais (caf, sumo de laranja e gua aromatizada de laranja) usando-se como agentes oxidantes o H2O2 e NO. Todas as amostras analisadas apresentaram ter capacidade antioxidante. Quando se utilizou o dA20-EPC na presena de H2O2, verificou-se que as amostras de caf apresentam valores mais elevados de CAT (1130-1488 mg AAE/L) do que as amostras de bebidas (110 mg AAE/L em gua aromatizada e 775 mg AAE/L em sumo). Os valores de CAT obtidos para amostras de sumo e gua aromatizada na presena de NO indicam que a amostra de sumo possui maior teor de CAT (871 mg AAE/L) conforme era esperado, do que a amostra de gua aromatizada (172 mg AAE/L). Na presena de HClO, o valor de CAT mais elevado pertence a uma amostra de sumo (513 mg AAE/L) mas, o valor de CAT da amostra de sumo natural muito mais baixa do que o esperado (17 mg AAE/L). Foram estudados outros antioxidantes para alm do AA (cido cumrico, cido glico e cido cafeico), e constatou-se que cada um deles promove proteo ao dA20-EPC na presena de cada um dos diferentes contaminantes (H2O2, NO e HClO).
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No dia-a-dia, os organismos vivos esto sujeitos a vrios tipos de agresses de origem endgena e exgena. A produo endgena exagerada de contaminantes que ocorre nos processos metablicos dos seres vivos est intimamente associada ao aparecimento e desenvolvimento de vrias patologias. Por outro lado, e devido s atividades antropognicas, muitos contaminantes de origem ambiental e alimentar entram por via exgena no organismo dos seres vivos provocando igualmente danos a nvel celular. De modo a protegerem-se dos efeitos pejorativos provocados por estes compostos, os organismos vivos desenvolveram mecanismos complexos de defesa antioxidante. Este trabalho consistiu no estudo eletroqumico do dano oxidativo induzido por contaminantes (PAH (hidrocarbonetos aromticos policclicos), H2O2, NO e HClO) e do efeito protetor, ao dano oxidativo, promovido por antioxidantes no material baseado no ADN recorrendo utilizao de um biossensor de bases pricas, adenina-EPC (eltrodo pasta de carbono) e dA20-EPC, utilizando a voltametria de onda quadrada (VOQ) como tcnica de deteo. A aplicao da eletroqumica apresenta vrias vantagens para a quantificao da capacidade antioxidante total (CAT) pois, permite a reduo da quantidade de reagentes e amostra em anlise, elimina a etapa de remoo de cor (a cor um interferente nos mtodos ticos) e no requer equipamentos dispendiosos. Foram seguidas diferentes abordagens para a construo dos biossensores. A primeira consistiu na construo de um adenina-EPC em trs etapas: i) condicionamento do EPC, ii) eletrodeposio da adenina no EPC e iii) leitura do sinal eletroqumico. Assim, foram otimizados diversos parmetros: concentrao de adenina (150,0 mg/L), potencial de condicionamento (Ec) (+ 1,80 V), potencial de deposio (Ed) (+ 0,40 V), tempo de condicionamento (tc) (180 s) e tempo de deposio (td) (240 s). Foi aplicado o adenina-EPC no estudo do dano oxidativo provocado por PAH (benzo (g,h,i) perileno) e constatou-se que era necessrio transformar o benzo (g,h,i) perileno num radical para se possvel observar danos oxidativos induzidos no biossensor. A nova estratgia consistiu na construo de um dA20-EPC, atravs da adsoro fsica de uma gota de dA20 na superfcie do EPC, com posterior secagem e leitura do sinal eletroqumico. Neste procedimento foi otimizada a concentrao de dA20 (100,0 mg/L). O dano oxidativo provocado pelo H2O2, NO e HClO foi estudado sobre o dA20-EPC e verificou-se que os trs contaminantes induziam dano oxidativo no dA20-EPC. Confirmou-se a capacidade do cido ascrbico (AA) em proteger o dA20-EPC do dano oxidativo induzido por H2O2 e NO. O biossensor desenvolvido (dA20-EPC) foi aplicado na avaliao da CAT de diferentes amostras reais (caf, sumo de laranja e gua aromatizada de laranja) usando-se como contaminantes o H2O2 e NO. Todas as amostras analisadas apresentaram ter capacidade antioxidante. Quando se usou o dA20-EPC na presena de H2O2, verificou-se que as amostras de caf apresentam valores mais elevados de CAT (1130-1488 mg AAE/L) do que as amostras de bebidas (110 mg AAE/L em gua aromatizada e 775 mg AAE/L em sumo). Os valores de CAT obtidos para amostras de sumo e gua aromatizada na presena de NO indicam que a amostra de sumo possui maior teor de CAT (526 mg AAE/L) conforme era esperado, do que a amostra de gua aromatizada (172 mg AAE/L).
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Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Engenharia Biomdica
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Nas ltimas dcadas o nmero de imigrantes em Portugal aumentou consideravelmente. At ao final do ano de 2013 o nmero de imigrantes Angolanos a residir em Portugal atingiu os 20 000 indivduos, verificando-se uma predominncia territorial na regio metropolitana de Lisboa. Angola um pas situado na costa Atlntica Sul do continente Africano. A presena do povo Bantu, assim como a colonizao pelo povo Portugus durante o sculo XV, so considerados como os principais modeladores do padro gentico da populao deste pas. A transmisso exclusiva por via materna, o levado nmero de cpias, a ausncia de recombinao e a elevada taxa de mutao inerentes ao ADN mitocondrial, so caractersticas que o tornam til em estudos de origem e evoluo Humana, assim como em investigaes forenses. O principal objetivo deste estudo foi caracterizar geneticamente a populao de imigrantes Angolanos a residir em Lisboa. Para tal foi estudado um grupo de 173 indivduos, residentes em Lisboa, com ascendncia Angolana confirmada e no relacionados entre si. Sequenciou-se a regio controlo do ADN mitocondrial com recurso aos primers L15997/H016 e L16555/H639. Cerca de 85% dos hapltipos identificados so nicos. A maioria dos haplogrupos determinados pertence a linhagens de ADN mitocondrial descritas como especficas da regio subsariana de frica, com cerca de 87% dos hapltipos pertencentes ao macrohaplogrupo L. Do estudo filogentico verificou-se que as populaes geneticamente mais prximas foram a nossa populao imigrante de Angola e as populaes de indivduos Angolanos a residir em Angola e de indivduos pertencentes a diversos grupos tnico-lingusticos Bantu. Este estudo vem alertar para a grande diversidade gentica que a populao imigrante Angolana introduz em Lisboa nas geraes atuais e nas geraes futuras. Teremos num futuro muito prximo, indivduos naturais e nacionais de Lisboa com hapltipos, at ento, considerados como tipicamente Africanos. Os hapltipos da populao Angolana imigrante a residir em Lisboa foram submetidos e aceites para insero na base de dados EMPOP (EDNAP Forensic mtDNA Population Database) com o nmero de acesso EMPOP662.
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El estudio mediante zimogramas electroforticos de extractos de <i>Trypanozoma cruzi /i> aislados de humanos, animales domsticos y selvticos y de vectores procedentes de toda el rea endmica de Argentina, permiti reconocer la existencia de 12 zimodemos (z) o "cepas isoenzimticas". De los zimodemos aislados de hospederos humanos, slo dos Z1 y Z12 se encuentran con gran frecuencia y tienen amplia distribucin geogrfica. Se ha observado una correlacin significativa entre el zimodemo del parsito infectante y el cuadro clnico. El compromiso cardaco es significativamente mayor en pacientes con Z12 que en aquellos con Z1. Por esta razn, la tipificacin de la cepa infectante puede ser til con fines pronsticos. Sin embargo, la metodologa utilizada para la determinacin del zimodemo es muy laboriosa e insume mucho tiempo, lo que reduce las posibilidades de aplicacin clnica. Dada la similitud del agrupamiento obtenido por el anlisis de los zimodemos y del ADNk, los problemas de la caracterizacin isoenzimtica de aislamientos pueden ser evitados mediante estudio del ADN del parsito. (...) Objetivo general Identificacin de zimodemos de <i>Trypanosoma cruzi</i> mediante anlisis de ADN. Objetivos especficos a) Aislamientos de <i>T. cruzi</i> de pacientes chagsicos crnicos con diferentes cuadros clnicos sern caracterizados utilizando isoenzimas como marcadores genticos. b) Se establecer la relacin entre la sintomatologa observada en cada caso y el zimodemo al cual pertenecen los parsitos aislados. c) A partir del ADN aislado se proceder a: 1. Amplificacin de segmentos de ADN al azar dando lugar a fragmentos de ADN que permitan identificar los diferentes zimodemos. 2. Hibridizacin con sondas de ADN, lo que permitira identificar el zimodemo al que pertenecen los parsitos de dicho aislamiento. 3. Amplificar, mediante PCR, la regin HVRm de <i>T. cruzi</i> directamente en muestras biolgicas y proceder a su tipificacin con sondas especficas.
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En este proyecto propone aplicar tcnicas de citogentica molecular analizando principalmente patrones de distribucin de secuencias de ADN repetitivo, en especies sudamericanas de Cactaceae (Notocacteae, Trichocereeae, Hylocereae y Rhipsalideae) y Solanaceae (Cestroideae, Nicotianoideae, Petunioideae, Schizanthoideae, Schwenckioideae y Solanoideae). Las tres familias presentan importantes centros de diversificacin en Sudamrica y un enorme inters desde el punto de vista econmico, biolgico y ecolgico. Para lo cual sern utilizadas tcnicas de coloracin convencional y de hibridacin in situ fluorescente (FISH) en especies de diferentes tribus y subfamilias. Estos estudios cariotpicos, en especial la distribucin de secuencias de ADN repetitivo, permitirn explorar nuevos aspectos de la diferenciacin cromosmica, aportando marcadores cromosmicos que podran ser utilizados en estudios de evolucin cariotpica y ser importantes para robustecer la comprensin de relaciones sistemticas y filogenticas. Los estudios citogenticos en estas familias son esenciales para contribuir al conocimiento de su origen, diversificacin y evolucin, como as tambin para colaborar con el diseo de estrategias de mejoramiento gentico de especies cultivadas y conservacin de especies amenazadas.
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Treball de recerca realitzat per un alumne densenyament secundari i guardonat amb un Premi CIRIT per fomentar l'esperit cientfic del Jovent lany 2005. Estudi sobre lADN que t com a finalitat conixer introductriament lutilitzaci del clcul matemtic computacional en les investigacions sobre aquest. Els objectius de lestudi sn per una part, conixer qu s l'ADN i quins sn els seus mecanismes de duplicaci i de transmissi de la informaci gentica, aix com el paper d'altres molcules que intervenen en aquest procs ; tamb sestudia quins han estat els processos de la cllula que l'sser hum ha estat capa de copiar o imitar. A partir daquesta introducci, es vol conixer qu s'entn concretament per computaci amb ADN i alguns dels problemes matemtics que s'han resolt, aix com algunes aplicacions de l'ADN en altres camps. La recerca ha perms arribar a diverses conclusions. Primerament que l'ADN s un excellent candidat per poder fer clculs matemtics. En segon lloc, tot i que en el present treball no se solucionen problemes computacionalment difcils es mostra la capacitat de les molcules d'ADN per resoldre problemes. En tercer lloc, l'inters mostrat per importants empreses dedicades a la informtica fa ms esperanador que en un futur hi pugui haver ordinadors que funcionin amb molcules d'ADN. Finalment, es demostra que les matemtiques, la informtica i la biologia sn tres camps que estan interrelacionats. Per tal de trencar una mica amb la serietat del treball, s'acaba descrivint una manera de posar msica a les cadenes d'ADN, i es mostren alguns resultats com sn les msiques associades als 24 cromosomes humans, aix com les corresponents a 29 protenes.
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Lestudi es centra en el fenmen de les promocions dins del sector de la premsa impresa i la seva repercussi en el negoci editorial des de la doble perspectiva dun diari de pagament i un altre gratut, prenent com a model lactivitat promocional d' El Peridico de Catalunya (2003- 2008) i d' ADN (2006- 2008).
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RESUME : Bien que les proprits physiques de la structure de l'ADN aient t intensivement tudies pendant plus de 50 ans il y a encore beaucoup de questions importantes qui attendent des rponses. Par exemple, qu'arrive-t-il la structure de la double hlice d'ADN nue (sans protines lies) lorsqu'elle est fortement courbe, de la mme manire que dans les nuclosomes? Cet ADN nu est-il facilement pli (il reste dans le rgime lastique) ou rduit-il la contrainte de flexion en formant des sites hyperflexibles kinks (il sort du rgime lastique en cassant l'empilement des paires de bases certains endroits) ? La microscopie lectronique peut fournir une rponse cette question par visualisation directe des minicercles d'ADN de la longueur d'un tour de nuclosome (environ 90 paires de bases). Pour que la rponse soit scientifiquement valide, on doit observer les molcules d'ADN lorsqu'elles sont en suspension dans la solution d'intrt et sans que des colorations, produits chimiques ou fixatifs n'aient t ajouts, tant donn que ceux-ci peuvent changer les proprits de l'ADN. La technique de la cryo-microscopie lectronique (cryo-EM) dveloppe par le groupe de Jacques Dubochet au dbut des annes 80, permet la visualisation directe des molcules d'ADN suspendues dans des couche minces vitrifies de solutions aqueuses. Toutefois, le faible contraste qui caractrise la cryo-EM combine avec la trs petite taille des minicercles d'ADN rendent ncessaire l'optimisation de plusieurs tapes, aussi bien dans la prparation des chantillons que dans le processus d'acquisition d'images afin d'obtenir deux clichs stro qui permettent la reconstruction 3-D des minicercles d'ADN. Dans la premire partie de ma thse, je dcris l'optimisation de certains paramtres pour la cryoEM et des processus d'acquisition d'image utilisant comme objets de test des plasmides et d'autres molcules d'ADN. Dans la deuxime partie, je .dcris comment j'ai construit les minicercles d'ADN de 94 bp et comment j'ai introduit des modifications structurelles comme des coupures ou des lacunes. Dans la troisime partie, je dcris l'analyse des reconstructions des rninicercles d'ADN. Cette analyse, appuye par des tests biochimiques, indique fortement que des molcules d'ADN sont capables de former de petites molcules circulaires de 94 bp sans dpasser les limites d'lasticit, indiquant que les minicercles adoptent une forme circulaire rgulire o la flexion est redistribue le long la molcule. ABSTRACT : Although physical properties of DNA structure have been intensively studied for over 50 years there are still many important questions that need to be answered. For example, what happens to protein-free double-stranded DNA when it is strongly bent, as in DNA forming nucleosomes? Is such protein-free DNA smoothly bent (i.e. it remains within elastic limits of DNA rigidity) or does it release its bending stress by forming sharp kinks (i.e. it exits the elastic regime and breaks the stacking between neighbouring base-pairs in localized regions)? Electron microscopy can provide an answer to this question by directly visualizing DNA minicircles that have the size of nucleosome gyres (ca 90 bp). For the answer to be scientifically valid, one needs to observe DNA molecules while they are still suspended in the solution of interest and no staining chemicals or fixatives have been added since these can change the properties of the DNA. CryoEM techniques developed by Jacques Dubochet's group beginning in the 1980's permit direct visualization of DNA molecules suspended in cryo-vitrified layers of aqueous solutions. However, a relatively weak contrast of cryo-EM preparations combined with the very small size of the DNA minicircles made it necessary to optimize many of the steps and parameters of the cryo-EM specimen preparation and image acquisition processes in order to obtain stereo-pairs of images that permit the 3-D reconstruction of the observed DNA minicircles. In the first part of my thesis I describe the optimization of the cryo-EM preparation and the image acquisition processes using plasmid size DNA molecules as a test object. In the second part, I describe how I formed the 94 by DNA minicircles and how I introduced structural modifications like nicks or gaps. In the third part, I describe the cryo-EM analysis of the constructed DNA minicircles. That analysis, supported by biochemical tests, strongly indicates that DNA minicircles as small as 94 by remain within the elastic limits of DNA structure, i.e. the minicircles adopt a regular circular shape where bending is redistributed along the molecules.
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La infecci pel Virus del Papil.loma Hum (VPH) s la causa principal de gaireb tots els casos de cncer cervical. En pasos on s'apliquen de manera programada tcniques de detecci, hi ha una disminuci de la incidncia i la mortalitat del cncer cervical. La detecci del VPH s un aven important per a la prevenci del cncer en permetre un diagnstic preco de lesions cancergenes. s per aix que, es va decidir estudiar durant un any a la poblaci de pacients que acudien a les consultes de ginecologia i aplicar si estava indicat el protocol de detecci de l'ADN-VPH segons les indicacions de lAsociaci Espanyola de Patologia Cervical i Colposcopia (AEPCC) per desprs traure conclusions.
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Es descriu el procs de creaci d'un Museu Virtual sobre la gentica i l'ADN, i una primera evaluaci del projecte.
