Estudo eletroquímico do dano oxidativo promovido por RNOS e PAH e o efeito protetor de antioxidantes no ADN

No dia-a-dia, os organismos vivos estão sujeitos a vários tipos de agressões de origem endógena e exógena. A produção endógena exagerada de agentes oxidantes que ocorre nos processos metabólicos dos seres vivos está intimamente associada ao aparecimento e desenvolvimento de várias patologias. Por outro lado, e devido às atividades antropogénicas, muitos agentes oxidantes de origem ambiental e alimentar entram por via exógena no organismo dos seres vivos provocando igualmente danos a nível celular. De modo a protegerem-se dos efeitos pejorativos provocados por estes compostos, os organismos vivos desenvolveram mecanismos complexos de defesa antioxidante. Este trabalho consistiu no estudo eletroquímico do dano oxidativo induzido por agentes oxidantes (PAH (hidrocarbonetos aromáticos policíclicos), H2O2, NO• e HClO) e do efeito protetor, ao dano oxidativo, promovido por antioxidantes no material baseado no ADN recorrendo à utilização de um biossensor de bases púricas, adenina-EPC (elétrodo pasta de carbono) e dA20-EPC, utilizando a voltametria de onda quadrada (VOQ) como técnica de deteção. A aplicação da eletroquímica apresenta várias vantagens para a quantificação da capacidade antioxidante total (CAT) pois, permite a redução da quantidade de reagentes e amostra em análise, elimina a etapa de remoção de cor (a cor é um interferente nos métodos óticos) e não requer equipamentos dispendiosos. Foram seguidas diferentes abordagens para a construção dos biossensores. A primeira consistiu na construção de um adenina-EPC em três etapas: i) condicionamento do EPC, ii) eletrodeposição da adenina no EPC e iii) leitura do sinal eletroquímico. Assim, foram otimizados diversos parâmetros: concentração de adenina (150,0 mg/L), potencial de condicionamento (Ec) (+ 1,80 V), potencial de deposição (Ed) (+ 0,40 V), tempo de condicionamento (tc) (180 s) e tempo de deposição (td) (240 s). Foi aplicado o adenina-EPC no estudo do dano oxidativo provocado por PAH (benzo (g,h,i) perileno) e constatou-se que era necessário transformar o benzo (g,h,i) perileno num radical para se possível observar danos oxidativos induzidos no biossensor. A nova estratégia consistiu na construção de um dA20-EPC, através da adsorção física de uma gota de dA20 na superfície do EPC, com posterior secagem e leitura do sinal eletroquímico. Neste procedimento foi otimizada a concentração de dA20 (100,0 mg/L). O dano oxidativo provocado pelo H2O2, NO• e HClO foi estudado sobre o dA20-EPC e verificou-se que os três agentes oxidantes induziam dano oxidativo no dA20-EPC. Confirmou-se a capacidade do ácido ascórbico (AA) em proteger o dA20-EPC do dano oxidativo induzido por H2O2 e NO•. O biossensor desenvolvido (dA20-EPC) foi aplicado na avaliação da CAT de diferentes amostras reais (café, sumo de laranja e água aromatizada de laranja) usando-se como agentes oxidantes o H2O2 e NO•. Todas as amostras analisadas apresentaram ter capacidade antioxidante. Quando se utilizou o dA20-EPC na presença de H2O2, verificou-se que as amostras de café apresentam valores mais elevados de CAT (1130-1488 mg AAE/L) do que as amostras de bebidas (110 mg AAE/L em água aromatizada e 775 mg AAE/L em sumo). Os valores de CAT obtidos para amostras de sumo e água aromatizada na presença de NO• indicam que a amostra de sumo possui maior teor de CAT (871 mg AAE/L) conforme era esperado, do que a amostra de água aromatizada (172 mg AAE/L). Na presença de HClO, o valor de CAT mais elevado pertence a uma amostra de sumo (513 mg AAE/L) mas, o valor de CAT da amostra de sumo natural é muito mais baixa do que o esperado (17 mg AAE/L). Foram estudados outros antioxidantes para além do AA (ácido cumárico, ácido gálico e ácido cafeico), e constatou-se que cada um deles promove proteção ao dA20-EPC na presença de cada um dos diferentes contaminantes (H2O2, NO• e HClO).

Living beings are exposed to several kinds of endogenous/exogenous aggressions throughout their lives. The exaggerated endogenous production of oxidizing agents that occur at metabolic processes of living beings is deeply related with the development of various pathologies. On the other hand, because of anthropogenic actions many of environmental and food oxidizing agents find their way by exogenous processes to get in the living beings causing cellular damages. This work consists in the electrochemical study of the effect of oxidizing agents (PAHs (polycyclic aromatic hydrocarbons), H2O2, NO• and HClO) and the protective effect, to the oxidative damage, caused by antioxidants in the material based on DNA through the use of a biosensor purine bases, adenine-CPE (carbon paste electrode) and dA20-CPE, using square wave voltammetry (SWV) as a detection technique. Using electrochemistry as a quantitative method analysis is an advantage to the quantification of total antioxidant capacity (TAC). The consumption of samples/reagents is reduced, thus eliminates the step of removing the color and doesn’t require expensive equipment. Different approaches were followed for the construction of the biosensors. The first consisted in the construction of an adenine-CPE in three steps: i) conditioning of the CPE, ii) deposition of adenine in CPE and iii) measurement of the electrochemical signal. Thus, various parameters were optimized: concentration of adenine (150.0 mg/L) conditioning potential (Ec) (+ 1.80 V) deposition potential (Ed) (+ 0.40 V) conditioning time (tc) (180 s) and deposition time (td) (240 s). Adenine-CPE was applied in oxidative damage study induced by PAH (benzo (g,h,i) perylene). We induced oxidative damage in the biosensor as it was necessary to convert benzo (g,h,i) perylene into a radical. The new strategy was based in the assembly of a dA20-CPE by a dA20 drop adsorption at the surface of CPE with further drying and electrochemical signal measurement. In this procedure the concentration of dA20 (100.0 mg / L) was optimized. Oxidative damage caused by H2O2, NO• and HOCl was studied on the dA20-CPE and it appeared that all three oxidizing agents induced oxidative damage in dA20-CPE. It was also confirmed the capacity of ascorbic acid (AA) on protecting the dA20-CPE oxidative damage induced by H2O2 and NO•. We used the developed dA20-CPE in the evaluation of TAC in various real samples (coffee, orange juice and orange flavored water) using as oxidizing agents the H2O2 and NO•. All the samples analyzed have antioxidant capacity. When dA20-CPE was used in the presence of H2O2, we noticed that the coffee samples have higher levels of TAC (1130-1488 mg AAE/L) than the beverage samples (110 mg AAE/L on flavored water and 775 mg AAE/L juice). TAC values obtained for samples of juice and flavored water in the presence of NO• indicate that the sample of juice has a higher content of TAC (526 mg AAE/L) as it was expected, than the sample of flavored water (172 mg AAE/L). In the presence of HClO, the highest TAC value belongs to a sample of juice (513 mg AAE/L) but the amount of TAC natural juice sample is much lower than expected (17 mg AAE/L). Other antioxidants were studied beyond AA (coumaric acid, gallic acid and caffeic acid), and it was observed that each of them promotes protection dA20-CPE in the presence of each of the various contaminants (H2O2, HClO, and NO•).