Régulation de l'activité transcriptionnelle du récepteur nucléaire FXR par la ghréline et les modifications post-traductionnelles

Le récepteur X des farnésoïdes (FXR) fait partie de la superfamille des récepteurs nucléaires et agit comme un facteur de transcription suite à la liaison d’un ligand spécifique. Le récepteur FXR, activé par les acides biliaires, joue un rôle essentiel dans le métabolisme des lipides et du glucose en plus de réguler l’homéostasie des acides biliaires. Notre laboratoire a récemment mis en évidence une nouvelle voie de régulation du récepteur PPARγ en réponse au récepteur de la ghréline. En effet, la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de PPARγ via une cascade de signalisation impliquant les kinases Erk1/2 et Akt, supportant un rôle périphérique de la ghréline dans les pathologies associées au syndrome métabolique. Il est de plus en plus reconnu que la cascade métabolique impliquant PPARγ fait également intervenir un autre récepteur nucléaire, FXR. Dans ce travail, nous montrons que la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de FXR de manière dose-dépendante et induit également la phosphorylation du récepteur sur ses résidus sérine. En utilisant des constructions tronquées ABC et CDEF de FXR, nous avons démontré que la ghréline régule l’activité de FXR via les domaines d’activation AF-1 et AF-2. L’effet de la ghréline et du ligand sélectif GW4064 sur l’induction de FXR est additif. De plus, nous avons démontré que FXR est la cible d’une autre modification post-traductionnelle, soit la sumoylation. En effet, FXR est un substrat cellulaire des protéines SUMO-1 et SUMO-3 et la sumoylation du récepteur est ligand-indépendante. SUMO-1 et SUMO-3 induisent l’activation transcriptionnelle de FXR de façon dose-dépendante. Nos résultats indiquent que la lysine 122 est le site prédominant de sumoylation par SUMO-1, quoiqu’un mécanisme de coopération semble exister entre les différents sites de sumoylation de FXR. Avec son rôle émergeant dans plusieurs voies du métabolisme lipidique, l’identification de modulateurs de FXR s’avère être une approche fort prometteuse pour faire face à plusieurs pathologies associées au syndrome métabolique et au diabète de type 2.

Analytical strategies for the comprehensive profiling of histone post translational modifications by mass spectrometry and implications for functional analyses

Le long bio-polymère d'ADN est condensé à l’intérieur du noyau des cellules eukaryotes à l'aide de petites protéines appelées histones. En plus de leurs fonctions condensatrices,ces histones sont également la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles(MPT), particulièrement au niveau de leur section N-terminale. Ces modifications réversibles font partie d’un code d’histones épi-génétique transmissible qui orchestre et module dynamiquement certains événements impliquant la chromatine, tels l’activation et la désactivation de gènes ainsi que la duplication et la réparation d’ADN. Ces modifications sont impliquées subséquemment dans la signalisation et la progression de cancers, tels que la leucémie. En conséquence, l'élucidation des modifications d’histones est importante pour comprendre leurs fonctions biologiques. Une méthodologie analytique a été mise au point en laboratoire pour isoler, détecter, et quantifier les MPT d’histones en utilisant une approche rapide à deux volets à l’aide d’outils bioinformatiques spécialisés. La méthodologie développée en laboratoire a été validée en utilisant des histones de souche sauvage ainsi que deux types d’histones mutants déficients en enzymes acétyltransferase. Des trois sources d’histones utilisées, la seule MPT qui a démontré un changement significatif est l’acétylation de l’histone H3 à lysine 56 (H3K56ac). L’expression et la stoechiométrie de cette MPT, issue de cellules de souche sauvage et de cellules mutantes, ont été déterminées avec précision et comparées. Les fonctions de balayage polyvalentes d'un instrument à trappe ionique quadrupôle linéaire hybride ont été utilisées pour améliorer la détection de protéines intactes. Le mode de balayage « enhanced multiply charged » (EMC) a été modifié pour contenir et détecter les ions de protéines intactes situées dans la trappe ionique linéaire. Ce mode de balayage nommé « targeted EMC » (tEMC) a permis de quadrupler le niveau de sensibilité (signal/interférence), et quintupler la résolution du mode de balayage conventionnel. De plus, la capacité de séparation des charges du tEMC a réduit de façon significative les effets de « space charge » dans la trappe ionique linéaire. La résolution supérieure du mode tEMC a permis de différencier plusieurs isoformes modifiées, particulièrement pour l’histone H3. L’analyse des peptides d’histones trypsiques à l’aide du mode de balayage « MRM » a permis le séquençage et la quantification de MPT avec un haut degré de précision. La seule MPT qui était sous-exprimée entre l’histone de souche sauvage et le mutant DOT1L fut la méthylation de l’histone H3 lysine 79(H3K79me1). Les effets de deux inhibiteurs d’enzymes HDAC (HDACi) sur l’expression de MPT d’histone ont été évalués en utilisant la méthodologie analytique mentionnée. Les histones extraites de cellules normales et cancéreuses ont été exposées à du Vorinostat(SAHA) ou du Entinostat (MS-275) pour une période de 24 à 72 heures. Deux histones furent principalement affectées, soit H3 et H4. Étonnamment, les mêmes effets n'ont pas été détectés lorsque les cellules normales ont été traitées avec le HDACi pour une période de 48 à 72 heures. Une méthode absolue de quantification avec une courbe d’étalonnage a été développée pour le peptide H3K56ac. Contrairement à certaines publications, nos résultats démontrent que cette MPT est présente dans les cellules mammifères avec une stoechiométrie très basse (< 0,1%) et n'est pas surexprimée de façon significative après le traitement au HDACi.

Modifications de la matrice extracellulaire dans la rigidité artérielle

La paroi vasculaire est composée de cellules endothéliales, de cellules musculaires lisses vasculaires et de fibroblastes qui sont entourés d’un réseau structuré et complexe de protéines, la matrice extracellulaire. Les interactions réciproques entre la matrice et les cellules sont nécessaires à la croissance, au développement et au remodelage. Or, différents contextes pathologiques entraînent la perturbation de ces interactions et sont la cause de différentes maladies. Au cours du vieillissement, la matrice extracellulaire des grosses artères élastiques est modifiée. Ainsi, les lamelles élastiques de la paroi vasculaire se fragmentent ou sont dégradées, en plus de calcifier. De même, l’accumulation de protéines plus rigides, comme le collagène, entraîne le développement de la fibrose. Ces modulations vont mener à l’augmentation de la rigidité artérielle et au développement de l’hypertension systolique isolée. En utilisant un modèle animal de calcification basé sur l’inhibition d’une protéine anti-calcifiante, la matrix Gla protein, avec la warfarine, nous avons étudié la séquence des événements impliqués dans le développement de l’hypertension systolique isolée. Nous avons observé l’activation précoce et transitoire de MMP-9, puis du TGF-ß, précédant la modulation phénotypique des cellules musculaires lisses vasculaires, la calcification et les changements hémodynamiques. L’inhibition des métalloprotéinases et du TGF-ß a permis de prévenir la calcification vasculaire. Nous avons également étudié le rôle joué par une enzyme de la matrice extracellulaire, la transglutaminase 2, dans le développement de la calcification associée à l’hypertension systolique isolée. À l’aide d’un nouvel inhibiteur de cette enzyme, qui a permis de prévenir la calcification, nous avons établi que la transglutaminase était un élément clé dans le processus pathologique. Ces travaux ont permis de démontré l’intérêt de nouvelles avenues thérapeutiques ciblant directement la matrice extracellulaire, particulièrement la MMP-9, le TGF-ß et la transglutaminase 2, dans la pathologie de l’hypertension systolique isolée.

Identification du rôle et des modifications post-traductionnelles modulant l’export nucléaire de l’hélicase virale E1 au cours du cycle de réplication du virus du papillome humain

Les virus du papillome humain (VPH) sont de petits virus à ADN double brin infectant les épithéliums de la peau et des muqueuses. La réplication nécessaire au maintien de leur génome dans les cellules infectées dépend des protéines virales E1 et E2. Au cours de la réplication, E1 est recrutée à l’origine de réplication par E2 afin d’être assemblée en doubles hexamères capables de dérouler l’ADN. E1 contient un domaine C-terminal responsable de l’activité ATPase/hélicase, un domaine central de liaison à l’origine et une région N-terminale régulant la réplication in vivo. Cette région contient des signaux de localisation et d’export nucléaire qui modulent le transport intracellulaire de E1. Chez le virus du papillome bovin (VPB), il a été proposé que ce transport est régulé par la sumoylation de E1. Finalement, la région N-terminale de E1 contient un motif de liaison aux cyclines permettant son interaction avec la cycline E/A-Cdk2. La phosphorylation de E1 par cette dernière régule différemment l’export nucléaire des protéines E1 du VPB et du VPH. Dans la première partie de cette étude, nous avons démontré que bien que la protéine E1 des VPH interagit avec Ubc9, l’enzyme de conjugaison de la voie de sumoylation, cette voie n’est pas requise pour son accumulation au noyau. Dans la seconde partie, nous avons déterminé que l’accumulation nucléaire de E1 est plutôt régulée pas sa phosphorylation. En fait, nous avons démontré que l’export nucléaire de E1 est inhibé par la phosphorylation de sérines conservées de la région N-terminale de E1 par Cdk2. Puis, nous avons établi que l’export nucléaire de E1 n’est pas nécessaire à l’amplification du génome dans les kératinocytes différenciés mais qu’il est requis pour le maintien du génome dans les kératinocytes non différenciés. En particulier, nous avons découvert que l’accumulation nucléaire de E1 inhibe la prolifération cellulaire en induisant un arrêt du cycle cellulaire en phase S et que cet effet anti-prolifératif est contrecarrée par l’export de E1 au cytoplasme. Dans la troisième partie de cette étude, nous avons démontré que l’arrêt cellulaire induit par E1 dépend de sa liaison à l’ADN et à l’ATP, et qu’il est accompagné par l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN dépendante de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated). Ces deux événements semblent toutefois distincts puisque la formation d’un complexe E1-E2 réduit l’activation de la voie de réponse aux dommages par E1 sans toutefois prévenir l’arrêt de cycle cellulaire. Finalement, nous avons démontré que la réplication transitoire de l’ADN viral peut avoir lieu dans des cellules arrêtées en phase S, indépendamment de l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN et de la kinase ATM. Globalement, nos résultats démontrent que l’export nucléaire de E1 est régulé par sa phosphorylation et non par sa sumoylation. Ils démontrent également que l’export nucléaire de E1 est essentiel au maintien du génome dans les kératinocytes, possiblement parce qu’il prévient l’inhibition de la prolifération cellulaire et l’activation de la voie de réponse aux dommages à l’ADN en limitant l’accumulation de E1 au noyau.

Modifications de l’activité préfrontale pendant le traitement de stimuli émotionnels visuels chez des patients schizophrènes avant et après médication à la Ziprasidone : étude en IRM fonctionnelle

Bien que les troubles cognitifs soient un aspect essentiel de la schizophrénie, le dysfonctionnement des systèmes émotionnels y est également considéré comme un élément très important de cette maladie d’autant plus que plusieurs régions du cerveau sont concernées par la régulation émotionnelle. Le principal objectif du présent travail était d’explorer, en imagerie par résonnance magnétique fonctionnelle (IRMf), l’effet de la ziprasidone sur les différentes réponses neuronales à l’affichage de stimuli émotionnels au niveau de la région préfrontale,particulièrement dans le cortex cingulaire antérieur [CCA], le cortex orbito-frontal [COF] et le cortex préfrontal dorso-latéral [CPFDL]. Nous avons examiné les activations cérébrales, chez des patients souffrants de schizophrénie avant et après médication à la ziprasidone, en leur présentant des séries d’images émotionnellement chargées (négatives, neutres et positives) associées à différentes instructions quand aux types d’images qu’ils devaient sélectionner (négatives,neutres et positives). Nous avons analysé les différents changements d’activation (avant et après médication) essentiellement pour les valences extrêmes des stimuli (positives et négatives), ensuite nous avons regardé l’effet du type d’instruction sur ces changements. L’échantillon comprenait 13 patients atteints de schizophrénie et 15 témoins sains. Nous avons également effectué une évaluation clinique des symptômes dépressifs, positifs et négatifs de la maladie ainsi que des mesures biochimiques et de poids avant et après 16 semaines de médication. Malgré l’absence de changement significatif sur les mesures cliniques (PANSS et Dépression) avant et après une moyenne de 14.3 semaines de médication à la ziprasidone, plusieurs régions préfrontales (CCA, COF, CPDL) ont sensiblement accru leur réponse aux stimuli positifs par rapport aux stimuli négatifs. En outre, dans les régions habituellement impliquées dans le contrôle cognitif (CCA et CPFDL), cette tendance s'est accentuée lorsque les patients ont été invités à ne sélectionner que les stimuli négatifs (effet du type d’instruction). Nous avons également trouvé plusieurs similitudes dans le fonctionnement préfrontal (à la fois dans le volume et la force d'activation) entre les contrôles sains et les patients après médication en tenant compte du type d’instruction plus que de la valence émotionnelle des images. Pour conclure, les résultats de la présente étude suggèrent que le traitement antipsychotique avec la ziprasidone améliore le fonctionnement cognitif lié au traitement de l'information émotionnelle dans le cortex préfrontal chez les patients souffrant de schizophrénie. Étant donné le mécanisme d'action neuro-pharmacologique de la ziprasidone (plus d'affinité pour la sérotonine que pour les récepteurs de la dopamine dans le cortex préfrontal), nous pensons que nos résultats démontrent que le contrôle cognitif et la régulation des réactions face à des stimuli émotionnellement chargés dans la schizophrénie sont liés à une plus forte concentration de dopamine dans les voies préfrontales.

Études des modifications post-traductionnelles de Khd1p et de leur rôle dans la régulation de la traduction de l'ARNm ASH1 chez la levure Saccharomyces cerrevisiae

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Rôles des modifications de la microflore bactérienne et de l'exudation racinaire de la tomate par la symbiose mycorhizienne dans le biocontrôle sur le Phytophthora nicotianae

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Relationship between monitored elements and prescribed ventilator setting modifications in critically ill children

Les pédiatres intensivistes ont plusieurs éléments disponibles pour guider leurs décisions par rapport à la ventilation mécanique. Par contre, aucune étude prospective ne décrit les éléments auxquels les intensivistes se réfèrent pour modifier les paramètres du respirateur. Objectifs : Décrire la pratique actuelle de la modification des paramètres du respirateur aux soins intensifs du CHU Sainte-Justine, un hôpital pédiatrique tertiaire. Hypothèse : 80% des modifications des paramètres du respirateur influant sur l’épuration du CO2 sont liées à l’analyse de la PCO2 ou du pH et 80% des modifications des paramètres d’oxygénation sont liés à l’analyse de l’oxymétrie de pouls. Méthodes : En se servant d’un logiciel de recueil de données, les soignants ont enregistré un critère de décision primaire et tous les critères de décision secondaires menant à chaque modification de paramètre du respirateur au moment même de la modification. Résultats : Parmi les 194 modifications des paramètres du respirateur influant sur l’épuration du CO2, faites chez vingts patients, 42.3% ±7.0% avaient pour critère primaire la PCO2 ou le pH sanguin. Parmi les 41 modifications de la pression expiratoire positive et les 813 modifications de la fraction d’oxygène inspirée, 34.1% ±14.5% et 84.5% ±2.5% avaient pour critère primaire l’oxymétrie de pouls, respectivement. Conclusion : Les médecins surestiment le rôle de la PCO2 et du pH sanguins et sousestiment le rôle d’autres critères de décision dans la gestion de la ventilation mécanique. L’amélioration de notre compréhension de la pratique courante devrait aider à l’éboration des systèmes d’aide à la décision clinique en assistance respiratoire.

Identification de modifications post-traductionnelles de Staufen1 et étude de leur fonction régulatrice

La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle de premier plan dans le contrôle fin de l’expression génique en permettant une modulation de la synthèse de protéines dans le temps et l’espace, en fonction des besoins de la cellule. Ainsi, des protéines reconnaissant des éléments d’ARN présents sur des transcrits peuvent influencer toutes les étapes de leur existence, soit leur épissage, leur export nucléaire, leur localisation subcellulaire, leur traduction et leur dégradation. Staufen1 (Stau1) est un membre de la famille des protéines liant l’ARN double-brin qui contribue à la régulation post-transcriptionnelle par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir l’épissage alternatif, le transport, la dé-répression de la traduction et l’induction de la dégradation d’ARN messagers (ARNm) spécifiques. L’identité des cibles potentielles de Stau1 est maintenant connue puisqu’une étude à l’échelle du génome a montré que la protéine s’associe à près de 7% du transcriptome des cellules HEK293T. Ces ARNm se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles, mais il est tout de même intéressant de noter qu’une grande proportion d’entre eux code pour des protéines reliées au métabolisme cellulaire et à la régulation de processus cellulaires. En considérant toutes ces informations, nous avons émis l’hypothèse que les différentes activités de Stau1 puissent être modulées afin de contrôler adéquatement l’expression des transcrits liés par la protéine. Dans la mesure où certains ARNm faisant partie des complexes définis par la présence de Stau1 codent pour des régulateurs clés de la prolifération cellulaire, nous avons voulu examiner si l’expression de la protéine varie au cours du cycle de division cellulaire. Nous avons montré que l’abondance de Stau1 est maximale en début de mitose et qu’elle diminue ensuite lorsque les cellules complètent la division cellulaire. Nous avons ensuite découvert que cette baisse d’expression de Stau1 en sortie de mitose dépend du complexe promoteur d’anaphase/cyclosome (APC/C). En soutien à l’idée que Stau1 soit une cible de cette ubiquitine ligase de type E3, nous avons de plus démontré que Stau1 est ubiquitiné et dégradé par le protéasome. Ce contrôle des niveaux de Stau1 semble important puisque la surexpression de la protéine retarde la sortie de mitose et entraîne une diminution importante de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, nous avons supposé que les différentes fonctions de Stau1 puissent également être sujettes à une régulation. Compte tenu que les activités de nombreuses protéines liant l’ARN peuvent être contrôlées par des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, nous avons voulu tester la possibilité que Stau1 soit phosphorylé. L’immunopurification de Stau1 et son analyse par spectrométrie de masse nous a permis d’identifier trois phosphosites dans la protéine. L’évaluation du rôle de ces événements de phosphorylation à l’aide de mutants phoshomimétiques ou non-phoshorylables a révélé que la modification de Stau1 pourrait compromettre son association à la protéine UPF1. Comme cette interaction est nécessaire pour déstabiliser les transcrits liés par Stau1, nos résultats suggèrent fortement que la fonction de Stau1 dans la dégradation d’ARNm est régulée négativement par sa phosphorylation. Toutes ces données mettent en lumière l’importance des modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination et la phosphorylation dans la modulation de l’expression et des fonctions de Stau 1. Somme toute, il est vraisemblable que ces mécanismes de contrôle puissent avoir un impact significatif sur le destin des ARNm liés par Stau1, particulièrement dans un contexte de progression dans le cycle cellulaire.

Les modifications de la relation médecin/patient au contact de la télématique médicale: quelques réflexions à battons rompus

La relation entre un médecin et son patient a grandement évolué. Aujourd’hui le médecin, loin de jouer le rôle paternaliste d’autrefois, se voit obligé d’établir un dialogue avec son patient. Des informations sont transmises de l’un à l’autre et de l’autre à l’un, le tout dans une optique de cogestion de la santé du patient. D’un côté le patient doit fournir au médecin les informations suffisantes pour que celui-ci établisse un diagnostic. D’un autre côté le médecin doit informer le patient de son état de santé et des mesures qu’il compte prendre. Dans la foulée du développement des nouvelles technologies, les modes de transmission de telles informations présentent de nouvelles problématiques. L’auteur propose ici une étude de la relation patient/médecin lorsqu’il s’agit de la transmission de données relatives à l’état de santé par Internet ou un réseau privé et du rôle de chacune des parties dans ce réseau en regard de la Directive 95/46/CE. Il ressort de cette étude que le médecin se voit imposer certaines responsabilités à titre de responsable du traitement, notamment en ce qui concerne le traitement des données personnelles de son patient. Ce dernier, en tant que personne concernée au sens de la Directive, se voit donc octroyer des droits fondamentaux en matière de confidentialité. De plus il détermine, en collaboration avec le médecin, les finalités du traitement de ces données personnelles.

Regulation of BAP1 tumor suppressor complex by post-translational modifications

Le régulateur transcriptionnel BAP1 est une déubiquitinase nucléaire (DUB) dont le substrat est l’histone H2A modifiée par monoubiquitination au niveau des residus lysines 118 et 119 (K118/K119). Depuis les dernières années, BAP1 emerge comme un gene suppresseur de tumeur majeur. En effet, BAP1 est inactivé dans un plethore de maladies humaines héréditaires et sporadiques. Cependant, malgré l’accumulation significative des connaissances concernant l’occurrence, la pénétrance et l’impact des défauts de BAP1 sur le développement de cancers, ses mécanismes d’action et de régulation restent très peu compris. Cette étude est dédiée à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle du complexe multi-protéique de BAP1 et se présente parmi les premiers travaux décrivant sa régulation par des modifications post-traductionnelles. D’abord, nous avons défini la composition du corps du complexe BAP1 ainsi que ses principaux partenaires d’interaction. Ensuite, nous nous sommes spécifiquement intéressés a investiguer d’avantage deux principaux aspects de la régulation de BAP1. Nous avons d’abord décrit l’inter-régulation entre deux composantes majeures du complexe BAP1, soit HCF-1 et OGT. D’une manière très intéressante, nous avons trouvé que le cofacteur HCF-1 est un important régulateur des niveaux protéiques d’OGT. En retour, OGT est requise pour la maturation protéolytique de HCF-1 en promouvant sa protéolyse par O-GlcNAcylation, un processus de régulation très important pour le bon fonctionnement de HCF-1. D’autre part, nous avons découvert un mécanisme unique de régulation de BAP1 médiée par l’ubiquitine ligase atypique UBE2O. en effet, UBE2O se caractérise par le fait qu’il s’agit aussi bien d’une ubiquitine conjuratrice et d’une ubiquitine ligase. UBE2O, multi-monoubiquitine BAP1 au niveau de son domaine NLS et promeut son exclusion du noyau, le séquestrant ainsi dans le cytoplasme. De façon importante, nos travaux ont permis de mettre de l’emphase sur le rôle de l’activité auto-catalytique de chacune de ces enzymes, soit l’activité d’auto-déubiquitination de BAP1 qui est requise pour la maintenance de sa localisation nucléaire ainsi que l’activité d’auto-ubiquitination d’UBE2O impliquée dans son transport nucléo-cytoplasmique. De manière significative, nous avons trouvé que des défauts au niveau de l’auto-déubiquitination de BAP1 due à des mutations associées à certains cancers indiquent l’importance d’une propre regulation de cette déubiquitinase pour les processus associés à la suppression de tumeurs.

Chicken Caecal Microbiome Modifications Induced by Campylobacter jejuni Colonization and by a Non-Antibiotic Feed Additive

Campylobacter jejuni is an important zoonotic foodborne pathogen causing acute gastroenteritis in humans. Chickens are often colonized at very high numbers by C. jejuni, up to 109 CFU per gram of caecal content, with no detrimental effects on their health. Farm control strategies are being developed to lower the C. jejuni contamination of chicken food products in an effort to reduce human campylobacteriosis incidence. It is believed that intestinal microbiome composition may affect gut colonization by such undesirable bacteria but, although the chicken microbiome is being increasingly characterized, information is lacking on the factors affecting its modulation, especially by foodborne pathogens. This study monitored the effects of C. jejuni chicken caecal colonization on the chicken microbiome in healthy chickens. It also evaluated the capacity of a feed additive to affect caecal bacterial populations and to lower C. jejuni colonization. From day-0, chickens received or not a microencapsulated feed additive and were inoculated or not with C. jejuni at 14 days of age. Fresh caecal content was harvested at 35 days of age. The caecal microbiome was characterized by real time quantitative PCR and Ion Torrent sequencing. We observed that the feed additive lowered C. jejuni caecal count by 0.7 log (p<0.05). Alpha-diversity of the caecal microbiome was not affected by C. jejuni colonization or by the feed additive. C. jejuni colonization modified the caecal beta-diversity while the feed additive did not. We observed that C. jejuni colonization was associated with an increase of Bifidobacterium and affected Clostridia and Mollicutes relative abundances. The feed additive was associated with a lower Streptococcus relative abundance. The caecal microbiome remained relatively unchanged despite high C. jejuni colonization. The feed additive was efficient in lowering C. jejuni colonization while not disturbing the caecal microbiome.

Quantitative proteomics methods for the analysis of histone post-translational modifications

Les histones sont des protéines nucléaires hautement conservées chez les cellules des eucaryotes. Elles permettent d’organiser et de compacter l’ADN sous la forme de nucléosomes, ceux-ci representant les sous unités de base de la chromatine. Les histones peuvent être modifiées par de nombreuses modifications post-traductionnelles (PTMs) telles que l’acétylation, la méthylation et la phosphorylation. Ces modifications jouent un rôle essentiel dans la réplication de l’ADN, la transcription et l’assemblage de la chromatine. L’abondance de ces modifications peut varier de facon significative lors du developpement des maladies incluant plusieurs types de cancer. Par exemple, la perte totale de la triméthylation sur H4K20 ainsi que l’acétylation sur H4K16 sont des marqueurs tumoraux spécifiques a certains types de cancer chez l’humain. Par conséquent, l’étude de ces modifications et des événements determinant la dynamique des leurs changements d’abondance sont des atouts importants pour mieux comprendre les fonctions cellulaires et moléculaires lors du développement de la maladie. De manière générale, les modifications des histones sont étudiées par des approches biochimiques telles que les immuno-buvardage de type Western ou les méthodes d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Cependant, ces approches présentent plusieurs inconvénients telles que le manque de spécificité ou la disponibilité des anticorps, leur coût ou encore la difficulté de les produire et de les valider. Au cours des dernières décennies, la spectrométrie de masse (MS) s’est avérée être une méthode performante pour la caractérisation et la quantification des modifications d’histones. La MS offre de nombreux avantages par rapport aux techniques traditionnelles. Entre autre, elle permet d’effectuer des analyses reproductibles, spécifiques et facilite l’etude d’un large spectre de PTMs en une seule analyse. Dans cette thèse, nous présenterons le développement et l’application de nouveaux outils analytiques pour l’identification et à la quantification des PTMs modifiant les histones. Dans un premier temps, une méthode a été développée pour mesurer les changements d’acétylation spécifiques à certains sites des histones. Cette méthode combine l’analyse des histones intactes et les méthodes de séquençage peptidique afin de déterminer les changements d’acétylation suite à la réaction in vitro par l’histone acétyltransférase (HAT) de levure Rtt109 en présence de ses chaperonnes (Asf1 ou Vps75). Dans un second temps, nous avons développé une méthode d’analyse des peptides isomériques des histones. Cette méthode combine la LC-MS/MS à haute résolution et un nouvel outil informatique appelé Iso-PeptidAce qui permet de déconvoluer les spectres mixtes de peptides isomériques. Nous avons évalué Iso-PeptidAce avec un mélange de peptides synthétiques isomériques. Nous avons également validé les performances de cette approche avec des histones isolées de cellules humaines érythroleucémiques (K562) traitées avec des inhibiteurs d’histones désacétylases (HDACi) utilisés en clinique, et des histones de Saccharomyces cerevisiae liées au facteur d’assemblage de la chromatine (CAF-1) purifiées par chromatographie d’affinité. Enfin, en utilisant la méthode présentée précédemment, nous avons fait une analyse approfondie de la spécificité de plusieurs HATs et HDACs chez Schizosaccharomyces pombe. Nous avons donc déterminé les niveaux d’acétylation d’histones purifiées à partir de cellules contrôles ou de souches mutantes auxquelles il manque une HAT ou HDAC. Notre analyse nous a permis de valider plusieurs cibles connues des HATs et HDACs et d’en identifier de nouvelles. Nos données ont également permis de définir le rôle des différentes HATs et HDACs dans le maintien de l’équilibre d’acétylation des histones. Dans l’ensemble, nous anticipons que les méthodes décrites dans cette thèse permettront de résoudre certains défis rencontrés dans l’étude de la chromatine. De plus, ces données apportent de nouvelles connaissances pour l’élaboration d’études génétiques et biochimiques utilisant S. pombe.

Modifications post-traductionnelles des canaux calciques cardiaques de type L : identification des résidus asparagine qui participent à la glycosylation de la sous-unité auxiliaire CaVα2δ1

Les canaux calciques de type L CaV1.2 sont principalement responsables de l’entrée des ions calcium pendant la phase plateau du potentiel d’action des cardiomyocytes ventriculaires. Cet influx calcique est requis pour initier la contraction du muscle cardiaque. Le canal CaV1.2 est un complexe oligomérique qui est composé de la sous-unité principale CaVα1 et des sous-unités auxiliaires CaVβ et CaVα2δ1. CaVβ joue un rôle déterminant dans l’adressage membranaire de la sous-unité CaVα1. CaVα2δ1 stabilise l’état ouvert du canal mais le mécanisme moléculaire responsable de cette modulation n’a pas été encore identifié. Nous avons récemment montré que cette modulation requiert une expression membranaire significative de CaVα2δ1 (Bourdin et al. 2015). CaVα2δ1 est une glycoprotéine qui possède 16 sites potentiels de glycosylation de type N. Nous avons donc évalué le rôle de la glycosylation de type-N dans l’adressage membranaire et la stabilité de CaVα2δ1. Nous avons d’abord confirmé que la protéine CaVα2δ1 recombinante, telle la protéine endogène, est significativement glycosylée puisque le traitement à la PNGase F se traduit par une diminution de 50 kDa de sa masse moléculaire, ce qui est compatible avec la présence de 16 sites Asn. Il s’est avéré par ailleurs que la mutation simultanée de 6/16 sites (6xNQ) est suffisante pour 1) réduire significativement la densité de surface de! CaVα2δ1 telle que mesurée par cytométrie en flux et par imagerie confocale 2) accélérer les cinétiques de dégradation telle qu’estimée après arrêt de la synthèse protéique et 3) diminuer la modulation fonctionnelle des courants générés par CaV1.2 telle qu’évaluée par la méthode du « patch-clamp ». Les effets les plus importants ont toutefois été obtenus avec les mutants N663Q, et les doubles mutants N348Q/N468Q, N348Q/N812Q, N468Q/N812Q. Ensemble, ces résultats montrent que Asn663 et à un moindre degré Asn348, Asn468 et Asn812 contribuent à la biogenèse et la stabilité de CaVα2δ1 et confirment que la glycosylation de type N de CaVα2δ1 est nécessaire à la fonction du canal calcique cardiaque de type L.