Chronic bradykinin receptor blockade modulates neonatal renal function.

Recent data indicate that bradykinin participates in the regulation of neonatal glomerular function and also acts as a growth regulator during renal development. The aim of the present study was to investigate the involvement of bradykinin in the maturation of renal function. Bradykinin beta2-receptors of newborn rabbits were inhibited for 4 days by Hoe 140. The animals were treated with 300 microg/kg s.c. Hoe 140 (group Hoe, n = 8) or 0.9% NaCl (group control, n = 8) twice daily. Clearance studies were performed in anesthetized rabbits at the age of 8-9 days. Bradykinin receptor blockade did not impair kidney growth, as demonstrated by similar kidney weights in the two groups, nor did it influence blood pressure. Renal blood flow was higher, while renal vascular resistance and filtration fraction were lower in Hoe 140-treated rabbits. No difference in glomerular filtration rate was observed. The unexpectedly higher renal perfusion observed in group Hoe cannot be explained by the blockade of the known vasodilator and trophic effect of bradykinin. Our results indicate that in intact kallikrein-kinin system is necessary for the normal functional development of the kidney.

A monoclonal antibody which blocks the function of factor D of human complement.

Factor D is an essential enzyme for activation of complement by the alternative pathway (AP). It has been difficult to obtain mouse monoclonal antibodies (Mabs) which block the function of factor D. We have developed a strategy to obtain such Mabs using a double screening procedure of the initial clones. We selected the clone whose supernatant had the lowest level of anti-factor D Ab by ELISA and abolished factor D haemolytic activity. Addition of this Mab to human serum was shown to abolish conversion of C3 by cobra venom factor, haemolysis of rabbit erythrocytes, and activation of C3 and C5 by cuprophane dialysis membranes.

Disorders of pupillary structure and function.

Neurologists are frequently consulted because of a pupillary abnormality. An unequal size of the pupils, an unusual shape, white colored pupils, or a poorly reactive pupil are common reasons for referral. A directed history and careful observation of the iris and pupil movements can bear out ocular pathology such as congenital or structural anomalies as the cause of abnormal pupils. Thereafter, it is important to evaluate the neurologic causes of anisocoria and poor pupil function. The first part of this article emphasizes pupillary abnormalities frequently encountered in infants and children and discusses some of the more common acquired iris structural defects. The second part focuses on evaluation of lesions in the neural pathways that result in pupillary dysfunction, with particular attention to those conditions having neurologic, systemic, or visual implications.

Physical activity and enhanced fitness to improve cognitive function in older people without known cognitive impairment

Physical activity is beneficial for healthy ageing. It may also help maintain good cognitive function in older age. Aerobic activity improves cardiovascular fitness, but it is not known whether this sort of fitness is necessary for improved cognitive function.��Eleven studies of aerobic physical activity programmes for healthy people over the age of 55 years have been included in this review. Eight of these 11 studies reported that aerobic exercise interventions resulted in increased fitness of the trained group and an improvement in at least one aspect of cognitive function. The largest effects were on cognitive speed, auditory and visual attention. However, the cognitive functions which improved were not the same in each study and the majority of comparisons yielded no significant results.��The data are insufficient to show that the improvements in cognitive function which can be attributed to physical exercise are due to improvements in cardiovascular fitness.

Analysis of the regulation of Nodal function by SPC-mediated cleavage during early mammalian development

RÉSUMÉ Après implantation dans l'utérus, le foetus de mammifère est composé de trois populations différentes de cellules: l'epiblast, l'ectoderme extraembryonnaire et l'endoderme viscéral. Pendant la gastrulation, les cellules de l'epiblast donnent naissance aux trois lignées germinales: l'ectoderme, le mésoderme et l'endodermes. Les lignées germinales produisent par la suite les différents tissus et organes du corps embryonnaire et adulte. Les cellules de l'ectoderme extraembryonnaire donnent par la suite le composant foetal du placenta qui est essentiel à la survie de l'embryon dans l'utérus. L'épiblast et l'ectoderme extraembryonnaire sont entourés par l'endoderme viscéral et forment une structure connue sous le nom de bouton embryonnaire. L'endoderme viscéral joue un rôle important dans l'embryogenèse car il comporte une sous-population de cellules appelées l'endoderme viscéral antérieur dont les signaux influencent l'épiblast adjacent et déterminent le futur axe antéro-postérieur de l'embryon. La protéine de signalisation Nodal de la famille des TGFß est essentielle dans l'épiblast pour spécifier le mésendoderme, l'endoderme viscéral antérieur, ainsi que pour maintenir les cellules souche de l'ectoderme extraembryonnaire. Ainsi, dans les embryons mutants pour Nodal, aucun axe antéro-postérieur n'est établi, les lignées germinales ne sont pas spécifiés et le placenta ne se développe pas. Au niveau moléculaire, comme pour les protéines de la famille des TGFß, Nodal est initialement synthétisée sous forme de précurseur avant d'être clivée de façon endoproteolytique par des protéanes sécrétées, les proprotéines convertases du type subtilisin (SPC), qui suppriment la partie inhibitrice N-terminale du pro peptide. Dans ce contexte, le projet de ma thèse a été d'analyser l'influence des SPC sur la fonction de Nodal en employant une combinaison d'approches génétiques et biochimiques. Premièrement, nous avons constaté que le clivage du précurseur par les protéases active Nodal, mais en même temps augmente son turn-over et diminue la portée de son action. Deuxièmement, dans l'embryon, il apparaît que Nodal est activé par l'action combinée de Furin et de PACE4, deux protéases sécrétées qui sont spécifiquement exprimées dans les cellules de l'ectoderme extraembryonnaire, donc adjacentes au domaine d'expression de Nodal. De manière similaire aux mutants de Nodal, les embryons mutants pour les deux protéases ne forment pas d'endoderme viscéral antérieur et ne gastrulent pas. Cependant, certains gènes cible de Nodal restent exprimés, suggérant que toutes les activités de Nodal ne sont pas dépendent du clivage par les SPCs. En effet, la génération et l'analyse de mutants portant un allèle knock-in qui code pour une forme mutante de Nodal résistante aux SPC, ont montré que ces mutants ont les caractères phénotypique des mutants de Nodal seulement de façon partielle. La formation de mésoderme est partiellement induite, et de façon remarquable, la forme de Nodal résistante aux SPC est capable d'agir à une distance de sa source, maintenant l'expression de ses propres protéases et d'autres gènes essentiels pour la spécification de l'ectoderme extraembryonnaire. Ensemble, ces résultats prouvent que par leur action directe les protéases extraembryonnaire modulent la signalisation de Nodal pendant le développement mammifère précoce. SUMMARY : Early after implantation in the uterus, the mammalian conceptus is composed of three different cell populations: the epiblast, the extraembryonic ectoderm and the visceral endoderm. During gastrulation, epiblast cells give rise to the three embryonic germ layers: the ectoderm, the mesoderm and the endoderm. These germ layers then generate the different tissues and organs of the embryonic and adult bodies. In parallel, extraembryonic ectoderm cells give rise to the fetal component of the placenta, which is essential for the survival of the embryo in the uterus. Both the epiblast and extraembryonic ectoderm are surrounded by the visceral endoderm to form a structure known as the egg cylinder. The visceral endoderm plays an important role as it harbours a subpopulation of cells called the anterior visceral endoderm, from which signals influence the adjacent epiblast and determine the future antero-posterior embryonic axis. The TGFß-related signalling protein Nodal is required within the epiblast to specify the mesoderm, the endoderm,the anterior visceral endoderm and is also essential to maintain stem cells in the extraembryonic ectoderm. Thus, in Nodal null conceptuses, no antero-posterior axis is established, the germ layers are not specified and the placenta does not develop. At the molecular level, Nodal, like related proteins of the TGFß family, is initially synthesized as a precursor and undergoes endoproteolytic cleavage by secreted proteases of the subtilisin-like proprotein convertases (SPC) to remove an inhibitory N-terminal pro peptide. In the embryo, Nodal is activated by the combined action of Furin and PACE4, two secreted SPCs that are specifically expressed in cells of the extraembryonic ectoderm, thus adjacent to the Nodal expression domain. Similar to Nodal null .embryos, mutant embryos lacking both these proteases fail to specify the anterior visceral endoderm and to undergo gastrulation. However, these mutants still express a subset of Nodal target genes, suggesting that part of Nodal activity is independent on cleavage by SPCs. Indeed, by generating and analyzing mutants with a knock-in allele that encodes an SPC-resistant mutant form of Nodal, I could show that they retain a subset of Nodal activities. Mesoderm formation is partially induced, but most remarkably, SPC-resistant Nodal form is able to act at a distance from its source, maintaining the expression of its proteases and of other genes essential for maintenance of the extraembryonic ectoderm.

Regulation of HCF-1 function via proteolytic maturation and HCF-1 subunit interaction

Abstract : Host-Cell Factor 1 (HCF-1) was first discovered in the study of the herpes simplex virus (HSV) infection. HCF-1 is one of the two cellular proteins that compose the VP16-induced complex, a key activator of HSV lytic infection. lncleed, when HSV infects human cells, it is able to enter two modes of infection: lytic or latent. The V`P16-induced complex promotes the lytic mode and in so doing the virus targets important cellular regulatory proteins, such as HCF-1, to manipulate the status of the infected cell. Indeed, HCF-1 regulates human cell proliferation and the cell cycle at different steps. In human, HCF-1 is unusual in that it undergoes a process of proteolytic maturation that results from cleavages at six centrally located 26 amino acid repeats called HCF-1pro repeats. This generates a heterodimeric complex of stably associated amino- (HCF-1n) and carboxy- (HCF-1c) terminal subunits. The absence of the HCF-1 N or HCF-1; subunit leads predominantly to either G1 or M phase defects, respectively. We have hypothesized that HCF-1 forms a heterodimeric complex to permit communication between the two subunits of HCF-1 involved in regulating different phases of the cell cycle. Indeed, there is evidence for such inter-subunit communication because a point mutation called P134S in the HCF-1N subunit in the temperature-sensitive hamster cell line tsBN67 causes, addition to G1- phase defects associated with the HCF-1n subunit, M-phase defects similar to the defects seen upon loss of HCF-1 function. Furthermore, inhibition of the proteolytic maturation of HCF-1 by deletion of the six HCF-1pro repeats (HCF-1Aimo) also leads to M-phase defects, specifically cytokinesis defects leading to binucleation, indicating that there is loss of HCF-15 function in the absence of HCF-1 maturation. I demonstrate that individual point mutations in each of the six HCF-1pro repeats that prevent HCF-1 proteolytic maturation also lead to binucleation; however, this defect can be latgely rescued by the presence of just one HCF-1pRO sequence in I-ICF»1. These results argue that processing itself is important for the HCF-1g function. In fact, until now, the hypothesis was that the proteolytic processing per se is more important for HCF-1C function than the proteolytic processing region. But I show that processing per se is not sufticient to rescue multinucleation, but that the HCF-lpm sequence itself is crucial. This discovery leads to the conclusion that the I-ICF-1pRO repeats have an additional function important for HCF-le function. From the studies of others, one potential function of the HCF-lrxo tepeats is as a binding site for O-link NAcetyl glycosamine tansferase (OGT) to glycosylate an HCF-1n-sunbunit region called the Basic region. This new function suggests the Basic region of HCF-1n is also implicated in the communication between the two subunits. This inter-subunit communication was analyzed in more detail with the studies of the Pl34S mutation and the residues 382-450 region of HCF-l that when removed prevents HCF-l subunit association. I demonstrate that the point mutation also leads to a binucleation defect in Hela cells as well as in the tsBN67 cells. In addition, the effect of this mutation on the regulation of HCF-1c activity seems to interfere with that of the HCF-lpgg repeats because the sum of the deletion of the proteolytic processing region and the point mutation surprisingly leads to re-establishment of correct cytokinesis. The study of the 382-450 HCF-lN region also yielded surprising results. This region important for the association of the two subunits is also important for both HCF-1c function in M phase and G1 phase progression. Thus, I have discovered two main functions of this region: its role in the regulation of HCF-lc function in M phase and its involvement in the regulation of G1/S phase ?- an HCF-1n function. These results support the importance of inter-subunit communication in HCF-1 functions. My research illuminates the understanding of the interaction of the two subunits by showing that the whole HCF-1n subunit is involved in the inter-subunit communication in order to regulate HCF-1c function. For this work, I was concentrated on the study of cytokinesis; the first phenotype showing the role of HCF-1c in the M phase. Then, I extended the study of the M phase with analysis of steps earlier to cytokinesis. Because some defects in the chromosome segregation was already described in the absence of HCF-1, I decided to continue the study of M phase by checking effects on the chromosome segregation. I showed that the HCF-1n subunit and HCF-1pro repeats are both important for this key step of M phase. I show that the binucleation phenotype resulting from deletion or mutation in HCF-1pro repeats, Pl34S point mutation or the lack of the region 382-450 are correlated with micronuclei, and chromosome segregation and alignment defects. This suggests that HCF«lç already regulates M phase during an early step and could be involved in the complex regulation of chromosome segregation. Because one of the major roles of HCF-1 is to be a transcription regulator, I also checked the capacity of HCF-1 to bind to the chromatin in my different cell lines. All my recombinant proteins can bind the chromatin, except for, as previously described, the HCF-1 with the P134S point mutation, This suggests that the binding of HCF-1 to the chromatin is not dependant to the Basic and proteolytic regions but more to the Kelch domain. Thus, if the function of HCF-ig in M phase is dependant to its chromatin association, the intercommunication and the proteolytic region are not involved in the ability to bind to the chromatin but more to bind to the right place of the chromatin or to be associated with the co-factors. Résumé : L'étude de l'infection par le virus Herpes Simplex (HSV) a permis la découverte de la protéine HCF-1 (Host-Cell Factor). HCF-1 est une des protéines cellulaires qui font partie du complexe induit par VP16 ; ce complexe est la clef pour l'activation de la phase lytique de HSV. Afin de manipuler les cellules infectées, le complexe induit pas le VPIG devrait donc cibler les protéines importantes pour la régulation cellulaire, telles que la protéine HCF-1. Cette dernière s'avère donc être un senseur pour la cellule et devrait également jouer un rôle de régulation lors des différentes phases du cycle cellulaire. Chez l'humain, HCF-1 a la particularité de devoir passer par une phase de maturation pour devenir active. Lors de cette maturation, la protéine subit une coupure protéolytique au niveau de six répétitions composées de 26 acides aminés, appelé HCF-1pro repeats. Cette coupure engendre la formation d'un complexe formé de deux sous-unités, HCF-1n et HCF-1c, associées l'une à l'autre de façon stable. Enlever la sous-unité HCF-IN ou C entraîne respectivement des défauts dans la phase G1 et M. Nous pensons donc que HCF-1 forme un complexe hétérodimérique afin de permettre la communication entre les molécules impliquées dans la régulation des différentes phases du cycle cellulaire. Cette hypothèse est déduite suite à deux études: l'une réalisée sur la lignée cellulaire tsBN67 et l'autre portant sur l'inhibition de la maturation protéolytique. La lignée cellulaire tsBN67, sensible à la température, porte la mutation Pl 345 dans la sous-unité HCF-1n. Cette mutation, en plus d'occasionner des défauts dans la phase G1 (défauts liés à la sous-unité HCF-1N), a aussi pour conséquence d'entrainer des défauts dans la phase M, défauts similaires à ceux dus a la perte de la sous-unité HCF-1c. Quant à la maturation protéolytique, l'absence de la région de la protéolyse provoque la binucléation, défaut lié à la cytokinèse, indiquant la perte de la fonction de la sous-unité HCF-1c. Au cours de ma thèse, j'ai démontré que des mutations dans les HCF-1=no repeats, qui bloquent la protéolyse, engendrent la binucléation ; cependant ce défaut peut être corrigé pas l'ajout d'un HCF-1pro repeat dans un HCF-1 ne contenant pas la région protéolytique. Ces résultats soutiennent l'idée que la région protéolytique est importante pour le bon fonctionnement de HCF-1c. En réalité jusqu'a maintenant on supposait que le mécanisme de coupure était plus important que la région impliquée pour la régulation de la fonction de HCF-1;. Mais mon étude montre que la protéolyse n'est pas suffisante pour éviter la binucléation ; en effet, les HCF-1pro repeats semblent jouer le rôle essentiel dans le cycle cellulaire. Cette découverte conduit à la conclusion que les HCF-1pro repeats ont sûrement une fonction autre qui serait cruciale pour la foncton de HCF-1c. Une des fonctions possibles est d'être le site de liaison de l'O-linked N-acetylglucosamine transférase (OGT) qui glycosylerait la région Basique de HCF-1n. Cette nouvelle fonction suggère que la région Basique est aussi impliquée dans la communication entre les deux sous- unités. L'intercommunication entre les deux sous-unités ai été d'ailleurs analysée plus en détail dans mon travail à travers l'étude de la mutation Pl34S et de la région 382-450, essentielle pour l'association des deux sous»unités. J'ai ainsi démontré que la mutation P134S entraînait aussi des défauts dans la cytokinése dans la lignée cellulaire Hela, de plus, son influence sur HCF-1c semble interférer avec celle de la région protéolytique. En effet, la superposition de ces deux modifications dans HCF-1 conduit au rétablissement d'une cytokinése correcte. Concernant la région 382 à 450, les résultats ont été assez surprenants, la perte de cette région provoque l'arrêt du cycle en G1 et la binucléation, ce qui tend à prouver son importance pour le bon fonctionnement de HCF-1n et de HCF-1c. Cette découverte appuie par conséquent l'hypotl1èse d'une intercommunicatzion entre les deux sous-unités mettant en jeu les différentes régions de HCF-1n. Grâce à mes recherches, j'ai pu améliorer la compréhension de l'interaction des deux sous-unités de HCF-1 en montrant que toutes les régions de HCF-1n sont engagées dans un processus d'intercommunication, dont le but est de réguler l'action de HCF-1c. J'ai également mis en évidence une nouvelle étape de la maturation de HCF-1 qui représente une phase importante pour l'activation de la fonction de HCF-1c. Afin de mettre à jour cette découverte, je me suis concentrée sur l'étude de l'impact de ces régions au niveau de la cytokinése qui fut le premier phénotype démontrant le rôle de HCF-1c dans la phase M. A ce jour, nous savons que HCF-1c joue un rôle dans la cytokinèse, nous ne connaissons pas encore sa fonction précise. Dans le but de cerner plus précisément cette fonction, j'ai investigué des étapes ultérieures ai la cytokinèse. Des défauts dans la ségrégation des chromosomes avaient déjà été observés, ai donc continué l'étude en prouvant que HCF-1n et les HCF-1pro repeats sont aussi importants pour le bon fonctionnement de cette étape clef également régulée par HCF-1c. J' ai aussi montré que la région 382-450 et la mutation P134S sont associées à un taux élevé de micronoyaux, de défauts dans la ségrégation des chromosomes. L'une des fonctions principales de HCF-1 étant la régulation de la transcription, j'ai aussi contrôlé la capacité de HCF-1 à se lier à la chromatine après insertion de mutations ou délétions dans HCF-1n et dans la région protéolytique. Or, à l'exception des HCF-1 contenant la mutation P134S, la sous-unité HCF-1c des HCF-1 tronquées se lie correctement à la chromatine. Cette constatation suggère que la liaison entre HCF-1c et chromatine n'est pas dépendante de la région Basique ou Protéolytique mais peut-être vraisemblablement de la région Kelch. Donc si le rôle de HCF-1c est dépendant de sa capacité â activer la transcription, l'intercommunication entre les deux sous-unités et la région protéolytique joueraient un rôle important non pas dans son habileté à se lier à la chromatine, mais dans la capacité de HCF-1 à s'associer aux co-facteurs ou à se placer sur les bonnes régions du génome.

Effects of dietary protein type on oxidized cholesterol-induced alteration in age-related modulation of lipid metabolism and indices of immune function in rats.

Exogenous oxidized cholesterol disturbs both lipid metabolism and immune functions. Therefore, it may perturb these modulations with ageing. Effects of the dietary protein type on oxidized cholesterol-induced modulations of age-related changes in lipid metabolism and immune function was examined using differently aged (4 weeks versus 8 months) male Sprague-Dawley rats when casein, soybean protein or milk whey protein isolate (WPI) was the dietary protein source, respectively. The rats were given one of the three proteins in diet containing 0.2% oxidized cholesterols mixture. Soybean protein, as compared with the other two proteins, significantly lowered both the serum thiobarbituric acid reactive substances value and cholesterol, whereas it elevated the ratio of high density lipoprotein-cholesterol/cholesterol in young rats, but not in adult. Moreover, soybean protein, but not casein and WPI, suppressed the elevation of Delta6 desaturation indices of phospholipids in both liver and spleen, particularly in young. On the other hand, WPI, compared to the other two proteins, inhibited the leukotriene B4 production of spleen, irrespective of age. Soybean protein reduced the ratio of CD4(+)/CD8(+) T-cells in splenic lymphocytes. Therefore, the levels of immunoglobulin (Ig)A, IgE and IgG in serum were lowered in rats given soybean protein in both age groups except for IgA in adult, although these observations were not shown in rats given other proteins. Thus, various perturbations of lipid metabolism and immune function caused by oxidized cholesterol were modified depending on the type of dietary protein. The moderation by soybean protein on the change of lipid metabolism seems to be susceptible in young rats whose homeostatic ability is immature. These observations may be exerted through both the promotion of oxidized cholesterol excretion to feces and the change of hormonal release, while WPI may suppress the disturbance of immune function by oxidized cholesterol in both ages. This alleviation may be associated with a large amount of lactoglobulin in WPI. These results thus showed a possibility that oxidized cholesterol-induced perturbations of age-related changes of lipid metabolism and immune function can be moderated by both the selection and combination of dietary protein.

A direct approach to the discounted penalty function

This paper provides a new and accessible approach to establishing certain results concerning the discounted penalty function. The direct approach consists of two steps. In the first step, closed-form expressions are obtained in the special case in which the claim amount distribution is a combination of exponential distributions. A rational function is useful in this context. For the second step, one observes that the family of combinations of exponential distributions is dense. Hence, it suffices to reformulate the results of the first step to obtain general results. The surplus process has downward and upward jumps, modeled by two independent compound Poisson processes. If the distribution of the upward jumps is exponential, a series of new results can be obtained with ease. Subsequently, certain results of Gerber and Shiu [H. U. Gerber and E. S. W. Shiu, North American Actuarial Journal 2(1): 48–78 (1998)] can be reproduced. The two-step approach is also applied when an independent Wiener process is added to the surplus process. Certain results are related to Zhang et al. [Z. Zhang, H. Yang, and S. Li, Journal of Computational and Applied Mathematics 233: 1773–1 784 (2010)], which uses different methods.

Molecular dissection of Arabidopsis thaliana endodermis development, structure and function

In vascular plants, the endodermis establishes a protective diffusion barrier surrounding the vasculature preventing the passive, uncontrolled entry of nutrients absorbed by the plant. It does so by means of a differentiation feature, the "Casparian Strip" (CS), a highly localized cell wall impregnation made of lignin, which seals the extracellular space. Although the existence of this differentiation feature has been intensively described, the mechanisms establishing this hallmark remain obscure. In this work I report, the developmental sequence of events that leads to a differentiated endodermis, in the plant model Arabidopsis thaliana. In addition, my descriptive approach gave important insights as to how these cells define membrane domains involved in the directional transport of nutrients. I also participated in characterizing a new transmembrane protein family, the CASPs, localized to the membrane domain underlying the CS, which we accordingly named the Casparian Strip membrane Domain (CSD). Our molecular analysis indicates that these proteins drive CS establishment. To identify more molecular factors of CS establishment, I performed a forward genetic screen. This screen led to the identification of 11 endodermis permissive mutants, which we named schengen (sgn) mutants. The causative mutations have been mapped to 5 independent loci: SGN1 to SGN5. SGN1 and SGN3 encode Receptor Like Kinases involved in the correct establishment of the CSD. A lack of those kinases leads to an incomplete CSD, which gives rise to interrupted CS barriers. Interestingly, SGN1 seems to also regulate CSD positioning to the middle of endodermal transversal walls. SGN4 encodes an NADPH oxidase involved in lignin polymerization essential for CS formation. The sgn5 mutant induces extra divisions of cortical cells strongly affecting the cell identity, but also leading to incorrect differentiation. A thorough characterization of the sgn2 mutant will follow elsewhere, yet preliminary results indicate that SGN2 encodes an Acyl-CoA N-acyltransferase. . In summary, with my work I have contributed a first set of molecular players of Casparian strip formation and initiated their characterization. Eventually, this might lead to an understanding of the molecular mechanisms of CS establishment in A.thaliana . This in turn will hopefully help to better understand nutrient uptake in higher plants and their response to environmental stresses. - Au sein des plantes vasculaires, l'endoderme représente un tissu protecteur mettant en place une barrière imperméable, empêchant n'importe quel élément de rejoindre les tissus conducteurs par simple diffusion. Cette barrière, appelée « Cadre de Caspary », correspond à une lignification de la paroi de l'endoderme et donne lieu à un cloisonnement de l'espace intercellulaire. Bien que cet élément de différenciation soit décrit en détail, sa mise en place reste incomprise. Cette étude indique la suite d'événements aboutissant à l'établissement du cadre de Caspary chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. De plus, ce travail apporte de nouvelles connaissances expliquant comment ces cellules définissent des domaines membranaires importants pour le transport des nutriments. Nous décrivons une nouvelle famille de protéines membranaires, les CASPs (« CAparian Strip membrane domain Proteins »), localisées dans un domaine membranaire longeant le cadre de Caspary : le domaine de Caspary (CSD). L'analyse moléculaire des CASPs indique qu'elles dirigent la formation du cadre de Caspary. Par ailleurs, une approche génétique directe nous a permis d'identifier 11 mutants ayant un endoderme perméable. Nous avons nommé ces mutants Schengen, en référence à la zone de libre échange européenne. Les mutations impliquées dans ces mutants affectent 5 gènes désignés de SGN1 à SGN5. SGN1 et SGN3 produisent des protéines de type kinases (« Receptor-like Kinases », RLK) qui participent à la délimitation du CSD. L'absence de ces kinases aboutit à un domaine CSD incomplet, se traduisant par un cadre de Caspary discontinu. De plus, SGN1 semble réguler le positionnement du CSD au milieu de la paroi transversale de l'endoderme. SGN4 produit une enzyme de type NADPH oxydase impliquée dans la polymérisation du cadre de Caspary. Dans le mutant sgn5, on observe une division anormale des cellules du cortex créant ainsi une nouvelle couche cellulaire incapable d'achever sa différenciation en endoderme. Quant à la mutation sgn2, bien que nous pensons qu'elle affecte une Acyl-CoA N-acyltransferase, sa caractérisation ne sera réalisée que prochainement. Au final, ce travail procure de nouveaux éléments sur l'établissement du cadre de Caspary qui pourraient être importants afin de comprendre comment les plantes sélectionnent leurs nutriments et résistent à des conditions environnementales parfois hostiles. - De par leur immobilité, les plantes terrestres n'ont pas d'autre choix que de puiser leurs ressources dans leur environnement direct. La plante extrait du sol les nutriments qui lui sont nécessaires et les redistribue grâce à des tissus conducteurs. Afin de ne pas s'intoxiquer, il est donc essentiel de pouvoir sélectionner les éléments entrant dans la racine. Etonnement, ce n'est pas la surface des racines qui permet ce contrôle mais un tissu interne appelé endoderme. Ce dernier forme une barrière imperméable qui entoure chaque cellule et crée une jointure permettant de bloquer le passage des éléments entre les cellules. Cette structure, appelée « cadre de Caspary », oblige les éléments à entrer dans les cellules de l'endoderme et à être ainsi sélectionnés. Bien que cette structure soit décrite en détail, sa mise en place reste incomprise. Cette étude indique la suite d'événements qui aboutit à la formation du cadre de Caspary chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. Ce travail apporte également de nouvelles connaissances expliquant comment ces cellules définissent, organisent et dirigent le transport des nutriments. Nous décrivons comment certains éléments de la cellule, les protéines CASPs (CAsparian Strip membrane domain Proteins), sont organisées un domaine particulier des membranes afin de créer une plateforme de construction longeant le cadre de Caspary : le domaine de Caspary (CSD). Afin de déterminer ce qu'il se passerait si une plante ne possédait pas de cadre de Caspary, nous avons réalisé une mutagénèse, ou approche génétique directe, et identifié 11 mutants (individu ayant un gène défectueux conduisant à la perte d'une fonction) ayant un endoderme perméable. Nous avons nommé ces mutants schengen, en référence à la zone de libre échange européenne. Les mutations impliquées dans ces mutants affectent 5 gènes désignés de SGN1 à SGN5. Les gènes SGN1 et SGN3 produisent des protéines de type kinases (« Receptor-like Kinases », RLK) servant à l'établissement de la plateforme de construction. L'absence de ces kinases aboutit à une base incomplète, se traduisant par un cadre de Caspary discontinu. Qui plus est, la kinase SGN1 semble réguler le positionnement de la plateforme au milieu de l'endoderme. Le gène SGN4 est par contre, impliqué dans la construction à proprement dite du cadre de Caspary. Dans le mutant sgn5, on observe une nouvelle couche de cellules ressemblant à de l'endoderme mais incapable de former correctement une barrière identique au cadre de Caspary. Quant au dernier mutant, sgn2, bien que cette étude fournisse des indices permettant de comprendre pourquoi le mutant sgn2 est défectueux, nous n'expliquerons ce cas que prochainement. En résumé, ce travail procure de nouvelles connaissances sur l'établissement du cadre de Caspary qui pourraient être importantes afin de comprendre comment les plantes sélectionnent leurs nutriments et résistent à des conditions environnementales parfois hostiles.

Combinatorial effects of splice variants modulate function of Aiolos

The transcription factor Aiolos (also known as IKZF3), a member of the Ikaros family of zinc-finger proteins, plays an important role in the control of B lymphocyte differentiation and proliferation. Previously, multiple isoforms of Ikaros family members arising from differential splicing have been described and we now report a number of novel isoforms of Aiolos. It has been demonstrated that full-length Ikaros family isoforms localize to heterochromatin and that they can associate with complexes containing histone deacetylase (HDAC). In this study, for the first time we directly investigate the cellular localization of various Aiolos isoforms, their ability to heterodimerize with Ikaros and associate with HDAC-containing complexes, and the effects on histone modification and binding to putative targets. Our work demonstrates that the cellular activities of Aiolos isoforms are dependent on combinations of various functional domains arising from the differential splicing of mRNA transcripts. These data support the general principle that the function of an individual protein is modulated through alternative splicing, and highlight a number of potential implications for Aiolos in normal and aberrant lymphocyte function.

Analysis of c-Myc function in mouse epidermis

Abstract The c-myc gene is one of the most frequently mutated oncogenes found in human tumors. c-Myc has been implicated in the regulation of various biological processes including cell cycle progression, cellular growth, differentiation, angiogenesis, immortalization and apoptosis. To assess the normal role of c-Myc in epithelial cell types in vitro and in vivo we have deleted the c-myc gene in keratinocytes and in the adult skin epidermis by conditional Cre/loxP mediated recombination. Similar to what we have previously shown in mouse embryonic fibroblasts acute elimination of c-Myc activity in cultured keratinocytes causes cells to cease proliferation and adapt a flat cell morphology. Mutant cells accumulate in a diploid Ki67neg stage, indicative of a quiescent Go stage. This demonstrates that c-Myc activity is essential to maintain keratinocytes in a productive cell cycle. In addition, mutant keratinocytes showed a defect in Ca2+ induced induction of the differentiation marker Keratin 1 suggesting a role for c-Myc during differentiation. To assess the in vivo role of c-Myc we used a tamoxifen inducible K5::CreERT transgene to delete the c-myc gene in the adult skin epidermis. Unexpectedly, despite strong c-Myc expression in the basal compartment it is not required for maintenance of the skin epidermis in the adult mouse. The epidermis appeared normal with respect to both proliferation and differentiation. In addition, no selection against c-Myc deficient epidermal cells occurred over many months, further confirming that c-Myc is dispensable for normal skin homeostasis. Even more surprising, TPA induced hyperproliferation also occurred in a c-Myc independent manner. Treatment of the skin with the mutagen DMBA prior to TPA is a classical way to induce papillomas by selecting for mutations that lead to dominant activation of the oncogene Ha-Ras. Most interestingly tumor formation was severely inhibited suggesting that tumor progression requires endogenous c-Myc. Further studies are required to address whether the role of c-Myc in the activation of telomerase or the Werner protein, or its role to induce angiogenesis is required for skin tumor progression, In conclusion, this work shows that while c-Myc is not required for maintenance or hyperplasia of mouse epidermis, it is essential for skin tumor progression in collaboration with Ras. Résumé Le gène c-myc est un des oncogènes les plus fréquemment mutés dans les tumeurs humaines. c-Myc est impliqué dans la régulation de processus biologiques variés, comme la progression du cycle cellulaire, la croissance cellulaire, la différenciation, l'angiogenèse, l'immortalisation et l'apoptose. Pour caractériser le rôle physiologique de c-Myc dans les cellules de type épithélial in vitro et in vivo, le gène c-myc a été délété dans des kératinocytes primaires et dans l'épiderme de peau de souris adultes par des recombinaisons conditionnelles (système Cre/loxP). De la même façon que dans les fibroblastes d'embryon de souris, l'élimination aiguë de l'activité de c-Myc dans les kératinocytes en culture primaire provoque l'arrêt de la prolifération des cellules et leur applatissement morphologique. Les cellules mutantes restent dans un stade diploïde Ki67neg, indiquant un stade quiescent Go. Cela démontre que l'activité de c-Myc est essentielle pour maintenir les kératinocytes dans le cycle cellulaire. De plus, les kératinocytes mutants montrent une déficience pour le marqueur de différenciation Kératine 1 au cours de la différenciation induite par le calcium, suggérant un rôle de c-Myc dans la différenciation cellulaire. Pour comprendre le rôle de c-Myc in vivo, le transgène K5::CreERT inductible par le tamoxifen a été utilisé pour déléter le gène c-inyc dans l'épiderme de souris adultes. Etonnemment, malgré une forte expression de c-Myc dans le compartiment basal de l'épiderme, ce gène n'est pas nécessaire pour la maintenance de l'épiderme de la peau chez la souris adulte. L'épiderme apparait normal avec une prolifération et une différenciation physiologique des cellules. De plus, il n'y a pas de sélection contre les cellules épidennales c-Myc déficientes après plusieurs mois, ce qui confirme que c-Myc n'est pas nécessaire pour l'homéostasie normale de la peau. Encore plus surprenant, une hyperprolifération est également induite par du TPA chez les souris mutantes, impliquant une voie de prolifération indépendante de c-Myc. Le traitement de la peau par le mutagène DMBA avant le traitement au TPA est une voie classique d'induction de papillomes, par sélection de mutations conduisant à l'activation de l'oncogène Ha-Ras. La formation des tumeurs est fortement inhibée chez les souris mutantes, suggérant que la progression des tumeurs nécessite la présence endogène de c-Myc. De nouvelles études sont nécessaires pour savoir si c-Myc a un rôle dans l'activation de la télomérase ou de la protéine de Werner, ou encore dans l'angiogénèse, qui sont nécessaires pour la progression tumorale. En conclusion, ce travail montre que même si c-Myc n'est pas nécessaire pour la maintenance ou l'hyperplasie de la peau de souris, il est essentiel pour la progression des tumeurs de la peau en collaboration avec Ras.

Congenital ataxia and hemiplegic migraine with cerebral edema associated with a novel gain of function mutation in the calcium channel CACNA1A.

Mutations in the CACNA1A gene, encoding the α1 subunit of the voltage-gated calcium channel Ca(V)2.1 (P/Q-type), have been associated with three neurological phenotypes: familial and sporadic hemiplegic migraine type 1 (FHM1, SHM1), episodic ataxia type 2 (EA2), and spinocerebellar ataxia type 6 (SCA6). We report a child with congenital ataxia, abnormal eye movements and developmental delay who presented severe attacks of hemiplegic migraine triggered by minor head traumas and associated with hemispheric swelling and seizures. Progressive cerebellar atrophy was also observed. Remission of the attacks was obtained with acetazolamide. A de novo 3 bp deletion was found in heterozygosity causing loss of a phenylalanine residue at position 1502, in one of the critical transmembrane domains of the protein contributing to the inner part of the pore. We characterized the electrophysiology of this mutant in a Xenopus oocyte in vitro system and showed that it causes gain of function of the channel. The mutant Ca(V)2.1 activates at lower voltage threshold than the wild type. These findings provide further evidence of this molecular mechanism as causative of FHM1 and expand the phenotypic spectrum of CACNA1A mutations with a child exhibiting severe SHM1 and non-episodic ataxia of congenital onset.

The gamma subunit is a specific component of the Na,K-ATPase and modulates its transport function.

The role of small, hydrophobic peptides that are associated with ion pumps or channels is still poorly understood. By using the Xenopus oocyte as an expression system, we have characterized the structural and functional properties of the gamma peptide which co-purifies with Na,K-ATPase. Immuno-radiolabeling of epitope-tagged gamma subunits in intact oocytes and protease protection assays show that the gamma peptide is a type I membrane protein lacking a signal sequence and exposing the N-terminus to the extracytoplasmic side. Co-expression of the rat or Xenopus gamma subunit with various proteins in the oocyte reveals that it specifically associates only with isozymes of Na,K-ATPase. The gamma peptide does not influence the formation and cell surface expression of functional Na,K-ATPase alpha-beta complexes. On the other hand, the gamma peptide itself needs association with Na,K-ATPase in order to be stably expressed in the oocyte and to be transported efficiently to the plasma membrane. Gamma subunits do not associate with individual alpha or beta subunits but only interact with assembled, transport-competent alpha-beta complexes. Finally, electrophysiological measurements indicate that the gamma peptide modulates the K+ activation of Na,K pumps. These data document for the first time the membrane topology, the specificity of association and a potential functional role for the gamma subunit of Na,K-ATPase.

CD8beta endows CD8 with efficient coreceptor function by coupling T cell receptor/CD3 to raft-associated CD8/p56(lck) complexes.

The extraordinary sensitivity of CD8+ T cells to recognize antigen impinges to a large extent on the coreceptor CD8. While several studies have shown that the CD8beta chain endows CD8 with efficient coreceptor function, the molecular basis for this is enigmatic. Here we report that cell-associated CD8alphabeta, but not CD8alphaalpha or soluble CD8alphabeta, substantially increases the avidity of T cell receptor (TCR)-ligand binding. To elucidate how the cytoplasmic and transmembrane portions of CD8beta endow CD8 with efficient coreceptor function, we examined T1.4 T cell hybridomas transfected with various CD8beta constructs. T1.4 hybridomas recognize a photoreactive Plasmodium berghei circumsporozoite (PbCS) peptide derivative (PbCS (4-azidobezoic acid [ABA])) in the context of H-2K(d), and permit assessment of TCR-ligand binding by TCR photoaffinity labeling. We find that the cytoplasmic portion of CD8beta, mainly due to its palmitoylation, mediates partitioning of CD8 in lipid rafts, where it efficiently associates with p56(lck). In addition, the cytoplasmic portion of CD8beta mediates constitutive association of CD8 with TCR/CD3. The resulting TCR-CD8 adducts exhibit high affinity for major histocompatibility complex (MHC)-peptide. Importantly, because CD8alphabeta partitions in rafts, its interaction with TCR/CD3 promotes raft association of TCR/CD3. Engagement of these TCR/CD3-CD8/lck adducts by multimeric MHC-peptide induces activation of p56(lck) in rafts, which in turn phosphorylates CD3 and initiates T cell activation.

Genetic dissection of c-Myc function during mouse organogenesis

Résumé Le gène c-myc est un des oncogènes les plus fréquemment mutés dans les tumeurs humaines. Même si plus de 70 % des cancers humains montrent une dérégulation de c-Myc, les connaissances sur son rôle physiologique pendant le développement, et dans la souris adulte restent très peu connus. Récemment, notre laboratoire a pu montrer que c-Myc contrôle l'équilibre entre le renouvellement et la différenciation des cellules souches hématopoïetiques (CSH) dans la souris adulte. Ceci est probablement dû à lacapacité de c-Myc de contrôler l'entrée et la sortie des CSH de leur niche de la moelle osseuse, en régulant plusieurs molécules d'adhésion, parmi lesquelles la cadhérine-N (Wilson et al., 2004; Wilson and Trumpp, 2006). Des études utilisant un mutant d'inactivation ont demontré que la protéine c-Myc est essentielle pour le développement au delà du jour embryonnaire E9.5. Les embryons c-Myc déficients sont plus petits que la normale et possèdent de nombreux défauts; en particulier ils ne peuvent établir un système hématopoietique embryonnaire primitif (Trumpp et al., 2001). Nous avons récemment découvert que le développement du placenta dépend de la présence de cMyc. Ceci permet de proposer que certains, sinon tous, les défauts embryonnaires puorraient dériver indirectement d'un défaut nutritionnel causé par la défaillance du placenta. Afin de répondre à cette question de manière génétique, nous avons utilisé l'allele conditionel c-mycflox (Trumpp et al., 2001) en combinaison avec l'allele Sox2-Cre (Hayashi et al., 2002). Celui-ci détermine l'expression de la récombinase Cre spécifiquement dans les cellules de l'épiblaste à partir de E6.5, tandis qu'il n'y a pas, ou seulement très peu, d'activité de la récombinase Cre dans les tissus extraembryonnaires.Alnsi, cette stratégie nous permet de générer des embryons sans c-Myc qui se développent en présence d'un compartment extraembryonnaire ou c-Myc est exprimé normalement (Sox2Cre;c-mycflox2) Ces embryons, Sox2Cre;c-mycflox2 se développent et grandissent normalement tout en formant un système vasculaire normal, mais meurent à E11.5 à cause d'un sévère manque de cellules hématopoïetiques. De façon très intéressante, la seule population qui semble être présente en nombre à peu près normal dans ces embryons est celle des précurseurs et des cellules souches. Les cellules qui forment cette population prolifèrent normalement mais ne peuvent pas former des colonies in vitro, ce qui montre que ces cellules ont perdu leur activité de cellules souches. Cependant, lorsque nous avons analysé ces cellules plus en détail en éxaminant l'expression des molécules d'intégrine nous avons découvert que l'integrine ß est sur-éxprimée à la surface des cellules c-Myc déficientes. Ceci pourrait indiquer un mécanisme par lequel c-Myc régule des molécules d'adhésion sur les cellules du sang. En conséquence, en absence de c-Myc, l'adhésion et la migration des cellules du sang de l'AGM (Aorte-Gonade-Mésonéphros) vers le foie de l'embryon, à travers le système vasculaire, est compromise. En outre, nous avons pu montrer que les hépatocytes du foie, qui constitue le site principal de formation des cellules hématopoïetiques pendant le développement, est sévèrement atteint dans des Sox2Cre;c-mycflox2 embryons. Ceci n'est pas du à un défaut propre aux cellules hépatiques qui ont perdu c-Myc, mais résulte plutôt de l'absence de cellules hématopoietïques qui normalement colonisent le foie à ce stade du développement. Ces résultats représentent la première preuve directe que le développement des hépatoblastes est dépendant de signaux provenant des cellules du sang. Summary The myc gene is one of the most frequently mutated oncogenes in human tumors. It is found to be mis-regulated in over 70% of all human cancers. However, our knowledge about its physiological role in mammalian development and adulthood remains limited. Recent work in our laboratory showed that c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal and differentiation in the adult mouse. This is likely due to the capacity of c-Myc to control entry and exit of HSCs from the bone marrow niche by regulating a number of cell adhesion molecules including N-cadherin (Wilson et al., 2004; Wilson and Trumpp 2006). During development knockout studies showed that c-Myc is required for embryonic development beyond embryonic day (E) 9.5. c-Myc deficient embryos are severely reduced in size and show multiple defects including the failure to establish a primitive hematopoietic system (Trumpp et al., 2001). Importantly, we recentry uncovered that placental development also seems to depend on normal c-Myc function, raising the possibility that some if not all of the embryonic defects observed could be mediated indirectly by a nutrition defect caused by placental failure. To address this possibility genetically, we took advantage of the conditional c-mycflox allele (Trumpp et al., 2001) in combination with the Sox2-Cre allele (Hayashi et al., 2002), in which Cre expression is specifically targeted to all epiblast cells by E6.5, while there is little or no Cre activity inextra-embryonic lineages. Thus, this strategy allows the generation of c-Myc deficient embryos, which develop within a normal c-Myc expressing extra-embryonic compartment (Sox2Cre;c-mycflox2) Such Sox2Cre;c-mycflox2 embryos develop and grow appropriately and form a normal vascular system but die at E11.5 due to a severe lack of blood cells. Interestingly, the only hematopoietic population that seems to be present in almost normal numbers in the embryo is the stem/progenitor cell population. Cells within this populatíon proliferate normal but can not give rise to hematopoietic colonies in vitro showing that functional hematopoietic stem cell (HSC) activity is lost. However, when we analyzed these phenotypic HSCs in more detail and examined integrin expression in mutant stem/progenitor cells, we observed that ß1-integrin is upregulated. This may point to a potential mechanism whereby c-Myc regulates adhesíon molecules on hematopoietic cells and thereby disturbs adhesion and migration from the AGM (aorta-gonads-mesonephros) through the vascular system to the liver. Furthermore, we uncovered that the fetal liver, the main site of hematopoietic expansion at that stage, is severely affected in Sox2Cre;c-mycflox2 embryos and that this is not due to a cell intrinsic defect of c-Myc deficient hepatocytes but rather due to the lack of hematopoietic cells that normally colonize the fetal liver at that stage of development. This provides first direct evidence that hepatoblast development depends on signals derived from blood cells.