Compósitos CNTs/biocerâmico para a estimulação elétrica óssea in situ

The present thesis aims to develop a biocompatible and electroconductor bone graft containing carbon nanotubes (CNTs) that allows the in situ regeneration of bone cells by applying pulsed external electrical stimuli. The CNTs were produced by chemical vapor deposition (CVD) by a semi-continuous method with a yield of ~500 mg/day. The deposition parameters were optimised to obtain high pure CNTs ~99.96% with controlled morphologies, fundamental requisites for the biomedical application under study. The chemical functionalisation of CNTs was also optimised to maximise their processability and biocompatibility. The CNTs were functionalised by the Diels-Alder cycloaddition of 1,3-butadiene. The biological behaviour of the functionalised CNTs was evaluated in vitro with the osteoblastic cells line MG63 and in vivo, by subcutaneous implantation in rats. The materials did not induce an expressed inflammatory response, but the functionalised CNTs showed a superior in vitro and in vivo biocompatibility than the non-functionalised ones. Composites of ceramic matrix, of bioglass (Glass) and hydroxyapatite (HA), reinforced with carbon nanotubes (CNT/Glass/HA) were processed by a wet approach. The incorporation of just 4.4 vol% of CNTs allowed the increase of 10 orders of magnitude of the electrical conductivity of the matrix. In vitro studies with MG63 cells show that the CNT/Glass/HA composites guarantee the adhesion and proliferation of bone cells, and stimulate their phenotype expression, namely the alkaline phosphate (ALP). The interactions between the composite materials and the culture medium (α-MEM), under an applied electrical external field, were studied by scanning vibrating electrode technique. An increase of the culture medium electrical conductivity and the electrical field confinement in the presence of the conductive samples submerged in the medium was demonstrated. The in vitro electrical stimulation of MG63 cells on the conductive composites promotes the increase of the cell metabolic activity and DNA content by 130% and 60%, relatively to the non-stimulated condition, after only 3 days of daily stimulation of 15 μA for 15 min. Moreover, the osteoblastic gene expression for Runx2, osteocalcin (OC) and ALP was enhanced by 80%, 50% and 25%, after 5 days of stimulation. Instead, for dielectric materials, the stimulus delivering was less efficient, giving an equal or lower cellular response than the non-stimulated condition. The proposed electroconductive bone grafts offer exciting possibilities in bone regeneration strategies by delivering in situ electrical stimulus to cells and consequent control of the new bone tissue formation rate. It is expected that conductive smart biomaterials might turn the selective bone electrotherapy of clinical relevance by decreasing the postoperative healing times.

Mitochondrial dysfunction in fatty acid β-oxidation disorders

Mitochondria are central organelles for cell survival with particular relevance in energy production and signalling, being mitochondrial fatty acid β–oxidation (FAO) one of the metabolic pathways harboured in this organelle. FAO disorders (FAOD) are among the most well studied inborn errors of metabolism, mainly due to their impact in health. Nevertheless, some questions remain unsolved, as their prevalence in certain European regions and how pathophysiological determinants combine towards the phenotype. Analysis of data from newborn screening programs from Portugal and Spain allowed the estimation of the birth prevalence of FAOD revealing that this group of disorders presents in Iberia (and particularly in Portugal) one of the highest European birth prevalence, mainly due to the high birth prevalence of medium chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency. These results highlight the impact of this group of genetic disorders in this European region. The characterization of mitochondrial proteome, from patients fibroblasts with FAOD, namely multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency (MADD) and long chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency (LCHADD), provided a global perspective of the mitochondrial proteome plasticity in these disorders and highlights the main molecular pathways involved in their pathogenesis. Severe MADD forms show an overexpression of chaperones, antioxidant enzymes (MnSOD), and apoptotic proteins. An overexpression of glycolytic enzymes, which reflects cellular adaptation to energy deficiency due to FAO blockage, was also observed. When LCHADD fibroblasts were analysed a metabolic switching to glycolysis was also observed with overexpression of apoptotic proteins and modulation of the antioxidant defence system. Severe LCHADD present increased ROS alongside with up regulation of MnSOD while moderate forms have lower ROS and down-regulation of MnSOD. This probably reflects the role of MnSOD in buffering cellular ROS, maintain them at levels that allow cells to avoid damage and start a cellular response towards survival. When ROS levels are very high cells have to overexpress MnSOD for detoxifying proposes. When severe forms of MADD were compared to moderate forms no major differences were noticed, most probably because ROS levels in moderate MADD are high enough to trigger a response similar to that observed in severe forms. Our data highlights, for the first time, the differences in the modulation of antioxidant defence among FAOD spectrum. Overall, the data reveals the main pathways modulated in FAOD and the importance of ROS levels and antioxidant defence system modulation for disease severity. These results highlight the complex interaction between phenotypic determinants in FAOD that include genetic, epigenetic and environmental factors. The development of future better treatment approaches is dependent on the knowledge on how all these determinants interact towards phenotype.!

Characterization of the effects of antiepileptic drugs on bone metabolism: in vitro studies with human osteoblastic and osteoclastic cells

Bone is constantly being molded and shaped by the action of osteoclasts and osteoblasts. A proper equilibrium between both cell types metabolic activities is required to ensure an adequate skeletal tissue structure, and it involves resorption of old bone and formation of new bone tissue. It is reported that treatment with antiepileptic drugs (AEDs) can elicit alterations in skeletal structure, in particular in bone mineral density. Nevertheless, the knowledge regarding the effects of AEDs on bone cells are still scarce. In this context, the aim of this study was to investigate the effects of five different AEDs on human osteoclastic, osteoblastic and co-cultured cells. Osteoclastic cell cultures were established from precursor cells isolated from human peripheral blood and were characterized for tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity, number of TRAP+ multinucleated cells, presence of cells with actin rings and expressing vitronectin and calcitonin receptors and apoptosis rate. Also, the involvement of several signaling pathways on the cellular response was addressed. Osteoblastic cell cultures were obtained from femur heads of patients (25-45 years old) undergoing orthopaedic surgery procedures and were then studied for cellular proliferation/viability, ALP activity, histochemical staining of ALP and apoptosis rate. Also the expression of osteoblast-related genes and the involvement of some osteoblastogenesis-related signalling pathways on cellular response were addressed. For co-cultured cells, osteoblastic cells were firstly seeded and cultured. After that, PBMC were added to the osteoblastic cells and co-cultures were evaluated using the same osteoclast and osteoblast parameters mentioned above for the corresponding isolated cell. Cell-cultures were maintained in the absence (control) or in the presence of different AEDs (carbamazepine, gabapentin, lamotrigine, topiramate and valproic acid). All the tested drugs were able to affect osteoclastic and osteoblastic cells development, although with different profiles on their osteoclastogenic and osteoblastogenic modulation properties. Globally, the tendency was to inhibit the process. Furthermore, the signaling pathways involved in the process also seemed to be differently affected by the AEDs, suggesting that the different drugs may affect osteoclastogenesis and/or osteoblastogenesis through different mechanisms. In conclusion, the present study showed that the different AEDs had the ability to directly and indirectly modulate bone cells differentiation, shedding new light towards a better understanding of how these drugs can affect bone tissue.

Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells.

Clinical responses to anticancer therapies are often restricted to a subset of patients. In some cases, mutated cancer genes are potent biomarkers for responses to targeted agents. Here, to uncover new biomarkers of sensitivity and resistance to cancer therapeutics, we screened a panel of several hundred cancer cell lines--which represent much of the tissue-type and genetic diversity of human cancers--with 130 drugs under clinical and preclinical investigation. In aggregate, we found that mutated cancer genes were associated with cellular response to most currently available cancer drugs. Classic oncogene addiction paradigms were modified by additional tissue-specific or expression biomarkers, and some frequently mutated genes were associated with sensitivity to a broad range of therapeutic agents. Unexpected relationships were revealed, including the marked sensitivity of Ewing's sarcoma cells harbouring the EWS (also known as EWSR1)-FLI1 gene translocation to poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors. By linking drug activity to the functional complexity of cancer genomes, systematic pharmacogenomic profiling in cancer cell lines provides a powerful biomarker discovery platform to guide rational cancer therapeutic strategies.

Caractérisation de la réponse immunitaire cellulaire dirigée contre ARFP et cartographie des épitopes du génotype 3a lors de l’infection au virus de l’hépatite C

L’interféron-α pegylé en combinaison avec la ribavirin est le seul traitement approuvé pour le traitement de l’infection au virus de l’hépatite C (VHC). L’efficacité est de 50-75%, la thérapie est coûteuse et induit beaucoup d’effets secondaires. Il est impératif d’avoir une meilleure compréhension de la pathogenèse du VHC afin de développer des traitements plus efficaces ou un vaccin. À cette fin, notre approche est de caractériser la réponse immunitaire cellulaire induite par ARFP, un antigène nouveau et conservé chez le VHC, et de cartographier les épitopes de la réponse immunitaire cellulaire d’un patient infecté au génotype 3a ayant résolu spontanément. Le génotype 3a, étant prévalant chez les utilisateurs de drogues intraveineuses (IDUs) constitue 60% des nouvelles infections. Peu d’épitopes furent identifiés auparavant pour ce génotype, ce qui rend l’étude de la réponse immunitaire difficile chez cette population. Dans cette étude, pour la réponse immunitaire cellulaire dirigée contre ARFP, nous n’avons pas observé de différence significative entre les patients ayant résolu spontanément comparativement avec ceux ayant développé une infection persistante. Ceci suggère fortement que ARFP ne joue pas un rôle majeur lors de la résolution de l’infection aigue au VHC. Pour la caractérisation de la réponse immunitaire cellulaire chez un des patients infectés au génotype 3a, nous avons identifié et caractérisé 5 épitopes spécifiquement reconnus par des lymphocytes T, CD3+, CD4+ et CD8- : E2504-521, NS31064-1081, NS4b1759-1776, NS5a2074-2091, NS5b2421-2436. Nous avons comparé avec ceux connus pour le génotype 1a. Nous avons identifié 4 nouveaux épitopes. Enfin, l’épitope NS4b1759-1776, identifié auparavant, pourrait s’avérer être un candidat intéressant dans la mise au point d’un vaccin à base de peptides immunogéniques contre le VHC.

Effet de la RNase HI sur l’expression génique et sur le surenroulement de l’ADN chez Escherichia coli

Les R-loops générés durant la transcription sont impliqués dans de nombreuse fonctions incluant la réplication, la recombinaison et l’expression génique tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Plusieurs études ont montré qu’un excès de supertours négatifs et des séquences riches en bases G induisent la formation de R-loops. Jusqu’à maintenant, nos résultats nous ont permis d’établir un lien direct entre les topoisomérases, le niveau de surenroulement et la formation de R-loops. Cependant, le rôle physiologique des R-loops est encore largement inconnu. Dans le premier article, une étude détaillée du double mutant topA rnhA a montré qu’une déplétion de RNase HI induit une réponse cellulaire qui empêche la gyrase d’introduire des supertours. Il s’agit ici, de la plus forte évidence supportant les rôles majeurs de la RNase HI dans la régulation du surenroulement de l’ADN. Nos résultats ont également montré que les R-loops pouvaient inhiber l’expression génique. Cependant, les mécanismes exacts sont encore mal connus. L’accumulation d’ARNs courts au détriment d’ARNs pleine longueur peut être causée soit par des blocages durant l’élongation de la transcription soit par la dégradation des ARNs pleine longueur. Dans le deuxième article, nous montrons que l’hypersurenroulement négatif peut mener à la formation de R-loops non-spécifiques (indépendants de la séquence nucléotidique). La présence de ces derniers, engendre une dégradation massive des ARNs et ultimement à la formation de protéines tronquées. En conclusion, ces études montrent l’évidence d’un lien étroit entre la RNase HI, la formation des R-loops, la topologie de l’ADN et l’expression génique. De plus, elles attestent de la présence d’un nouvel inhibiteur de gyrase ou d’un mécanisme encore inconnu capable de réguler son activité. Cette surprenante découverte est élémentaire sachant que de nombreux antibiotiques ciblent la gyrase. Finalement, ces études pourront servir également de base à des recherches similaires chez les cellules eucaryotes.

TAR DNA-Binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1

TDP-43 est une protéine multifonctionnelle possédant des rôles dans la transcription, l'épissage des pré-ARNm, la stabilité et le transport des ARNm. TDP-43 interagit avec d'autres hnRNP, incluant hnRNP A2, via son extrémité C-terminale. Plusieurs membres de la famille des hnRNP étant impliqués dans la réponse au stress cellulaire, alors nous avons émis l’hypothèse que TDP-43 pouvait y participer aussi. Nos résultats démontrent que TDP-43 et hnRNP A2 sont localisés au niveau des granules de stress, à la suite d’un stress oxydatif, d’un choc thermique, et lors de l’exposition à la thapsigargine. TDP-43 contribue à la fois à l'assemblage et au maintien des granules de stress en réponse au stress oxydatif. TDP-43 régule aussi de façon différentielle les composants clés des granules de stress, notamment TIA-1 et G3BP. L'agrégation contrôlée de TIA-1 est perturbée en l'absence de TDP-43. En outre, TDP-43 régule le niveau d`ARNm de G3BP, un facteur de granule de stress de nucléation. La mutation associée à la sclérose latérale amyotrophique, TDP-43R361S, compromet la formation de granules de stress. Ainsi, la fonction cellulaire de TDP-43 s'étend au-delà de l’épissage; TDP-43 est aussi un composant de la réponse cellulaire au stress central et un acteur actif dans le stockage des ARNs.

Rôle des centrosomes dans la régulation du point de contrôle en G2/M en réponse aux dommages à l'ADN

Les centrosomes sont les centres organisateurs des microtubules et jouent un rôle crucial dans l’organisation du fuseau bipolaire pendant la mitose. Plus récemment, le rôle des centrosomes dans la régulation de l’entrée en mitose a été mis en évidence. Les centrosomes semblent également contribuer à l’activation du point de contrôle en G2/M en réponse aux lésions de l’ADN en servant de point de rencontre pour les régulateurs du cycle cellulaire et les gènes de réponse aux dommages à l’ADN. L’amplification du nombre de centrosomes est une caractéristique des cellules tumorales mais de façon intéressante, elle constitue aussi une réponse des cellules aux dommages à l’ADN. Les mécanismes qui régulent l’homéostasie et la dynamique des centrosomes sont encore mal compris. Pour mieux comprendre le rôle des centrosomes dans la régulation du point de contrôle en G2/M en réponse aux dommages à l’ADN, le recrutement et/ou l’activation au niveau des centrosomes des kinases impliquées dans les voies de signalisation de ce point de contrôle ont été étudiés par immunofluorescence indirecte sur cellules HeLaS3 ou par Western blot sur des fractions enrichies en centrosomes. Nos résultats montrent que les kinases ATM, ATR, CHK1 et CHK2 sont actives dans les centrosomes de cellules en phase G2. En réponse à l’activation du point de contrôle en G2/M, les formes actives de ces kinases diminuent au niveau des centrosomes. Pour identifier de nouveaux acteurs centrosomaux potentiellement impliqués dans la régulation de ce point de contrôle, une analyse comparative des protéomes de centrosomes purifiés a également été réalisée par spectrométrie de masse. Pour étudier plus particulièrement la fonction de CHK2 au niveau des centrosomes, nous avons développer des outils moléculaires qui serviront à déterminer le rôle de la sous population de CHK2 localisée aux centrosomes 1) dans la régulation de l’entrée en mitose au cours d’un cycle normal 2) dans l’activation et la stabilité du point de contrôle en G2/M en réponse aux lésions l’ADN et 3) dans l’homéostasie et la dynamiques des centrosomes en réponse aux dommages à l’ADN. Cette étude permettra de mieux comprendre la fonction des centrosomes dans la réponse cellulaire au stress génotoxiques anti-cancereux et de révéler de nouvelles fonctions potentielles pour la kinase CHK2.

Étude des déterminants moléculaires de la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G et développement d'outils pour l'étude de l'effecteur bêta-arrestine.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de protéines membranaires du génome humain. Ils transmettent les signaux extracellulaires provenant de plusieurs stimuli comme les odeurs, les ions, les hormones et les neurotransmetteurs, à l'intérieur des cellules. En se liant aux RCPGs, ces molécules contribuent à la stabilisation des changements conformationnels activateurs qui se propagent jusqu'au domaine intracellulaire des récepteurs. Ces derniers engagent ensuite un ou plusieurs effecteurs, comme les protéines G hétérotrimériques et les β-arrestines (βarrs), qui activent une cascade d'événements moléculaires menant à la réponse cellulaire.Récemment, la publication de structures cristallines de RCPGs liant des ligands diffusibles a offert une opportunité de raffiner à une résolution atomique les modèles des mécanismes de transduction des signaux. Dans la première partie de cette thèse, nous avons donc exploré les déterminants de la signalisation du récepteur prototypique β2-adrénergique (β2AR), induite par les β-bloqueurs. En ne tenant compte que de leur efficacités sur le β2AR dans les voies de l'adénylate cyclase (AC) et des protéines kinases activées par les facteurs mitogéniques (MAPK), les β-bloqueurs peuvent être classés en 3 groupes distincts (agoniste inverse AC / agoniste MAPK, antagoniste neutre AC / agoniste MAPK et agoniste inverse AC / agoniste inverse MAPK). Afin de déterminer le lien entre leur efficacité et leur mode de liaison, nous avons réalisé des expériences d'arrimages moléculaires in silico entre des β-bloqueurs de chacun des groupes et la structure cristalline du β2AR liée au carazolol. De manière intéressante, les ligands à l'intérieur d'un groupe partagent un mode de liaison, alors que ceux des ligands entre les groupes divergent, suggérant que le mode de liaison des β-bloqueurs pourrait être utilisé pour prédire leur l'efficacité. En accord avec cette hypothèse, nous avons prédit et confirmé l'efficacité agoniste MAPK du carazolol, un inverse agoniste AC du β2AR se liant au récepteur de manière similaire au groupe inverse agoniste AC / agoniste MAPK. De manière intéressante, le groupement aryl des ligands agonistes inverses agonistes AC / agoniste MAPK, le seul groupement chimique variable de ce groupe, est prédite pour lier la région des 3e et 5e hélices transmembranaires (TM3 et TM5). Nous avons donc émis l'hypothèse que cette région pourrait être un déterminant de l'efficacité de ces ligands. En accord avec cette dernière, la mutation de 2 résidus (T118I, S203A) localisés proches du site de liaison des groupements aryls des β-bloqueurs, prévient l'efficacité agoniste inverse de l'ICI-118551 sur la voie de l'AC sans affecter l'efficacité d'un agoniste, indiquant que cette région est importante pour la transmission de l'effet agoniste inverse, du moins sur la voie de l'AC. Les βarrs sont des protéines d'échafaudage qui coordonnent la formation de complexes avec plusieurs dizaines d'effecteurs de signalisation. Originalement identifiées pour leur rôle dans la désensibilisation et l'internalisation des RCPGs, elles sont aussi d'importants effecteurs de la signalisation des RCPGs indépendante des protéines G hétérotrimériques. Cependant, contrairement aux protéines G hétérotrimériques, il n'existe que peu d'outils pour les étudier. Ainsi, la deuxième partie de la thèse est dédiée au développement d'outils pour l'étude des βarrs. À cette fin, nous avons d'abord tenté de transposer une méthode de mesure de l'interaction entre 2 protéines par la technologie de transfert d'énergie de bioluminescence par résonance (BRET) en microscopie et chez des souris transgéniques afin de mesurer de manière subcellulaire et dans un contexte natif l'engagement de la βarr à des RCPGs. Ainsi, nous avons établi les preuves de principe que le BRET peut être utilisé pour localiser l'interaction entre la βarr et le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) sur une cellule au microscope et pour détecter l'interaction entre la βarr et le β2AR sur des tissus de souris transgéniques exprimant ces protéines fusionnées avec des partenaires BRET. Finalement, il n'existe aucun inhibiteur pharmacologique ciblant les βarrs. Ainsi, grâce à la combinaison d'approches de criblage virtuel sur un modèle de la structure des βarrs et d'essais de validation cellulaire, nous avons développé un inhibiteur pharmacologique des βarrs. À l'aide de cet outil, nous avons confirmé l'implication des βarrs dans l'activation des MAPK par le V2R, mais aussi montré un nouveau rôle des βarrs dans le recyclage du β2AR. Les connaissances et outils développés dans cette thèse permettront de mieux comprendre les déterminants moléculaires de la signalisation des RCPGs et entre autres, grâce à des nouvelles approches pour étudier le rôle cellulaire et physiologique des βarrs.

Etude du rôle de la réponse UV sur le contrôle de la réparation par excision de nucléotides (NER) des dommages à l’ADN : rôle des voies MAPK et de l’ADN polymérase eta

La réponse cellulaire aux ultra-violets (UV), ou réponse UV, est une réponse complexe et spécialisée dans l’adaptation et la tolérance des dommages aux UV. Celle-ci est initiée par un grand nombre d’évènements moléculaires et de signalisation nucléaire mais aussi au niveau de la membrane plasmique ou du cytoplasme. L’importance et l’influence exactes de ces évènements sur la réparation par excision de nucléotides (NER) des dommages UV à l’ADN sont encore mal comprises et doivent encore être méthodiquement démontrées. Dans cette thèse, grâce à l’utilisation d’une méthode sensible d’analyse de la réparation NER basée sur la cytométrie en flux, il est montré, dans un premier temps, que l’activité des voies MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinases), qui sont des voies de signalisation de stress UV d’origine cytoplsamique, ne participent pas à l’efficacité de réparation NER des dommages UV dans les cellules humaines. En effet, l’abrogation de la signalisation MAPK, par inhibition pharmacologique, par utilisation de mutants dominant-négatifs ou par inhibition de leur expression endogène, ne révèlent aucun changement de la cinétique de réparation des dommages UV par excision de nucléotides. Cependant, l’utilisation de cette même méthode de réparation, mais cette fois, appliquée pour l’étude de réparation NER en fonction du cycle cellulaire, a permis de mettre en évidence la nécessité fonctionnelle de l’ADN polymérase translésionnelle eta (Pol η) dans la réparation NER des dommages UV, uniquement en phase S. Cette observation fut initialement caractérisée dans les cellules de patients affectés du syndrome variant de xérodermie pigmentaire (XP-V) puis, confirmée ensuite par l’inhibition de l’expression de Pol η endogène ou par la complémentation avec des mutants non-fonctionnels dans les cellules XP-V. Ces résultats indiquent que, contrairement à la réponse UV MAPK cytoplasmique, les évènements nucléaires comme la synthèse translésionnelle, peuvent influencer l’efficacité de réparation NER en phase S. Plus particulièrement, ces données établissent un lien possible entre la réparation NER en phase S et les niveaux de stress réplicatifs, révélé ici par la déficience fonctionnelle Pol η ou ATR. Les observations, présentées dans cette thèse, renforcent un rôle du point de contrôle S aux UV sur l’efficacité de la réparation NER et suggèrent que l’inhibition NER, observée en phase S dans les cellules XP-V, est modulée par le stress réplicatif. Un tel moyen de contrôle pourrait avoir une action plutôt protectrice pendant cette phase critique du cycle cellulaire. Mots clés: UV, translésionnelle, eta, MAPK, NER, CPD, cytométrie, phase-S, tolérance.

Exploration du rôle du fragment LG3 sur les cellules souches mésenchymateuses dans le contexte du rejet vasculaire

La vasculopathie du greffon est une pathologie caractérisée par un rétrécissement progressif et oblitérant des vaisseaux sanguins menant à une ischémie et une perte de fonction du greffon. Le rétrécissement vasculaire est dû à une accumulation de matrice extracellulaire (MEC) et de cellules mononuclées positives pour l’actine musculaire lisse alpha (alphaSMA) dont les cellules souches mésenchymateuses, le tout formant une néointima oblitérante. Cette pathologie est la cause principale de la perte des greffons rénaux et cardiaques à long terme. Le rejet vasculaire aigu est un prédicteur de la vasculopathie du greffon. L’équipe du Dr Hébert a démontré que l’apoptose endothéliale, qui joue un rôle important dans le développement du rejet vasculaire, initie la libération de LG3, un fragment du protéoglycan perlécan. Les taux sanguins et urinaires de LG3 sont augmentés chez les receveurs d’allogreffe rénale avec rejet vasculaire et vasculopathie du greffon. Les résultats obtenus en laboratoire durant ma maîtrise ont permis de mieux caractériser l’impact du LG3 sur un type cellulaire important participant à la formation de néointima : les cellules souches mésenchymateuses. Mes travaux ont démontré que le LG3 induit à la fois la migration horizontale des MSC et la transmigration des MSC. Cette migration est dépendante de la voie de signalisation d’ERK1/2, précédemment identifiée comme voie centrale dans la formation de néointima. De plus, nos résultats démontrent que la kinase Src est activée en amont de l’activation de la voie MAPK. La migration horizontale et la transmigration induites par le LG3 sont aussi dépendantes des intégrines alpha2beta1, ainsi que l’activation de la voie MAPK. Dans un modèle de transplantation murin, nous avons également démontré que l’injection sérique de LG3 recombinant favorise l’accumulation de cellules positives pour alphaSMA dans la néointima. En outre, lorsque le receveur est déficient pour l’intégrine alpha2, mais que le greffon est sauvage, la formation de néointima induite par l’injection de LG3 est diminuée dans le greffon suggérant que les cellules du receveur jouent un rôle important dans la formation de la néointima. Enfin, nous avons démontré que l’injection de LG3 augmente aussi le nombre de cellules positives pour la forme phosphorylée d’ERK1/2 (p-ERK1/2) dans la néointima du greffon et que cette accumulation est dépendante de la présence des intégrines 2 1 chez les cellules du receveur.Lorsque le receveur est sauvage, il y a une augmentation du nombre de cellules positives pour p-ERK1/2. L’investigation de ces mécanismes dans le remodelage vasculaire expose de nouvelles opportunités pour inhiber la réponse cellulaire qui mène au remodelage inadapté lors d’un dommage vasculaire chronique et ainsi prolonger la survie du greffon.

Regulation of gene expression in the dinoflagellate Lingulodinium polyedrum

Les dinoflagellés sont des eucaryotes unicellulaires que l’on retrouve autant en eau douce qu’en milieu marin. Ils sont particulièrement connus pour causer des fleurs d’algues toxiques nommées ‘marée-rouge’, ainsi que pour leur symbiose avec les coraux et pour leur importante contribution à la fixation du carbone dans les océans. Au point de vue moléculaire, ils sont aussi connus pour leur caractéristiques nucléaires uniques, car on retrouve généralement une quantité immense d’ADN dans leurs chromosomes et ceux-ci sont empaquetés et condensés sous une forme cristalline liquide au lieu de nucléosomes. Les gènes encodés par le noyau sont souvent présents en multiples copies et arrangés en tandem et aucun élément de régulation transcriptionnelle, y compris la boite TATA, n’a encore été observé. L’organisation unique de la chromatine des dinoflagellés suggère que différentes stratégies sont nécessaires pour contrôler l’expression des gènes de ces organismes. Dans cette étude, j’ai abordé ce problème en utilisant le dinoflagellé photosynthétique Lingulodinium polyedrum comme modèle. L. polyedrum est d’un intérêt particulier, car il a plusieurs rythmes circadiens (journalier). À ce jour, toutes les études sur l’expression des gènes lors des changements circadiens ont démontrées une régulation à un niveau traductionnel. Pour mes recherches, j’ai utilisé les approches transcriptomique, protéomique et phosphoprotéomique ainsi que des études biochimiques pour donner un aperçu de la mécanique de la régulation des gènes des dinoflagellés, ceci en mettant l’accent sur l’importance de la phosphorylation du système circadien de L. polyedrum. L’absence des protéines histones et des nucléosomes est une particularité des dinoflagellés. En utilisant la technologie RNA-Seq, j’ai trouvé des séquences complètes encodant des histones et des enzymes modifiant les histones. L polyedrum exprime donc des séquences conservées codantes pour les histones, mais le niveau d’expression protéique est plus faible que les limites de détection par immunodétection de type Western. Les données de séquençage RNA-Seq ont également été utilisées pour générer un transcriptome, qui est une liste des gènes exprimés par L. polyedrum. Une recherche par homologie de séquences a d’abord été effectuée pour classifier les transcrits en diverses catégories (Gene Ontology; GO). Cette analyse a révélé une faible abondance des facteurs de transcription et une surprenante prédominance, parmi ceux-ci, des séquences à domaine Cold Shock. Chez L. polyedrum, plusieurs gènes sont répétés en tandem. Un alignement des séquences obtenues par RNA-Seq avec les copies génomiques de gènes organisés en tandem a été réalisé pour examiner la présence de transcrits polycistroniques, une hypothèse formulée pour expliquer le manque d’élément promoteur dans la région intergénique de la séquence de ces gènes. Cette analyse a également démontré une très haute conservation des séquences codantes des gènes organisés en tandem. Le transcriptome a également été utilisé pour aider à l’identification de protéines après leur séquençage par spectrométrie de masse, et une fraction enrichie en phosphoprotéines a été déterminée comme particulièrement bien adapté aux approches d’analyse à haut débit. La comparaison des phosphoprotéomes provenant de deux périodes différentes de la journée a révélée qu’une grande partie des protéines pour lesquelles l’état de phosphorylation varie avec le temps est reliées aux catégories de liaison à l’ARN et de la traduction. Le transcriptome a aussi été utilisé pour définir le spectre des kinases présentes chez L. polyedrum, qui a ensuite été utilisé pour classifier les différents peptides phosphorylés qui sont potentiellement les cibles de ces kinases. Plusieurs peptides identifiés comme étant phosphorylés par la Casein Kinase 2 (CK2), une kinase connue pour être impliquée dans l’horloge circadienne des eucaryotes, proviennent de diverses protéines de liaison à l’ARN. Pour évaluer la possibilité que quelques-unes des multiples protéines à domaine Cold Shock identifiées dans le transcriptome puissent moduler l’expression des gènes de L. polyedrum, tel qu’observé chez plusieurs autres systèmes procaryotiques et eucaryotiques, la réponse des cellules à des températures froides a été examinée. Les températures froides ont permis d’induire rapidement un enkystement, condition dans laquelle ces cellules deviennent métaboliquement inactives afin de résister aux conditions environnementales défavorables. Les changements dans le profil des phosphoprotéines seraient le facteur majeur causant la formation de kystes. Les phosphosites prédits pour être phosphorylés par la CK2 sont la classe la plus fortement réduite dans les kystes, une découverte intéressante, car le rythme de la bioluminescence confirme que l’horloge a été arrêtée dans le kyste.

Immune potential and differentiation of equine induced pluripotent stem cells (eiPSC)

Induced pluripotent stem cells (iPSC) have the capacity to self renew and differentiate into a myriad of cell types making them potential candidates for cell therapy and regenerative medicine. The goal of this thesis was to determine the characteristics of equine iPSC (eiPSC) that can be harnessed for potential use in veterinary regenerative medicine. Trauma to a horse’s limb often leads to the development of a chronic non-healing wound that lacks a keratinocyte cover, vital to healing. Thus, the overall hypothesis of this thesis was that eiPSC might offer a solution for providing wound coverage for such problematic wounds. Prior to considering eiPSC for clinical applications, their immunogenicity must be studied to ensure that the transplanted cells will be accepted and integrate into host tissues. The first objective of this thesis was to determine the immune response to eiPSC. To investigate the immunogenicity of eiPSC, the expression of major histocompatibility complex (MHC) molecules by the selected lines was determined, then the cells were used in an intradermal transplantation model developed for this study. While transplantation of allogeneic, undifferentiated eiPSC elicited a moderate cellular response in experimental horses, it did not cause acute rejection. This strategy enabled the selection of weakly immunogenic eiPSC lines for subsequent differentiation into lineages of therapeutic importance. Equine iPSC offer a potential solution to deficient epithelial coverage by providing a keratinocyte graft with the ability to differentiate into other accessory structures of the epidermis. The second objective of this thesis was to develop a protocol for the differentiation of eiPSC into a keratinocyte lineage. The protocol was shown to be highly efficient at inducing the anticipated phenotype within 30 days. Indeed, the eiPSC derived vi keratinocytes (eiPSC-KC) showed both morphologic and functional characteristics of primary equine keratinocytes (PEK). Moreover, the proliferative capacity of eiPSC-KC was superior while the migratory capacity, measured as the ability to epithelialize in vitro wounds, was comparable to that of PEK, suggesting exciting potential for grafting onto in vivo wound models. In conclusion, equine iPSC-derived keratinocytes exhibit features that are promising to the development of a stem cell-based skin construct with the potential to fully regenerate lost or damaged skin in horses. However, since eiPSC do not fully escape immune surveillance despite low MHC expression, strategies to improve engraftment of iPSC derivatives must be pursued.

Le rôle d’Akt dans la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN induits par les ultraviolets dans les cellules de mélanomes humains

Le mélanome malin est l’un des cancers les plus mortels dont l’incidence continue à augmenter chaque année avec peu de traitement efficace à long terme. Il est causé et initié principalement par l’exposition excessive aux rayons ultraviolets engendrant des photoproduits hautement génotoxiques. Il est bien connu que la cascade de signalisation PI3K/Akt joue un rôle crucial dans la régulation des processus qui sont généralement dérégulés durant le développement tumoral comme la prolifération, le contrôle du cycle cellulaire et l’apoptose. Néanmoins, l’implication de cette voie moléculaire dans la réponse aux dommages à l’ADN est peu caractérisée. Chez les mammifères, trois isoformes de la protéine kinase Akt ont été identifiées: Akt1, Akt2 et Akt3. Bien qu’elles soient très homologues en termes de séquence, plusieurs études ont montré que ces isoformes ont des fonctions biologiques distinctes, et nous suggérons qu’elles puissent contribuer différemment à la régulation de la réponse génotoxique. Les objectifs de ce projet étaient de: (i) évaluer l’activation d’Akt dans les cellules de mélanomes (ii) déterminer l’impact de l’inhibition de cette activité sur la régulation de la réponse cellulaire aux UV (iii) vérifier si la perte d’expression de l’un ou de l’autre des isoformes d’Akt peut réguler la réponse aux UV. Nous avons démontré qu’Akt est transitoirement hyperactivée par phosphorylation suite aux irradiations UV dans les lignées cellulaires de mélanomes. Afin de déterminer l'importance de cette activation dans la réponse cellulaire aux UV, notre approche était de diminuer (i) la phosphorylation d’Akt par l’usage d’inhibiteurs pharmacologiques ou (ii) l’expression de chaque isoforme d’Akt par l’approche des ARN interférents. Nous avons montré que l’inhibition de la phosphorylation d’Akt amène à l’augmentation du taux de l’apoptose induit par les UV d’une manière isoforme spécifique, alors qu’elle n’a aucun effet sur la régulation de la voie de réparation par excision de nucléotides (NER), qui est la seule voie humaine pour éliminer les dommages à l’ADN induits par les UV. En somme, notre étude constitue un nouvel aspect qui permet de mieux comprendre les mécanismes moléculaires du développement de mélanomes malins suites aux irradiations ultraviolettes.

L’immunothérapie orale pour le traitement des allergies alimentaires multiples

La prévalence des allergies alimentaires IgE-médiées aurait triplé au cours de la dernière décennie avec des études Nord-Américaines atteignant les 8% chez les enfants. Quoiqu’il n’y ait à ce jour aucun traitement curatif pour les allergies alimentaires, l’immunothérapie oral (OIT) constitue une nouvelle approche expérimentale prometteuse. Cette dernière consiste en l’administration de doses progressive d’allergènes par voie orale sur une période prolongée dans le but d’instaurer un état de désensibilisation et possiblement une tolérance orale soutenue. Cette approche a été démontrée sécuritaire et permettrait la désensibilisation à haute dose de plus de 80% des participants allergiques aux arachides, lait ou œufs. Dans cette thèse, nous présentons 2 études de phase 1 portant sur des protocoles d’OIT, destinés à optimiser l’efficience du traitement chez les sujets avec allergies alimentaires multiples. Près de 30% des enfants avec allergie alimentaire sont allergiques à plus d’un aliment, une proportion qui augmente à 70% lorsqu’on considère les cas les plus sévères. Ces enfants sont à risque augmenté de réactions accidentelles et souffrent d’un impact plus grand sur leur qualité de vie. Dans la première étude, en créant un mélange individualisé avec un ratio stochiométrique 1:1 entre les protéines des aliments allergiques de l’enfant, nous démontrons qu’il est possible de désensibiliser jusqu’à 5 aliments simultanément avec un profil d’innocuité similaire à une monothérapie. Dans la seconde étude, nous utilisons un traitement à l’omalizumab, un anticorps monoclonal anti-IgE, pour permettre une désensibilisation orale multi-allergénique fortement accélérée. Lorsque comparé à l’approche sans omalizumab, ce protocole s’associe à une nette diminution du temps requis pour atteindre les doses d’entretien, passant d’une médiane de 21 à 4 mois, sans affecter le profil d’innocuité. Alors que ces études fournissent des approches cliniques raisonnables pour désensibiliser la population multi-allergique, plusieurs questions persistent, notamment en ce qui a trait à l’induction de tolérance permanente. Une barrière majeure à cet égard réside dans notre piètre compréhension des mécanismes sous-jacents à l’immunothérapie. Prenant avantage d’échantillons cliniques bien caractérisés provenant des essais cliniques ci-haut mentionnés, nous utilisons les nouvelles technologies de séquençage TCR pour suivre la distribution clonale des lymphocytes T spécifiques aux arachides durant une immunothérapie orale. Nous démontrons que l’OIT s’associe à des changements significatifs dans les fréquences des clones spécifiques, suggérant un processus d’épuisement clonal et de remplacement. Nous démontrons par ailleurs que le test de prolifération lymphocytaire, traditionnellement utilisé pour évaluer la réponse cellulaire allergique, est dominé par une distribution polyclonale hautement non-spécifique. Cette observation a des implications majeures considérant que la plupart de la littérature actuelle sur la réponse T se base sur cette technique. En somme, cette thèse jette les bases pour des programmes de recherche translationnelle pour optimiser et personnaliser les protocoles cliniques actuels et développer de nouvelles avenues d’investigation et de traitement pour améliorer la prise en charge des sujets avec allergies alimentaires.