Phosphorylation du CTD de l'ARN polymérase II et impact de l'histone H2A.Z sur le positionnement des nucléosomes chez S. cerevisiae

La phosphorylation du domaine C-terminal de l’ARN polymérase II permet à ce complexe protéique d’exécuter la transcription des gènes, en plus de coupler à la transcription des événements moléculaires comme la maturation des ARNm. Mes résultats montrent que même si cette phosphorylation suit un patron similaire à l’ensemble des gènes, il existe des exceptions pouvant être dues à des mécanismes alternatifs de phosphorylation du CTD. Le présent ouvrage s’intéresse également au rôle qu’occupe la variante d’histone H2A.Z dans l’organisation de la chromatine. Des études précédentes on montré que le positionnement de certains nucléosomes le long de l’ADN serait influencé par H2A.Z et aurait une influence sur la capacité de transcrire les gènes. Par une approche génomique utilisant les puces à ADN, j’ai cartographié l’impact de la délétion de H2A.Z sur la structure des nucléosomes. Enfin, des résultats intéressants sur la dynamique d’incorporation de H2A.Z à la chromatine ont été obtenus.

Interactions protéiques et relation dynamique entre phosphorylation / sumoylation / ubiquitination des protéines TIF1α, β et PML: détection in vivo par BRET

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation.

Régulation dynamique de l’activité du récepteur des estrogènes beta (ERβ) par la phosphorylation,l’ubiquitination et la sumoylation

Les estrogènes jouent un rôle primordial dans le développement et le fonctionnement des tissus reproducteurs par leurs interactions avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. Ces récepteurs nucléaires agissent comme facteurs de transcription et contrôlent l’expression des gènes de façon hormono-dépendante et indépendante grâce à leurs deux domaines d’activation (AF-1 et AF-2). Une dérégulation de leur activité transcriptionnelle est souvent à l’origine de pathologies telles que le cancer du sein, de l’endomètre et des ovaires. Alors que ERα est utilisé comme facteur pronostic pour l’utilisation d’agents thérapeutiques, l’importance de la valeur clinique de ERβ est encore controversée. Toutefois, des évidences récentes lui associent un pouvoir anti-tumorigénique en démontrant que sa présence favorise l’inhibition de la progression de ces cancers ainsi que l’efficacité des traitements. En combinaisons avec d’autres études, ces observations démontrent que bien que les deux isoformes partagent une certaine similitude d’action, les ERs sont en mesure d’exercer des fonctions distinctes. Ces différences sont fortement attribuables au faible degré d’homologie observé entre certains domaines structuraux des ERs, comme le domaine AF-1, ce qui fait en sorte que les différents sites de modifications post-traductionnelles (MPTs) présents sur les ERs sont très peu conservés entre les isoformes. Or, l’activité transcriptionnelle ligand-dépendante et indépendante des ERs est hautement régulée par les MPTs. Elles sont impliquées à tous les niveaux de l’activation des ERs incluant la liaison et la sensibilité au ligand, la localisation cellulaire, la dimérisation, l’interaction avec l’ADN, le recrutement de corégulateurs transcriptionnels, la stabilité et l’arrêt de la transcription. Ainsi, de par leur dissimilitude, les ERs seront différemment régulés par la signalisation cellulaire. Comme un débalancement de plusieurs voies de signalisation ont été associées à la progression de tumeurs ER-positives ainsi qu’au développement d’une résistance, une meilleure compréhension de l’impact des MPTs sur la régulation spécifique des ERs s’avère essentielle en vue de proposer et/ou développer des traitements adéquats pour les cancers gynécologiques. Les résultats présentés dans cette thèse ont pour objectif de mieux comprendre les rôles des MPTs sur l’activité transcriptionnelle de ERβ qui sont, contrairement à ERα, très peu connus. Nous démontrons une régulation dynamique de ERβ par la phosphorylation, l’ubiquitination et la sumoylation. De plus, toutes les MPTs nouvellement découvertes par mes recherches se situent dans l’AF-1 de ERβ et permettent de mieux comprendre le rôle capital joué par ce domaine dans la régulation de l’activité ligand-dépendante et indépendante du récepteur. Dans la première étude, nous observons qu’en réponse aux MAPK, l’AF-1 de ERβ est phosphorylé au niveau de sérines spécifiques et qu’elles jouent un rôle important dans la régulation de l’activité ligand-indépendante de ERβ par la voie ubiquitine-protéasome. En effet, la phosphorylation de ces sérines régule le cycle d’activation-dégradation de ERβ en modulant son ubiquitination, sa mobilité nucléaire et sa stabilité en favorisant le recrutement de l’ubiquitine ligase E6-AP. De plus, ce mécanisme d’action semble être derrière la régulation différentielle de l’activité de ERα et ERβ observée lors de l’inhibition du protéasome. Dans le second papier, nous démontrons que l’activité et la stabilité de ERβ en présence d’estrogène sont étroitement régulées par la sumoylation phosphorylation-dépendante de l’AF-1, processus hautement favorisé par l’action de la kinase GSK-3. La sumoylation de ERβ par SUMO-1 prévient la dégradation du récepteur en entrant en compétition avec l’ubiquitination au niveau du même site accepteur. De plus, contrairement à ERα, SUMO-1 réprime l’activité de ERβ en altérant son interaction avec l’ADN et l’expression de ses gènes cibles dans les cellules de cancers du sein. Également, ces recherches ont permis d’identifier un motif de sumoylation dépendant de la phosphorylation (pSuM) jusqu’à lors inconnu de la communauté scientifique, offrant ainsi un outil supplémentaire à la prédiction de nouveau substrat de la sumoylation. En plus de permettre une meilleure compréhension du rôle des signaux intracellulaires dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de ERβ, nos résultats soulignent l’importance des MPTs dans l’induction des différences fonctionnelles observées entre ERα et ERβ et apportent des pistes supplémentaires à la compréhension de leurs rôles physiopathologiques respectifs.

Importance de la phosphorylation de la ligase Itch dans la reconnaissance et l'ubiquitylation des protéines à domaine SH3

Itch est une ligase de l’ubiquitine impliquée dans la reconnaissance et la dégradation des protéines par le protéasome. Itch contient trois sites phosphorylés par JNK et il a été démontré que la phosphorylation de ces résidus est nécessaire pour que Itch puisse reconnaître et ubiquityler les protéines c-Jun et JunB. Ces sites de phosphorylation se retrouvent dans le domaine PRD responsable des interactions de Itch avec les protéines à domaine SH3. Si la phosphorylation de Itch par JNK est importante pour réguler son activité avec c-Jun et JunB, on connaît peu de choses sur les interactions de Itch avec les protéines à domaine SH3 ainsi que l’implication de la phosphorylation dans leur régulation. Nous avons donc créé des mutants de Itch par mutagenèse dirigée où les sites de phosphorylation étaient remplacés par des alanines (mutant non phosphorylable) et où l’un des trois sites était remplacé par un acide aspartique (mutant constitutivement phosphorylé). Ces mutants sont utilisés dans des tests d’interaction et d’ubiquitylation, dans le but de déterminer l’impact de la phosphorylation de Itch dans la reconnaissance et l’ubiquitylation des protéines SH3. Nos résultats montrent que, contrairement au modèle proposé, la phosphorylation de Itch n’est pas essentielle à l’interaction de Itch avec l’endophiline, mais la phosphorylation de Itch module l’ubiquitylation ainsi que la dégradation de l’endophiline. La régulation de l’interaction de Itch avec ses substrats est donc différente selon le substrat.

Étude de la variante d’histone H2A.Z et du cycle de phosphorylation de l’ARN polymérase II chez Saccharomyces cerevisiae

La chromatine est plus qu’un système d’empaquetage de l’ADN ; elle est le support de toutes les réactions liées à l’ADN dans le noyau des cellules eucaryotes et participe au contrôle de l’accès de l’ARN polymérase II (ARNPolII) à l’ADN. Responsable de la transcription de tous les ARNm des cellules eucaryotes, l’ARNPolII doit, suivant son recrutement aux promoteurs des gènes, transcrire l’ADN en traversant la matrice chromatinienne. Grâce au domaine C-terminal (CTD) de sa sous-unité Rpb1, elle coordonne la maturation de l’ARNm en cours de synthèse ainsi que les modifications de la chromatine, concomitantes à la transcription. Cette thèse s’intéresse à deux aspects de la transcription : la matrice, avec la localisation de la variante d’histone H2A.Z, et la machinerie de transcription avec le cycle de phosphorylation du CTD de l’ARNPolII. Suivant l’introduction, le chapitre 2 de cette thèse constitue un protocole détaillé et annoté de la technique de ChIP-chip, chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette technique phare dans l’étude in vivo des phénomènes liés à l’ADN a grandement facilité l’étude du rôle de la chromatine dans les phénomènes nucléaires, en permettant de localiser sur le génome les marques et les variantes d’histones. Ce chapitre souligne l’importance de contrôles adéquats, spécifiques à l’étude de la chromatine. Au chapitre 3, grâce à la méthode de ChIP-chip, la variante d’histone H2A.Z est cartographiée au génome de la levure Saccharomyces cerevisiae avec une résolution d’environ 300 paires de bases. Nos résultats montrent que H2A.Z orne un à deux nucléosomes au promoteur de la majorité des gènes. L’enrichissement de H2A.Z est anticorrélé à la transcription et nos résultats suggèrent qu’elle prépare la chromatine pour l’activation des gènes. De plus H2A.Z semble réguler la localisation des nucléosomes. Le chapitre suivant s’intéresse à la transcription sous l’angle de la machinerie de transcription en se focalisant sur le cycle de phosphorylation de l’ARN polymérase II. Le domaine C-terminal de sa plus large sous-unité est formé de répétitions d’un heptapeptide YSPTSPS dont les résidus peuvent être modifiés au cours de la transcription. Cette étude localise les marques de phosphorylation des trois résidus sérine de manière systématique dans des souches mutantes des kinases et phosphatases. Nos travaux confirment le profil universel des marques de phosphorylations aux gènes transcrits. Appuyés par des essais in vitro, ils révèlent l’interaction complexe des enzymes impliqués dans la phosphorylation, et identifient Ssu72 comme la phosphatase de la sérine 7. Cet article appuie également la notion de « variantes » des marques de phosphorylation bien que leur étude spécifique s’avère encore difficile. La discussion fait le point sur les travaux qui ont suivi ces articles, et sur les expériences excitantes en cours dans notre laboratoire.

Étude du rôle de la phosphorylation du complexe Mre11-Rad50-Xrs2 dans le maintien de l'intégrité génomique

L'ADN de chaque cellule est constamment soumis à des stress pouvant compromettre son intégrité. Les bris double-brins sont probablement les dommages les plus nocifs pour la cellule et peuvent être des sources de réarrangements chromosomiques majeurs et mener au cancer s’ils sont mal réparés. La recombinaison homologue et la jonction d’extrémités non-homologues (JENH) sont deux voies fondamentalement différentes utilisées pour réparer ce type de dommage. Or, les mécanismes régulant le choix entre ces deux voies pour la réparation des bris double-brins demeurent nébuleux. Le complexe Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX) est le premier acteur à être recruté à ce type de bris où il contribue à la réparation par recombinaison homologue ou JENH. À l’intersection de ces deux voies, il est donc idéalement placé pour orienter le choix de réparation. Ce mémoire met en lumière deux systèmes distincts de phosphorylation du complexe MRX régulant spécifiquement le JENH. L’un dépend de la progression du cycle cellulaire et inhibe le JENH, tandis que l’autre requiert la présence de dommages à l’ADN et est nécessaire au JENH. Ensembles, nos résultats suggèrent que le complexe MRX intègre différents phospho-stimuli pour réguler le choix de la voie de réparation.

Régulation de la kinase Ste20 Slik de Drosophila par phosphorylation de la boucle d'activation

Les kinases constituent une famille majeure de protéines qui régulent divers processus par la phosphorylation de leurs substrats, mais aussi par leur activité non- catalytique. Ce rôle indépendant de l’activité kinase a été observé chez quelques protéines dont des membres de la famille Sterile-20. La kinase Ste20 Slik de Drosophila aide au maintien de l’intégrité des tissus épithéliaux en phosphorylant l’ERM Moesin et peut aussi induire une prolifération cellulaire non-autonome indépendamment de son activité catalytique. La méthode de régulation de ces deux rôles était jusqu’ici inconnue. Nous avons identifié 19 sites de phosphorylation chez Slik par spectrométrie de masse. À l’aide de mutants, nous démontrons que les deux fonctions de Slik sont régulées par la phosphorylation d’au moins 2 résidus conservés de son segment d’activation par un mécanisme d’auto- et/ou trans-phosphorylation. Cette étude amène une meilleure compréhension de la régulation de l’intégrité épithéliale et de la croissance, deux processus clés qui sont souvent déréglés dans le cancer et certaines maladies génétiques.

Phosphorylation et régulation de l’E3 ubiquitine ligase MDM2 par la protéine kinase RSK dans les mélanomes

La voie de signalisation Ras/MAPK (Ras/mitogen-activated protein kinase) régule une variété de protéines intracellulaires qui jouent un rôle important dans la croissance et la prolifération cellulaire. La régulation inappropriée de cette voie de signalisation conduit au développement de nombreux cancers comme le mélanome, qui est caractérisé par des mutations activatrices au niveau des gènes NRAS et BRAF. La protéine kinase RSK (p90 ribosomal S6 kinase) est un composant central de la voie Ras/MAPK, mais son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire n’est pas bien compris. RSK a été montrée pour participer à la résistance des mélanomes aux chimiothérapies, mais le mécanisme moléculaire reste encore à élucider. Nous montrons à l’aide d’un anticorps phospho-spécifique que MDM2 est phosphorylée en réponse à des agonistes et des mutations oncogéniques activant spécifiquement la voie Ras/MAPK. En utilisant des méthodes in vitro et in vivo, nous avons constaté que RSK phosphoryle directement MDM2 sur les Sérines 166 et 186, ce qui suggère que MDM2 est un substrat de RSK. La mutagénèse dirigée envers ces sites nous indique que ces résidus régulent l’ubiquitination de MDM2, suggérant que RSK régule la stabilité de MDM2 et de p53. De plus, nous avons observé que l’inhibition de RSK conduit à une augmentation du niveau protéique de p53 après un dommage à l’ADN dans les cellules de mélanomes. En conclusion, nos travaux suggèrent un rôle important de la protéine kinase RSK dans la régulation de MDM2 et de sa cible, p53. L’étude de ces mécanismes moléculaires aidera à mieux définir le rôle de RSK dans la croissance tumorale, mais également dans la résistance aux agents chimiothérapeutiques.

Mass spectroscopic characterization of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleoprotein and elucidation of the role of phosphorylation in RNA binding by using surface plasmon resonance

Phosphorylation of the coronavirus nucleoprotein (N protein) has been predicted to play a role in RNA binding. To investigate this hypothesis, we examined the kinetics of RNA binding between nonphosphorylated and phosphorylated infectious bronchitis virus N protein with nonviral and viral RNA by surface plasmon resonance (Biacore). Mass spectroscopic analysis of N protein identified phosphorylation sites that were proximal to RNA binding domains. Kinetic analysis, by surface plasmon resonance, indicated that nonphospborylated N protein bound with the same affinity to viral RNA as phosphorylated N protein. However, phosphorylated N protein bound to viral RNA with a higher binding affinity than nonviral RNA, suggesting that phosphorylation of N protein determined the recognition of virus RNA. The data also indicated that a known N protein binding site (involved in transcriptional regulation) consisting of a conserved core sequence present near the 5' end of the genome (in the leader sequence) functioned by promoting high association rates of N protein binding. Further analysis of the leader sequence indicated that the core element was not the only binding site for N protein and that other regions functioned to promote high-affinity binding.

Heat shock protein 27 is the major differentially phosphorylated protein involved in renal epithelial cellular stress response and controls focal adhesion organization and apoptosis

We used two-dimensional difference gel electrophoresis to determine early changes in the stress-response pathways that precede focal adhesion disorganization linked to the onset of apoptosis of renal epithelial cells. Treatment of LLC-PK1 cells with the model nephrotoxicant 1,2-(dichlorovinyl)-L-cysteine (DCVC) resulted in a >1.5-fold up- and down-regulation of 14 and 9 proteins, respectively, preceding the onset of apoptosis. Proteins included those involved in metabolism, i.e. aconitase and pyruvate dehydrogenase, and those related to stress responses and cytoskeletal reorganization, i.e. cofilin, Hsp27, and alpha-b-crystallin. The most prominent changes were found for Hsp27, which was related to a pI shift in association with an altered phosphorylation status of serine residue 82. Although both p38 and JNK were activated by DCVC, only inhibition of p38 with SB203580 reduced Hsp27 phosphorylation, which was associated with accelerated reorganization of focal adhesions, cell detachment, and apoptosis. In contrast, inhibition of JNK with SP600125 maintained cell adhesion as well as protection against apoptosis. Active JNK co-localized at focal adhesions after DCVC treatment in a FAK-dependent manner. Inhibition of active JNK localization at focal adhesions did not prevent DCVC-induced phosphorylation of Hsp27. Overexpression of a phosphorylation-defective mutant Hsp27 acted as a dominant negative and accelerated the DCVC-induced changes in the focal adhesions as well as the onset of apoptosis. Our data fit a model whereby early p38 activation results in a rapid phosphorylation of Hsp27, a requirement for proper maintenance of cell adhesion, thus suppressing renal epithelial cell apoptosis.

Study of tyrosine kinases and protein tyrosine phosphorylation

In recent years, our increased understanding of the complex signal transduction mechanisms that regulate cellular function has fueled huge advances in all aspects of biomedical science and cell biology. Platelet and megakaryocyte function is no exception to this. In the last 10 yr our understanding of the receptor biochemistry and the systems that they control has been pivotal in the development of new strategies to inhibit platelet function and thereby prevent thrombosis. Experimental techniques have become more and more elegant, however; the basic toolbox that a researcher requires to study signaling in platelets and megakaryoctes is described in this and several subsequent chapters.

Bone morphogenetic protein (BMP) ligands and receptors in bovine ovarian follicle cells: actions of BMP-4,-6 and-7 on granulosa cells and differential modulation of Smad-1 phosphorylation by follistatin

Given the paucity of information on the potential roles of bone morphogenetic proteins (BMPs) in the ruminant ovary we conducted immunolocalization and functional studies on cells isolated from bovine antral follicles. Immunocytochemistry revealed expression of BMP-4 and -7 in isolated theca cells whereas granulosa cells and oocytes selectively expressed RMP-6. All three cell types expressed a range of BMP-responsive type-I (BMPRIB, ActRI) and type-II (BMPRII, ActRII, ActRIIB) receptors supporting autocrine/paracrine roles within the follicle. This was reinforced by functional experiments on granulosa cells which showed that BMP-4, -6 and -7 promoted cellular accumulation of phosphorylated Smad-1 but not Smad-2 and enhanced 'basal' and IGF-stimulated secretion of oestradiol (E2), inhibin-A, activin-A and follistatin (FS). Concomitantly, each BMP suppressed 'basal' and IGF-stimulated progesterone secretion, consistent with an action to prevent or delay atresia and/or luteinization. BMPs also increased viable cell number under 'basal' (BMP-4 and -7) and IGF-stimulated (BMP-4, -6 and -7) conditions. Since FS, a product of bovine granulosa cells, has been shown to bind several BMPs, we used the Biacore technique to compare its binding affinities for activin-A (prototype FS ligand) and BMP-4, -6 and -7. Compared with activin-A (K-d 0.28 +/- 0.02 nM; 100%), the relative affinities of FS for BMP-4, -6 and -7 were 10, 5 and 1% respectively. Moreover, studies on granulosa cells showed that preincubation of ligand with excess FS abolished activin-A-induced phosphorylation of Smad-2 and BMP-4-induced phosphorylation of Smad-1. However, FS only partially reversed BMP-6-induced Smad-1 phosphorylation and had no inhibitory effect on BMP-7-induced Smad-1 phosphorylation. These findings support functional roles for BMP-4, -6 and -7 as paracrine/autocrine modulators of granulosa cell steroidogenesis, peptide secretion and proliferation in bovine antral follicles. The finding that FS can differentially modulate BMP-induced receptor activation and that this correlates with the relative binding affinity of FS for each BMP type implicates FS as a potential modulator of BMP action in the ovary.

Regulation of SHP-1 tyrosine phosphatase in human platelets by serine phosphorylation at its C terminus

SHP-1 is a Src homology 2 (SH2) domain-containing tyrosine phosphatase that plays an essential role in negative regulation of immune cell activity. We describe here a new model for regulation of SHP-1 involving phosphorylation of its C-terminal Ser(591) by associated protein kinase Calpha. In human platelets, SHP-1 was found to constitutively associate with its substrate Vav1 and, through its SH2 domains, with protein kinase Calpha. Upon activation of either PAR1 or PAR4 thrombin receptors, the association between the three proteins was retained, and Vav1 became phosphorylated on tyrosine and SHP-1 became phosphorylated on Ser(591). Phosphorylation of SHP-1 was mediated by protein kinase C and negatively regulated the activity of SHP-1 as demonstrated by a decrease in the in vitro ability of SHP-1 to dephosphorylate Vav1 on tyrosine. Protein kinase Calpha therefore critically and negatively regulates SHP-1 function, forming part of a mechanism to retain SHP-1 in a basal active state through interaction with its SH2 domains, and phosphorylating its C-terminal Ser(591) upon cellular activation leading to inhibition of SHP-1 activity and an increase in the tyrosine phosphorylation status of its substrates.

Heat shock protein 27 is the major differentially phosphorylated protein involved in renal epithelial cellular stress response and controls focal adhesion organization and apoptosis

We used two-dimensional difference gel electrophoresis to determine early changes in the stress-response pathways that precede focal adhesion disorganization linked to the onset of apoptosis of renal epithelial cells. Treatment of LLC-PK1 cells with the model nephrotoxicant 1,2-(dichlorovinyl)-L-cysteine ( DCVC) resulted in a > 1.5-fold up- and down-regulation of 14 and 9 proteins, respectively, preceding the onset of apoptosis. Proteins included those involved in metabolism, i.e. aconitase and pyruvate dehydrogenase, and those related to stress responses and cytoskeletal reorganization, i.e. cofilin, Hsp27, and alpha-b-crystallin. The most prominent changes were found for Hsp27, which was related to a pI shift in association with an altered phosphorylation status of serine residue 82. Although both p38 and JNK were activated by DCVC, only inhibition of p38 with SB203580 reduced Hsp27 phosphorylation, which was associated with accelerated reorganization of focal adhesions, cell detachment, and apoptosis. In contrast, inhibition of JNK with SP600125 maintained cell adhesion as well as protection against apoptosis. Active JNK co-localized at focal adhesions after DCVC treatment in a FAK-dependent manner. Inhibition of active JNK localization at focal adhesions did not prevent DCVC-induced phosphorylation of Hsp27. Overexpression of a phosphorylation-defective mutant Hsp27 acted as a dominant negative and accelerated the DCVC-induced changes in the focal adhesions as well as the onset of apoptosis. Our data fit a model whereby early p38 activation results in a rapid phosphorylation of Hsp27, a requirement for proper maintenance of cell adhesion, thus suppressing renal epithelial cell apoptosis.

Inhibition of p38/CREB phosphorylation and COX-2 expression by olive oil polyphenols underlies their anti-proliferative effects

We investigated the anti-proliferative effects of an olive oil polyphenolic extract on human colon adenocarcinoma cells. Analysis indicated that the extract contained hydroxytyrosol, tyrosol and the various secoiridoid derivatives, including oleuropein. This extract exerted a strong inhibitory effect on cancer cell proliferation, which was linked to the induction of a G2/M phase cell cycle block. Following treatment with the extract (50 mu g/ml) the number of cells in the G2/M phase increased to 51.82 +/- 2.69% relative to control cells (15.1 +/- 2.5%). This G2/M block was mediated by the ability of olive oil polyphenols (50 mu g/ml) to exert rapid inhibition of p38 (38.7 +/- 4.7%) and CREB (28.6 +/- 5.5%) phosphorylation which led to a downstream reduction in COX-2 expression (56.9 +/- 9.3%). Our data suggest that olive oil polyphenols may exert chemo preventative effects in the large intestine by interacting with signalling pathways responsible for colorectal cancer development. (c) 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.