VirB6 is required for stabilization of VirB5 and VirB3 and formation of VirB7 homodimers in Agrobacterium tumefaciens.

VirB6 from Agrobacterium tumefaciens is an essential component of the type IV secretion machinery for T pilus formation and genetic transformation of plants. Due to its predicted topology as a polytopic inner membrane protein, it was proposed to form the transport pore for cell-to-cell transfer of genetic material and proteinaceous virulence factors. Here, we show that the absence of VirB6 leads to reduced cellular levels of VirB5 and VirB3, which were proposed to assist T pilus formation as minor component(s) or assembly factor(s), respectively. Overexpression of virB6 in trans restored levels of cell-bound and T pilus-associated VirB5 to wild type but did not restore VirB3 levels. Thus, VirB6 has a stabilizing effect on VirB5 accumulation, thereby regulating T pilus assembly. In the absence of VirB6, cell-bound VirB7 monomers and VirB7-VirB9 heterodimers were reduced and VirB7 homodimer formation was abolished. This effect could not be restored by expression of VirB6 in trans. Expression of TraD, a component of the transfer machinery of the IncN plasmid pKM101, with significant sequence similarity to VirB6, restored neither protein levels nor bacterial virulence but partly permitted T pilus formation in a virB6 deletion strain. VirB6 may therefore regulate T pilus formation by direct interaction with VirB5, and wild-type levels of VirB3 and VirB7 homodimers are not required.

Zur Verbesserung der Wandbekleidung mit wildem Wein (Vitis quinquefolia)

Von Rudolph Riedel

Tractatus de vitis cultura : arteque parandi vinum, crematum, spiritum vini, acetum simplex et compositum

auctoribus Chaptal, Rozier, Parmentier et Dussieux ex gallico latine redditus jussu et impensa ... Josephi e Com. Erdődy de Monyorokerék ... Opera Josephi Voltiggi. Revidit opus adjectisque notis illustravit Ludovicus Mitterpacher ... Cum tabulis aeneis incisis

Analysis of VirB4, a membrane-associated ATPase subunit essential for T -complex transport in Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens is a plant pathogen with the unique ability to export oncogenic DNA-protein complexes (T-complexes) to susceptible plant cells and cause crown gall tumors. Delivery of the T-complexes across the bacterial membranes requires eleven VirB proteins and VirD4, which are postulated to form a transmembrane transporter. This thesis examines the subcellular localization and oligomeric structure of the 87-kDa VirB4 protein, which is one of three essential ATPases proposed to energize T-complex transport and/or assembly. Results of subcellular localization studies showed that VirB4 is tightly associated with the cytoplasmic membrane, suggesting that it is a membrane-spanning protein. The membrane topology of VirB4 was determined by using a nested deletion strategy to generate random fusions between virB4 and the periplasmically-active alkaline phosphatase, $\sp\prime phoA$. Analysis of PhoA and complementary $\beta$-galactosidase reporter fusions identified two putative periplasmically-exposed regions in VirB4. A periplasmic exposure of one of these regions was further confirmed by protease susceptibility assays using A. tumefaciens spheroplasts. To gain insight into the structure of the transporter, the topological configurations of other VirB proteins were also examined. Results from hydropathy analyses, subcellular localization, protease susceptibility, and PhoA reporter fusion studies support a model that all of the VirB proteins localize at one or both of the bacterial membranes. Immunoprecipitation and Co$\sp{2+}$ affinity chromatography studies demonstrated that native VirB4 (87-kDa) and a functional N-terminally tagged HIS-VirB4 derivative (89-kDa) interact and that the interaction is independent of other VirB proteins. A $\lambda$ cI repressor fusion assay supplied further evidence for VirB4 dimer formation. A VirB4 dimerization domain was localized to the N-terminal third of the protein, as judged by: (i) transdominance of an allele that codes for this region of VirB4; (ii) co-retention of a His-tagged N-terminal truncation derivative and native VirB4 on Co$\sp{2+}$ affinity columns; and (iii) dimer formation of the N-terminal third of VirB4 fused to the cI repressor protein. Taken together, these findings are consistent with a model that VirB4 is topologically configured as an integral cytoplasmic membrane protein with two periplasmic domains and that VirB4 assembles as homodimers via an N-terminal dimerization domain. Dimer formation is postulated to be essential for stabilization of VirB4 monomers during T-complex transporter assembly. ^

Analysis of Agrobacterium tumefaciens VirB6 and VirB9 of the VirB /D4 type IV secretion system

Agrobacterium tumefaciens uses the VirB/D4 type IV secretion system (T4SS) to translocate oncogenic DNA (T-DNA) and protein substrates to plant cells. Independent of VirD4, the eleven VirB proteins are also essential for elaboration of a conjugative pilus termed the T pilus. The focus of this thesis is the characterization and analysis of two VirB proteins, VirB6 and VirB9, with respect to substrate translocation and T pilus biogenesis. Observed stabilizing effects of VirB6 on other VirB subunits and results of protein-protein interaction studies suggest that VirB6 mediates assembly of the secretion machine and T pilus through interactions with VirB7 and VirB9. Topology studies support a model for VirB6 as a polytopic membrane protein with a periplasmic N terminus, a large internal periplasmic loop, five transmembrane segments, and a cytoplasmic C terminus. Topology studies and Transfer DNA immunoprecipitation (TrIP) assays identified several important VirB6 functional domains: (i) the large internal periplasmic loop mediates interaction of VirB6 with the T-DNA, (ii) the membrane spanning region carboxyl-terminal to the large periplasmic loop mediates substrate transfer from VirB6 to VirB8, and (iii) the terminal regions of VirB6 are required for substrate transfer to VirB2 and VirB9. To analyze structure-function relationships of VirB9, the phenotypic consequences of dipeptide insertion mutations were characterized. Substrate discriminating mutations were shown to selectively export the oncogenic T-DNA and VirE2 to plant cells or a mobilizable IncQ plasmid to bacterial cells. Mutations affecting VirB9 interactions with VirB7 and VirB10 were localized to the C- and N- terminal regions respectively. Additionally, “uncoupling” mutations identified in VirB11 and VirB6 that block T pilus assembly, but not substrate transfer to recipient cells, were also identified in VirB9. These results in conjunction with computer analysis establish that VirB9, like VirB6, is also composed of distinct regions or domains that contribute in various ways to secretion channel activity and T pilus assembly. Lastly, in vivo immunofluorescent studies suggest that VirB9 localizes to the outer membrane and may play a role similar to that of secretion/ushers of types II and III secretion systems to facilitate substrate translocation across this final bacterial barrier. ^

Nitrógeno prontamente asimilable : efecto sobre la velocidad de fermentación del jugo de uva (Vitis vinifera L.)

El propósito de este trabajo fue evaluar la incidencia de la concentración de nitrógeno prontamente asimilable (NPA) sobre la velocidad y duración de la fermentación alcohólica de los mostos de uva. El experimento se diseñó con tres tratamientos (A=testigo; B=agregado de PO4H(NH4)2 50 mg/L; C=agregado de PO4H(NH4)2 100 mg/L) y cuatro repeticiones. Se realizaron microvinificaciones con jugo de uva pasteurizado var. Chardonnay, inoculado con Saccharomyces cerevisiae cepa FCA 32. La fermentación se condujo a 25 °C. La concentración de NPA fue medida por titulación en medio formol. La velocidad de fermentación fue determinada por pérdida de peso. La velocidad máxima de fermentación se alcanzó al tercer día. Existen diferencias significativas entre la velocidad máxima alcanzada por el testigo y por los tratamientos B y C pero no hay diferencias significativas entre las velocidades máximas alcanzadas por los tratamientos B y C. La velocidad máxima de fermentación alcanzada por el tratamiento B (agregado de 50 mg/L de PO4H(NH4)2) fue 57 % superior respecto del testigo, mientras que el tratamiento C (agregado de 100 mg/L de PO4H(NH4)2) fue 53 % superior respecto del mismo testigo La velocidad máxima de fermentación aumentó con la adición de nitrógeno, pero no se observan diferencias entre las distintas dosis empleadas. La duración media de la fermentación resulta significativamente diferente para los tres tratamientos: 9.25 días para el testigo, 7.5 días para el tratamiento B y 6.25 días para el tratamiento C. El agregado de PO4H(NH4)2 disminuye la duración de la fermentación en las condiciones de trabajo. La duración de la fermentación del tratamiento B (agregado de 50 mg/L de PO4H(NH4)2) fue del 81 % respecto del testigo 100 %, mientras que el tratamiento C (agregado de 100 mg/L de PO4H(NH4)2) fue del 67 %, respecto del mismo testigo.

Caracterización molecular de variedades de vid ( Vitis vinifera L.) de calidad enológica por marcadores microsatelitales

Siete variedades de vid empleadas en Argentina para la elaboración de vinos de alta gama fueron caracterizadas molecularmente a través del empleo de microsatélites. Seis de los 8 pares de cebadores usados amplificaron patrones de bandas reproducibles. El número de alelos detectados por locus varió entre 5 y 10, con un total de 42 alelos, registrándose desde 1 a 7 alelos únicos. El número de genotipos microsatélites encontrados para cada locus osciló entre 3 y 7, con un total de 28. Las variedades Tempranillo y Chenin mostraron 6 y 5 genotipos «únicos», respectivamente, con los 6 loci analizados. La heterocigosidad observada varió entre 42,9 y 100 %, mientras que la heterocigosidad esperada osciló entre 64,3 y 87,8 %. El locus más informativo fue VrZAG79 (con un contenido de información polimórfica de 84,9 % y un número de alelos efectivos de 8,17) mientras que el menos informativo fue VrZAG62. La probabilidad acumulada de obtener genotipos idénticos fue de 7,68 x 10-05 indicando que, mediante el uso combinado de estos 6 cebadores microsatélites se pueden discriminar todas las variedades ensayadas, con alto grado de certeza. El análisis de agrupamiento por el método UPGMA separó claramente las variedades francesas (Merlot, Pinot Noir y Cabernet Sauvignon) y Syrah de los cepajes Tempranillo y Bonarda. Esta técnica podría ofrecerse como servicio a viveristas y productores vitícolas interesados en garantizar la identidad genética de sus materiales comercializados.

Raleo de racimos en Vitis Vinifera Cv. Malbec : efecto sobre los componentes del rendimiento y la composición polifenólica de las bayas

En Mendoza es cada vez más común ralear racimos con el propósito de afectar la composición de las uvas. No obstante, el conocimiento local sobre cómo lograr un equilibrio adecuado de los distintos atributos de calidad mediante el raleo es escaso. El objetivo de esta investigación fue evaluar la relación entre el raleo de racimos en diferentes intensidades y épocas, y los componentes del rendimiento y la composición fenólica de la uva. Para este estudio, que se realizó en un viñedo de Agrelo, Luján de Cuyo, Mendoza (Argentina), se eligió la cultivar Malbec por ser el cepaje emblemático de Argentina y el típico de la Denominación de Origen Controlado (DOC) Luján de Cuyo. En las plantas de dicha cultivar, conducidas en espaldero alto y podadas en cordón Royat bilateral, el raleo fue manual, en tres momentos del ciclo: 1) cuando los granos tenían el tamaño de una arveja; 2) en envero y 3) a 21 °Brix. La intensidad de raleo fue de 25 y 50 % de los racimos. Se comprobó la hipótesis planteada en relación con que el raleo aumenta el tamaño de la baya y mejora la calidad de la uva, por cuanto incrementa la biosíntesis de los polifenoles. En los componentes del rendimiento aumenta el peso del racimo y el tamaño de la baya cuando el raleo se hace temprano y con una intensidad elevada. En cuanto a la influencia en la biosíntesis de los polifenoles se demuestra que el raleo temprano e intenso mejora la concentración de antocianas, catequinas y proantocianidinas. La concentración azucarina se vio incrementada cuando el raleo se hizo en envero y fue intenso.

Evaluación de diferentes alternativas de control de rendimiento en Vitis vinifera cv. Syrah

Fil: Matocq, Gustavo Luis . Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Agrarias

Las yemas, principal reservorio de levaduras entre los órganos aéreos vegetativos y reproductivos de la vid (Vitis vinifera var. Malbec).

El objetivo de esta investigación fue suministrar nueva evidencia acerca del modelo de permanencia de las levaduras en el ciclo natural de la vid. Se efectuó la observación, la medición del número de levaduras y la descripción morfológica de los diferentes órganos aéreos de la vid. Se procedió a la recolección aséptica de muestras a campo, en yema en actividad, yema en reposo, hoja joven, hoja adulta, ritidomis, zarcillo, capullo floral, flor y fruto. Los resultados revelaron dos momentos de máxima población de levaduras: en yema cerrada a fines de otoño y en yema terminal abierta a mediados de verano. La evolución de las levaduras en función de la superficie del fruto mostró poca relación entre ambas variables, por lo que el valor a considerar sería la cantidad de levaduras por baya como unidad. La ritidomis exhibió valores muy uniformes a lo largo del ciclo vegetativo, asumiendo desde esta perspectiva el papel de reservorio de moderada importancia.

Actividad antioxidante de los compuestos fenólicos contenidos en las semillas de la vid (vitis vinifera l.)

El propósito de este trabajo es obtener un antioxidante natural a partir de las semillas de uva (Vitis vinifera L.), para emplear en alimentos. Para ello se compararon distintos solventes para la extracción de fenoles de las semillas de la uva, de modo de obtener el extracto más concentrado en compuestos activos con la mínima degradación de su poder antioxidante durante el proceso de obtención. La concentración de fenoles totales de los extractos se determinó por el método Folin Ciocalteu. El poder reductor de los extractos se midió empleando el método de Oyaizu. Una vez seleccionado el solvente más adecuado para la extracción, se analizó la cinética de extracción, optimizando el tiempo de tratamiento. El extracto fue concentrado al vacío, y se veríficó la conservación del poder reductor en el extracto concentrado, por el método de Oyaizu. El extracto de semillas concentrado y sin concentrar se empleó en un sistema real sujeto a oxidación, tal como el jugo de manzanas. El grado de oxidación del jugo se midió por el método de Özoglu. El extracto concentrado fue deshidratado por secado en lecho de espuma y por liofilizado. En ambos casos se verificó el efecto del tratamiento de secado sobre el poder reductor. Finalmente, se evaluó la actividad antioxidante del extracto líquido concentrado de semillas de vid, respecto de otros antioxidantes comerciales como ácido ascórbico y dióxido de azufre. El sustrato oxidable fue el jugo de manzanas, y el grado de oxidación se midió por el método de Özoglu. El análisis estadístico de los datos se realizó mediante el análisis de la varianza; cuando no fue posible emplear el mencionado análisis, debido a que no se verificaban los supuestos básicos para su aplicación, se empleó la prueba de Kruskal –Wallis. En todos los casos, se utilizó el programa Statgraphics plus ®4.0. Para obtener un extracto antioxidante a partir de semillas de vid se utilizó una ex-tracción con agua a 90ºC, durante 4 horas. La relación sólido- líquido empleada fue de 1g de semillas enteras por 10 ml de solvente. El extracto obtenido presentaba una concentración de 12,587 mg de fenoles totales por gramo de semillas de uva extractadas y un poder reductor de 1,290 unidades. Como consecuencia del análisis de la cinética de extracción, el tiempo de tratamiento se redujo de 4 horas a 3 horas. La concentración del extracto se realizó al vacío a 60ºC, verificándose un aumen-to del poder reductor en el extracto concentrado, comprobado sobre jugo de manzanas. Comparando el extracto concentrado y el extracto sin concentrar se observa que la concentración de fenoles totales aumentó 29,57 veces, mientras que el poder reductor aumentó 37,39 veces. El deshidratado del extracto por medio del lecho de espuma permitió conservar el poder reductor del mismo, no ocurrió lo mismo en el deshidratado por liofilizado, donde se produjo un deterioro del poder reductor. Para un mismo contenido de fenoles totales agregado al jugo de manzanas, el ex-tracto líquido sin concentrar produjo un 28,4% de inhibición de la oxidación, mientras que el de extracto líquido concentrado produjo un 51,5 % de inhibición de la oxidación del jugo de manzanas. El extracto de semillas de vid, aplicado como antioxidante en jugo de manzanas, inhibió el desarrollo de la oxidación en un 31,51%, considerando 24 horas el tiempo de tratamiento. Este desempeño supera al ácido ascórbico, que en iguales condiciones, inhibió el desarrollo de la oxidación en un 2,6%. Pero en las condiciones de tra-bajo, el dióxido de azufre resulta mejor antioxidante que ambos, ya que logró inhibir el desarrollo de la oxidación en un 97,40 %.

Flor y fruto de vid [Vitis vinifera L.] : : micrografía aplicada a viticultura y enología

Un conocimiento apropiado de la anatomía de los diferentes tipos florales de la vid permite interpretar procesos de floración y fertilidad. Se ha observado durante cinco años las características de distintas variedades de vid en Mendoza (Argentina). Debido a las diferencias de variedades y viñedos, las observaciones se han tratado desde un punto de vista general. El estudio de las características anatómicas de la baya permite comprender fenómenos de maduración, estrés hídrico, deficiencias y productividad. En cuanto a los procedimientos tecnológicos, la observación de los componentes celulares del fruto: pared celular, polifenoles vacuolares, plástidos y ráfides de cristales de tartrato de calcio permite evaluar métodos enológicos, procesos de maceración y extracción de compuestos fenólicos y los tratamientos que deberían aplicarse para mejorar la calidad del vino.

Contenido de resveratrol en hojas de vides silvestres (Vitis spp.) mexicanas

El resveratrol es considerado una fitoalexina pues es sintetizado como respuesta a patógenos (factores bióticos) y en condiciones climáticas adversas (factores abióticos). Actualmente existe mucho interés en él por su potencial uso en farmacología como antioxidante. Mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) se determinó el contenido de resveratrol en hojas de 18 accesiones de vides nativas de Puebla, México, cuatro de ellas creciendo en cuatro condiciones ambientales diferentes. Las concentraciones fueron muy variables, estimándose 39,5 μg g−1 peso fresco como valor máximo, mientras que en algunas accesiones no fue posible detectar resveratrol. Se observaron diferencias en el contenido de resveratrol para accesiones creciendo en localidades diferentes, lo que sugiere alta influencia de los factores ambientales sobre la expresión del genotipo en la inducción o inhibición de la biosíntesis de dicho metabolito secundario.

Desarrollo de estándares de calidad para uvas Vitis vinifera L. cv. Malbec y Syrah

El objetivo del trabajo fue desarrollar estándares de calidad de uva basados en atributos físicos y químicos, capaces de predecir la calidad del vino. Se instaló una red de ensayos en Mendoza (Norte, Este y Valle de Uco), San Juan (Valle de Zonda), La Rioja (Chilecito), Catamarca y Salta (Valles Calchaquíes) (Argentina). Se ensayaron niveles de carga de uva (desbrote 30 y 50%, raleo 30 y 50% y testigo) en Malbec y Syrah. En la cosecha, las uvas fueron analizadas (tamaño baya, concentración azucarina, pH, antocianos, catequinas, taninos, fenoles totales) y vinificadas. Los vinos fueron analizados (alcohol, extracto seco, intensidad colorante, matiz, antocianos, catequinas, taninos, fenoles totales, color polimérico) y evaluados por un panel de degustadores. Empleando todos las variables de los vinos, mediante un análisis de componentes principales, se generaron dos índices que resumieron los atributos con mayor peso explicativo de la variabilidad observada (80%); ellos fueron: Riqueza Fenólica (RF, asociado a antocianos, taninos, catequinas, fenoles totales y concentración) y Peligro Oxidativo (PO, asociado a pH, matiz y tonalidad percibida). No existieron diferencias en cuanto a RF entre variedades ni entre niveles de producción de uva. Los vinos con RF mayor y PO menor se consideraron de mayor calidad. Las uvas cultivadas en zonas más frías tuvieron una mayor RF. En Malbec, las zonas frías y los bajos niveles productivos generaron un PO menor. Para cada variedad se desarrollaron predictores para RF y PO del vino. Se usó la regresión múltiple lineal paso a paso, seleccionando las variables de la uva con mayor poder predictivo. Se definieron las funciones de ajuste RFpred (Malbec R2 = 80%; Syrah R2 = 62%) y POpred (Malbec R2 = 80%; Syrah R2 = 62%). Los índices se tradujeron en estándares de calidad que mostraron concordancia entre uvas y vinos. La metodología puede ser válida para otras variedades tintas, pero debe ajustarse para cada caso. Los estándares permitirían asociar un precio a cada calidad y aumentar la transparencia del mercado.