Produção e avaliação da estabilidade de enzimas fúngicas

As enzimas estão presentes em todas as células vivas, onde exercem a função de catalisadores das reações que compõem as vias catabólicas e anabólicas do metabolismo celular. Esses biocatalisadores são moléculas de proteínas e seu poder catalítico está associado à conformação nativa, que depende de condições específicas de pH, temperatura e força iônica do meio. Os micro-organismos são bastante atrativos para a indústria, pois possibilitam a produção de enzimas por processos fermentativos em larga escala com regularidade necessária e simplicidade na requisição nutricional. Assim, embora alguns biocatalisadores sejam extraídos de tecidos animais e vegetais, as enzimas industriais são, em sua maior parte, obtidas a partir de micro-organismos. Este trabalho teve como objetivo a produção das enzimas lipase e β-glucanase a partir dos fungos Aspergillus niger e Trichoderma reesei, respectivamente, em diferentes meios de cultura, para determinar as condições de maior produção da enzima em questão. As enzimas produzidas em agitador orbital foram obtidas a partir da filtração do produto da fermentação, precipitação com sulfato de amônio e liofilização. Após a produção e precipitação a atividade das enzimas e a concentração de proteínas foram quantificadas, os parâmetros cinéticos foram determinados frente a diferentes pHs, temperaturas e força iônica do meio. A lipase apresentou melhor atividade a 30°C e em pH 6,0. A presença dos íons Mg2+ e Zn2+ levaram a um aumento na atividade da enzima. A β-glucanase apresentou maiores atividades quando submetidas a 37°C e pH 5,0. Os íons Mg2+, Cu2+ e Ca2+ induziram melhor a atividade enzimática.

Fontes e manejo de nitrogênio na cultura da batata em solos arenosos

Pós-graduação em Agronomia (Agricultura) - FCA

Produção de 1,3-propanodiol por Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli: otimização de meio e clonagem de genes

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Effects on soil chemical attributes and cotton yield from ammonium sulfate and cover crops

Fertilizer use in no-till systems must be aligned with a correct interpretation of soil chemical attributes and crop demands. The objectives of this work were evaluate the effects of pre-sowing application of ammonium sulfate (AS) and of cover crops on the yields and soil chemical attributes of no-till cotton (Gossypium hirsutum L. r. latifolium Hutch) over two harvesting years. The experiment was arranged in randomized complete block design, with the plots in strips, and the variables were three cover crops (Raphanus sativus L., Avena strigosa L. and Avena sativa L.) and four AS doses (0, 150, 300, and 450 kg ha-1) applied over millet dry biomass. The cotton in the experimental plots was manually harvested on April 25, 2007 and April 24, 2008. The soil samples were collected between cotton rows in all plots on May 5, 2007 and May 12, 2008, at depths of 0.0-0.05, 0.05-0.10, and 0.10-0.20 m for soil fertility analyses. The increasing doses of AS induced lower soil pH, and calcium (Ca) and magnesium (Mg) levels in the superficial soil layer, as well as higher exchangeable aluminum (Al) and sulfur (S) levels until a depth of 0.20 m. Seed cotton yields increased with increasing AS doses.

Purificação e estudos bioquímicos de exo-poligalacturonase (pectinase) produzida pelo fungo termofílico Rhizomucor pusillus, em cultivo submerso e aplicação na extração de sucos de frutas e hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Produção de amilases pelo cultivo em estado sólido de Rhizopus microsporus var. oligosporus e sua utilização na obtenção de xarope de glicose

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Produção de amilases de Rhizopus microsporus var. oligosporus e hidrólise enzimática do bagaço de mandioca visando a produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Produção de amilases de Rhizopus microsporus var. oligosporus e hidrólise enzimática do bagaço de mandioca visando a produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Growth of seedlings Schizolobium amazonicum (Huber ex Ducke) on substrate fertilized with nitrogen, phosphorus and potassium

The nutritional management of seedlings in the nursery is one of the most important practices that influence seedling quality. The aim of this work was to evaluate the effect of nitrogen, phosphorus and potassium on the development of Schizolobium amazonicum seedlings grown in 250 cm(3) containers with a commercial substrate in the North of Mato Grosso State, Brazil. The experimental design was completely randomized design with five treatments and five replications, each replication being represented by 24 seedlings. The treatments were: control (only commercial substrate); nitrogen fertilization (150 g m(-3) N using ammonium sulfate + 1.0 kg of ammonium sulfate dissolved in 100 L of water and applied in coverage); phosphorus fertilization (300 g P2O5 m(-3) using simple superphosphate); potassium fertilization (100 g m(-3) K2O using potassium chloride + 0.3 kg of potassium chloride dissolved in 100 L of water and applied in coverage) and; complete (a mixture of the three nutrients, 150, 300 and 100 g m(-3) N, P2O5 and K2O, respectively + 1.0 kg of ammonium sulfate + 0.3 kg of potassium chloride). The commercial substrate was composted milled pine bark plus vermiculite. Evaluations of the seedlings were performed at 90 days after sowing. The complete treatment (NPK) gave the highest values for biometric and best plant indices, which express the quality. When analyzing nutrients in isolation; potassium had the lowest effect. Based on these results it can be recommended to fertilize Schizolobium amazonicum seedlings in nurseries with 150, 300 and 100 g m(-3) of N, P2O5 and K2O, respectively, plus 1.0 kg of sulfate ammonium and 0.3 kg of potassium chloride applied in coverage.

Eficiência agronômica de adubos nitrogenados em soqueira de cana-de-açúcar colhida sem queima

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência agronômica das fontes nitrogenadas ureia (U), nitrato de amônio (NA), sulfato de amônio (SA) e cloreto de amônio (CA) em soqueira de cana-de-açúcar colhida sem queima, bem como determinar o efeito residual dessas fontes sobre a produtividade da cultura no ano agrícola subsequente. Utilizou-se o delineamento experimental de blocos ao acaso, com quatro repetições. Os tratamentos consistiram da aplicação de 120 kg ha-1 de N a um Latossolo Vermelho distrófico, coberto por palhada resultante da colheita sem queima da primeira soqueira. Incluiu-se um tratamento de controle sem adição de N fertilizante. Para avaliar o efeito residual dos adubos nitrogenados, aplicaram-se 450 kg ha-1 do formulado 20-5-19 após o corte da cana-soca. A maior produção de colmos e de açúcar na safra 2006/2007 foi obtida com a fonte SA. Na safra 2007/2008, não foi verificado efeito residual da adubação nitrogenada e houve queda de produtividade do tratamento CA em comparação ao controle. A fonte CA, à dose de 120 kg ha-1 de N em adubação de soqueira de segundo corte, é agronomicamente tão eficiente quanto as demais fontes de N utilizadas, mas tem menor eficiência no ano agrícola subsequente.

Avaliação do potencial de utilização de espécies leguminosas, arbóreas e arbustivas, noduladas e micorrizadas, na revegetação de barragem de rejeitos da Companhia Mineira de Metais, Vazante, MG

O processo de beneficiamento do zinco, extraído em Vazante pela Companhia Mineira de Metais - CMM produz um rejeito alcalino e com baixa disponibilidade de nutrientes. Esta dissertação tem como objetivo avaliar o potencial de utilização de espécies leguminosas noduladas e micorrizadas na revegetação de barragem de rejeito da CMM. Neste sentido, foram instalados dois experimentos de campo onde foi realizado o plantio prévio de Brachiaria sp. O primeiro experimento foi composto por 36 tratamentos que foram formados por uma combinação de 17 espécies + 1 testemunha (ausência de plantas) na presença e na ausência de esterco de curral (2,0 L) na cova de plantio. Cada unidade experimental foi formada por 20 exemplares da mesma espécie que foram plantadas em covas abertas manualmente (25 x 25 x 25 cm) num espaçamento de 2 x 2 m. Todas as covas receberam a adubação básica formada por 125 g de superfosfato simples e 60 g de cloreto de potássio. Entre as 17 espécies avaliadas, 3 não pertencem a família Leguminosae e receberam, além da adubação básica, cerca de 25 g de sulfato de amônio por cobertura. O segundo experimento foi montado com o objetivo de avaliar o potencial de espécies leguminosas beneficiarem o estabelecimento e crescimento de espécies não leguminosas na revegetação de barragem de rejeito da CMM. Foram utilizadas três espécies leguminosas (Enterolobium scomburkii, Acacia mangium e Acacia holosericea) e três não leguminosas (Lithraea brasiliensis, Cinnamomum glaziovii e Eugenia jambolana) num esquema fatorial (3 x 3) + 1 testemunha, formando dez tratamentos distribuídos em blocos ao acaso com três repetições. Cada parcela foi formada por 20 plantas (10 leguminosas + 10 não leguminosas) plantadas em espaçamento 2 x 2 m e com a mesma adubação básica utilizada no primeiro experimento. Todas as espécies leguminosas utilizadas foram previamente inoculadas com estirpes selecionadas de bactérias fixadoras de Nitrogênio atmosférico e com uma mistura de fungos micorrízicos provenientes da Embrapa/Agrobiologia. Os experimentos foram avaliados quanto ao estabelecimento e crescimento de plantas (altura e diâmetro do colo) aos 4, 12 e 24 meses após o plantio. Os resultados obtidos permitem concluir que dentre as espécies avaliadas, as mais indicadas para a primeira etapa da revegetação da barragem de rejeito da CMM são: Acacia holosericea, Acacia farnesiana, Acacia auriculiformis, Mimosa caesalpiniifolia, Leucaena leucocephala, Mimosa birmucronata, Enterolobium schomburkii e Prosopis juliflora. O sucesso do consórcio de espécies leguminosas e não leguminosas depende da escolha das espécies a serem combinadas, de maneira que não exista uma efetiva competição por água, nutrientes e luz que possa prejudicar as espécies de menor plasticidade. Das combinações avaliadas, as de maiores potencialidades para o programa de revegetação das barragens de rejeito da CMM são aquelas envolvendo a espécieLithraea brasiliensis.

Fisiologia e formação de partículas lipídicas durante o crescimento da levedura Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682.

A levedura Yarrowia lipolytica tem sido muito investigada, especialmente por ser um microrganismo oleaginoso, ou seja, capaz de acumular grandes quantidades de lipídios, o que ocorre majoritariamente em organelas denominadas partículas lipídicas. Estes lipídios apresentam várias potenciais aplicações biotecnológicas, como por exemplo na produção de óleo microbiano (single cell oil) e na produção de biodiesel. Durante este projeto de mestrado, objetivou-se estudar a fisiologia de duas linhagens da levedura Y. lipolytica, sendo uma tradicionalmente estudada pela comunidade científica internacional (linhagem w29) e outra isolada da Baía da Guanabara, no Rio de Janeiro (linhagem IMUFRJ 50682). Foram realizados cultivos em frascos agitados tipo Erlenmeyer com defletores tampados com algodão (volume total 500 mL, volume de meio 100 mL, 28 oC e 200 rotações por minuto), durante os quais foi possível: 1) escolher um meio de cultivo de composição totalmente definida, com tiamina como único fator de crescimento, adequado a estudos de fisiologia quantitativa com esta levedura; 2) verificar que Y. lipolytica não é capaz de crescer com sacarose ou xilose como única fonte de carbono; 3) verificar que Y. lipolytica cresce com velocidade específica de crescimento máxima (Máx) de 0,49 h-1 num meio complexo contendo glicose, extrato de levedura e peptona (meio YPD), 0,31 h-1 em meio definido com glicose como única fonte de carbono e 0,35 h-1 no mesmo meio, mas com glicerol como única fonte de carbono, sem excreção de metabólitos para o meio de cultivo; 4) verificar que ocorreu limitação por oxigênio nos cultivos em frasco agitado, sendo este o motivo pelo qual as células deixaram de crescer exponencialmente; 5) verificar que o uso de ureia, em vez de sulfato de amônio, como fonte de nitrogênio, contribui para uma variação menor do pH durante os cultivos, sem prejuízo ao crescimento da levedura; 6) observar que, ao se restringir a oferta de nitrogênio à levedura (aumento da relação C/N inicial no meio de 12,6 para 126), as células têm sua morfologia alterada e apresentam maior quantidade de partículas lipídicas; 7) determinar uma composição elementar para a biomassa de Y. lipolytica (CH1,98O0,58N0,13), em que os átomos de carbono encontram-se em média mais reduzidos do que na biomassa de leveduras como Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis. Foram também realizados cultivos em biorreator em batelada (1 L de volume útil, 28 oC, aerobiose plena e pH controlado em 5,0), durante os quais foi possível: a) estabelecer um protocolo de cultivo para Y. lipolytica em biorreator (que envolvem agitação mecânica, aeração e uso de anti-espumante, entre outras diferenças em relação aos cultivos em frasco); b) confirmar os valores dos principais parâmetros fisiológicos apresentados por esta levedura, anteriormente obtidos a partir de cultivos em frasco; c) confirmar que o fator de conversão de substrato a células (Yx/s) é maior para cultivos realizados com glicerol como fonte única de carbono (0,53 g/g para a linhagem IMUFRJ 50682), do que com glicose (0,48 g/g para a mesma linhagem). Finalmente, cultivos realizados em quimiostato com glicerol como fonte de carbono e energia, limitados por amônio (fonte de nitrogênio, relação C/N 126), às vazões específicas de 0,25 h-1 e 0,15 h-1, permitiram observar que o número de partículas lipídicas por célula de Y. lipolytica permaneceu em torno de 2 em ambas as situações e houve uma diminuição no teor de nitrogênio nas células quando a velocidade específica de crescimento diminuiu de 0,25 para 0,15 h-1.

Purificação e caracterização parcial de uma B-D glicosidase de Artemia franciscana com ação sobre celobiose e lactose

-D-glucosidase (EC 3.2.1.21) is one of the most interesting glycosidases, especially for hydrolysis cellobiose releasing glucose, is last step degradation of cellulose. This function makes the -D-glucosidase is of great interest as a versatile industrial biocatalyst, being critical to various bio-treatment / biorefinery processes, such as bioethanol production. Hen in the report, a -D-glucosidase was extracts from protein extracted of the invertebrate marine Artemia franciscana was purified and characterized with a combination of precipitation with ammonium sulfate (0 - 30%, 30 to 50%, 50 to 80%), the fraction saturated in the range of 30 to 50% (called F-II) was applied in a molecular exclusion chromatography, in Sephacryl S-200, the fractions corresponding to the first peak of activity of -D-glucosidase were gathered and applied in a chromatography of ion exchange in Mono Q; the third peak this protein obtained chromatography, which coincides with the peak of activity of -D-glucosidase was held and applied in a gel filtration chromatography Superose 12 where the first peak protein, which has activity of -D-glucosidase was rechromatography on Superose 12. This enzyme is probably multimerica, consisting of three subunit molecular mass of 52.7 kDa (determined by SDS-PAGE) with native molecular mass of 157 kDa (determined by gel filtration chromatography on Superose 12 under the system FPLC). The enzyme was purified 44.09 times with a recovery of 1.01%. Using up p-nitrophenyl-β-D-glucopiranoside as substrate obtained a Km apparent of 0.229 mM and a Vmax of 1.109 mM.60min-1.mL-1mM. The optimum pH and optimum temperature of catalysis of the synthetic substrate were 5.0 and 45 °C, respectively. The activity of the -D-glucosidase was strongly, inhibited by silver nitrate and N- etylmaleimide, this inhibition indicates the involvement of radical sulfidrila the hydrolysis of synthetic substrate. The -D-glucosidase of Artemia franciscana presented degradativa action on celobiose, lactose and on the synthetic substrate -nitrophenyl-β-D-glucopiranoside indicating potential use of this enzyme in the industry mainly for the production of bioethanol (production of alcohol from the participating cellulose), and production hydrolysate milk (devoid of milk lactose)

Purificação de C-ficocianina e sua incorporação em nanofibras

C-ficocianina (C-FC) é uma ficobiliproteína, de cor natural azul, com diversas aplicações na indústria alimentícia, farmacêutica e biomédica, dependendo do seu grau específico de pureza, que pode variar de 0,7 a 4,0, com respectivo aumento de seu valor comercial. Essa pureza é alcançada através de diversas técnicas de purificação, que podem ser aplicadas em diferentes sequências. Um destes processos de purificação de proteínas baseia-se na cromatografia de troca iônica, que utiliza trocadores que adsorvem as proteínas como resultado de interações iônicas entre a superfície da proteína e o trocador. Resinas e colunas de leito expandido podem ser utilizadas para aumentar a produtividade dessa técnica. É fundamental conhecer o perfil do processo de adsorção, para melhor aplicá-lo como ferramenta para o design e otimização de parâmetros operacionais. Outra tecnologia para o tratamento de biomoléculas é a ultrafiltração. Esta técnica é aplicável em larga escala, apresenta baixa complexidade de aplicação e pode ser realizada em condições brandas, minimizando o dano para o produto. Para aumentar a estabilidade da C-FC, e facilitar a sua aplicação, podem ser avaliadas técnicas recentes, não exploradas para este fim, como as nanofibras obtidas através do processo de electrospinning. Estas fibras possuem uma área superficial específica extremamente elevada devido a seu pequeno diâmetro. O objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros de adsorção e diferentes técnicas para purificação de C-ficocianina de Spirulina platensis e obter nanofibras poliméricas incorporadas de C-ficocianina. O trabalho foi dividido em quatro artigos. No primeiro artigo, foram avaliados os parâmetros e as isotermas de adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica para leito expandido Streamline® DEAE. Verificou-se que o maior coeficiente de partição foi obtido em pH 7,5, nas temperaturas de 15 e 25 °C. As isotermas de adsorção da Cficocianina foram bem representadas pelos modelos de Langmuir, de Freundlich e de Langmuir-Freundlich, sendo os valores estimados para Qm e Kd obtidos pela isoterma de Langmuir foram, respectivamente, 33,92 mg.mL-1 e 0,123 mg.mL-1, respectivamente. No segundo artigo foi avaliada a purificação de C-FC até grau alimentar, utilizando ultrafiltração (UF). Com a membrana de 50 kDa, identificou-se que somente a temperatura e a aplicação de diferentes ciclos de diafiltração (DF) causaram influência significativa sobre a purificação e recuperação da C-ficocianina. Foram então aplicados o aumento gradativo da quantidade de ciclos, e a diafiltração previamente à ultrafiltração (DF/UF), onde obteve-se um extrato de Cficocianina com pureza de 0,95. No terceiro artigo foram propostos processos de purificação, envolvendo a utilização das diferentes técnicas para obtenção de C-FC com diferentes purezas. Determinou-se que a partir de cromatografia de troca iônica em leito fixo seguido de DF/UF, obtém-se C-FC para uso em cosméticos e a partir de precipitação com sulfato de amônio, e DF/UF obtém-se C-FC para uso em biomarcadores. Com uma sequência de precipitação com sulfato de amônio, DF/UF e cromatografia de troca iônica em leito fixo chega-se a C-FC de grau analítico. No último artigo, C-FC foi incorporada a nanofibras de óxido de polietileno (PEO) através de processo de electrospinning. Foram determinadas a condutividade da solução de C-FC/PEO, a estrutura e comportamento termogravimétrico das nanofibras formadas. Soluções de polímeros com concentração de 6 e 8% proporcionaram a formação de nanofibras com diâmetro médio inferior a 800 nm, homogêneas, sem a presença de gotas. A análise termogravimétrica identificou aumento na resistência térmica da C-FC incorporada nas fibras.

Purificação, caracterização e atividade bioinseticida de um inibidor de tripsina de sementes de Crotalaria pallida

A proteinaceous trypsin inhibitor was purified from Crotalaria pallida seeds by ammonium sulphate fractionation, affinity chromatography on immobilized Trypsin-Sepharose and TCA precipitation. The trypsin inhibitor, named ITC, had Mr of 32.5 kDa by SDS-PAGE and was composed by two subunits with 27.7 and 5.6 kDa linked by disulphide bridges, a typical characteristic of Kunitz-Inhibitor family. ITC was stable until 50°C, and at 100°C its residual activity was of about 60%. Also, ITC was stable at pHs 2 to 12. The inhibition of trypsin by ITC was non-competitive, with a Ki of 8,8 x 10-7M. ITC inhibits weakly other serine proteinases such as chymotrypsin and elastase. The inhibition of papain (44% of inhibition), a cysteine proteinase was an indicative of the bi-functionality of ITC. In vitro assays against digestive proteinases from several Lepdoptera, Diptera and Coleoptera pests were made. ITC inhibited in 100% digestive enzymes of Ceratitis capitata (fruit fly), Spodoptera frugiperda and Alabama argillacea, the last one being a cotton pest. It also inhibited in 74.4% Callosobruchus maculatus (bean weevil) digestive enzymes, a Coleoptera pest. ITC, when added in artificial diet models, affected weakly the development of C. capitata larvae and it had a WD50 of 2.65% to C. maculatus larvae