Fisiologia e formação de partículas lipídicas durante o crescimento da levedura Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682.

A levedura Yarrowia lipolytica tem sido muito investigada, especialmente por ser um microrganismo oleaginoso, ou seja, capaz de acumular grandes quantidades de lipídios, o que ocorre majoritariamente em organelas denominadas partículas lipídicas. Estes lipídios apresentam várias potenciais aplicações biotecnológicas, como por exemplo na produção de óleo microbiano (single cell oil) e na produção de biodiesel. Durante este projeto de mestrado, objetivou-se estudar a fisiologia de duas linhagens da levedura Y. lipolytica, sendo uma tradicionalmente estudada pela comunidade científica internacional (linhagem w29) e outra isolada da Baía da Guanabara, no Rio de Janeiro (linhagem IMUFRJ 50682). Foram realizados cultivos em frascos agitados tipo Erlenmeyer com defletores tampados com algodão (volume total 500 mL, volume de meio 100 mL, 28 oC e 200 rotações por minuto), durante os quais foi possível: 1) escolher um meio de cultivo de composição totalmente definida, com tiamina como único fator de crescimento, adequado a estudos de fisiologia quantitativa com esta levedura; 2) verificar que Y. lipolytica não é capaz de crescer com sacarose ou xilose como única fonte de carbono; 3) verificar que Y. lipolytica cresce com velocidade específica de crescimento máxima (Máx) de 0,49 h-1 num meio complexo contendo glicose, extrato de levedura e peptona (meio YPD), 0,31 h-1 em meio definido com glicose como única fonte de carbono e 0,35 h-1 no mesmo meio, mas com glicerol como única fonte de carbono, sem excreção de metabólitos para o meio de cultivo; 4) verificar que ocorreu limitação por oxigênio nos cultivos em frasco agitado, sendo este o motivo pelo qual as células deixaram de crescer exponencialmente; 5) verificar que o uso de ureia, em vez de sulfato de amônio, como fonte de nitrogênio, contribui para uma variação menor do pH durante os cultivos, sem prejuízo ao crescimento da levedura; 6) observar que, ao se restringir a oferta de nitrogênio à levedura (aumento da relação C/N inicial no meio de 12,6 para 126), as células têm sua morfologia alterada e apresentam maior quantidade de partículas lipídicas; 7) determinar uma composição elementar para a biomassa de Y. lipolytica (CH1,98O0,58N0,13), em que os átomos de carbono encontram-se em média mais reduzidos do que na biomassa de leveduras como Saccharomyces cerevisiae e Dekkera bruxellensis. Foram também realizados cultivos em biorreator em batelada (1 L de volume útil, 28 oC, aerobiose plena e pH controlado em 5,0), durante os quais foi possível: a) estabelecer um protocolo de cultivo para Y. lipolytica em biorreator (que envolvem agitação mecânica, aeração e uso de anti-espumante, entre outras diferenças em relação aos cultivos em frasco); b) confirmar os valores dos principais parâmetros fisiológicos apresentados por esta levedura, anteriormente obtidos a partir de cultivos em frasco; c) confirmar que o fator de conversão de substrato a células (Yx/s) é maior para cultivos realizados com glicerol como fonte única de carbono (0,53 g/g para a linhagem IMUFRJ 50682), do que com glicose (0,48 g/g para a mesma linhagem). Finalmente, cultivos realizados em quimiostato com glicerol como fonte de carbono e energia, limitados por amônio (fonte de nitrogênio, relação C/N 126), às vazões específicas de 0,25 h-1 e 0,15 h-1, permitiram observar que o número de partículas lipídicas por célula de Y. lipolytica permaneceu em torno de 2 em ambas as situações e houve uma diminuição no teor de nitrogênio nas células quando a velocidade específica de crescimento diminuiu de 0,25 para 0,15 h-1.

The yeast Yarrowia lipolytica has been intensively investigated, especially for being an oleaginous microorganism, thus possessing the capacity of accumulating high amounts of lipids, which mainly takes place in organeles known as lipid bodies. These lipids present several potential biotechnological appications, as in the production of single cell oil or biodiesel. During this research project, we aimed at investigating the physiology of two Y. lipolytica strains: w29, traditionally investigated by the international scientific community, and IMUFRJ 50682, isolated from the Guanabara Bay in Rio de Janeiro. Shake-flask cultivations in baffled Erlenmeyer flasks (total volume 500 mL, liquid volume 100 mL, 28 oC and 200 rotations per minute) with cotton stoppers were carried out and allowed us to: 1) choose a fully defined cultivation medium, in which tiamine is the sole growth factor, suitable for quantitative physiological studies with this yeast; 2) verify that Y. lipolytica is not capable of growing on sucrose or xylose as the sole carbon source; 3) observe that Y. lipolytica grows with a maximum specific growth rate (MAX) of 0.49 h-1 in a complex medium containing glucose, yeast extract and peptone (YPD medium), 0.31 h-1 in a defined medium with glucose as the sole carbon source, and 0.35 h-1 in the same medium, but with glycerol as the sole C-source, without excreting metabolites to the cultivation medium; 4) verify that oxygen limitation took place during our shakeflask cultivations and that this caused cells to leave the exponential growth phase; 5) verify that urea can substitute ammonium as the sole nitrogen-source for Y. lipolytica, keeping pH variations less pronounced, without compromising cell growth; 6) observe that cells presented an altered morphology and higher amounts of lipid bodies, when less nitrogen was added to the medium (C/N ratio increased from 12.6 to 126); 7) determine an elemental composition for the biomass of Y. lipolytica (CH1,98O0,58N0,13), in which the average carbon atom was more reduced with respect to the biomass of yeasts such as Dekkera bruxellensis and Saccharomyces cerevisiae. Bioreactor cultivations in batch mode (working volume 1 L, 28 oC, full aerobiosis and pH controlled at 5.0) were also carried out, which allowed us to: a) define a protocol for the cultivation of Y. lipolytica in this system (which involves mechanical agitation, aeration and the use of anti-foam, among other differences with respect to shake-flask cultivations); b) confirm the main physiological parameters presented by this yeast, previously obtained from shake-flask cultivations; c) confirm that the biomass yield on substrate (Yx/s) is higher on glycerol than on glucose (0.53 g/g and 0.48 g/g, respectively). Finally, N-limited chemostat cultivations with glycerol as the carbon and energy source and ammonium as the N-source were also performed (dilution rates of 0.25 h-1 and 0.15 h-1, C/N ratio in the medium of 126), allowing us to verify that the number of lipid particles per cell is around 2 under both conditions and that there was a decrease in the N content in the cells when the specific growth rate decreased from 0.25 to 0.15 h-1.