Avaliação da aspirina e do ácido cafeico fenetil estersobre o reparo tecidual cutâneo

Numerosos modelos in vitro e in vivo foram desenvolvidos para estudar o reparo de lesões e identificar os mecanismos chave deste processo. Visando avaliar o processo de cicatrização utilizamos um modelo de lesão excisional total e um modelo de queimadura promovida por escaldamento. No estudo utilizando o modelo de lesão excisional total, abordamos o uso da aspirina (um inibidor não seletivo da COX) e seu efeito diferenciado sobre os sexos na cicatrização cutânea de camundongos. Observamos que os grupos fêmea controle e tratado apresentaram contração atrasada comparado aos grupos macho controle e tratado, respectivamente. Entre os grupos fêmea e macho controles, as fêmeas apresentaram menor atividade da mieloperoxidase e menor quantidade de células MIF-positivas do que os machos controle. Já entre os grupos fêmea e macho tratados, foi observado que nas fêmeas tratadas, a atividade da mieloperoxidase e a quantidade de macrófagos F4/80-positivos estavam maiores do que no grupo macho tratado. Ainda entre os grupos tratados, as fêmeas apresentaram menores níveis de hidroxiprolina e maior expressão proteica de vWF e VEGF comparado aos machos. No estudo das lesões causadas por queimadura, avaliamos as propriedades anti- inflamatórias e antioxidantes do ácido cafeico fenetil ester (CAPE) no reparo destas lesões e observamos que em 7, 14, 21 e 70 dias após a queimadura, o grupo queimado+CAPE apresentou menor área lesada, além de menor atividade da mieloperoxidase e dos níveis de nitrito do que o grupo queimado. Também foi observado que no grupo queimado+CAPE a expressão proteica de CD68 e de PECAM-1 estava reduzida comparada ao grupo queimado. Analisando os parâmetros de dano oxidativo foi observado que os níveis de MDA e de proteínas carboniladas estavam menores no grupo queimado+CAPE do que no grupo queimado, tanto no plasma quanto na lesão. Em suma, nosso estudo avaliou o processo de cicatrização de dois modelos de lesão, em roedores de diferentes espécies e em abordagens distintas. No modelo de lesão excisional total em camundongos observamos que a administração da aspirina prejudicou o processo de cicatrização em camundongos Balb/c fêmeas, mas não afetou esse processo nos machos da mesma linhagem, o que pode ser explicado pela redução dos níveis de estrógenos nas fêmeas. A utilização do CAPE na cicatrização de queimaduras em ratas comprovou sua eficácia anti-inflamatória e antioxidante devido ao grupo queimado+CAPE ter apresentado maior taxa de cicatrização, redução da resposta inflamatória, além da redução do dano oxidativo em lipídeos e proteínas comparado ao grupo queimado.

Biocompatibilidade de um material a base de guta-percha autoadesiva (Bio-Gutta)

O objetivo desse trabalho foi avaliar a biocompatibilidade de um material a base de guta-percha autoadesiva (Bio-Gutta) em tecido subcutâneo de camundongos. A guta-percha convencional foi utilizada como referência para comparação. Para isso, foram utilizados 30 camundongos, os quais foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos (Bio-Gutta e guta-percha convencional). Os materiais avaliados foram implantados na região dorsal dos camundongos. Após 7, 21 e 63 dias, os animais foram sacrificados e 5 amostras por grupo por tempo experimental foram obtidas. As amostras histológicas foram seccionadas em 5 m de espessura e coradas convencionalmente com hematoxilina e eosina. Um escore de I-IV foi utilizado para graduar a reação inflamatória. O teste U de Mann-Whitney com correção de Bonferroni foi utilizado para análise estatística (p < 0,05). Os resultados mostraram que, após 7 dias, a Bio-Gutta induziu uma reação tecidual de leve a moderada (II) e a guta-percha convencional apresentou uma resposta inflamatória de moderada a intensa (III). Após 21 dias, a Bio-Gutta induziu uma leve reação tecidual (I), enquanto que a guta-percha convencional ainda apresentava uma resposta inflamatória moderada (III). Uma reação tecidual de leve a ausente (I) foi observada na Bio-Gutta após 63 dias, ao passo que na guta-percha convencional observou-se uma resposta inflamatória de leve a moderada (II). Houve diferença significativa na mediana do grau de inflamação entre os grupos em cada tempo experimental (p = 0,005, aos 7 dias; p = 0,011, aos 21 dias; e p = 0,003, aos 63 dias). Concluiu-se então que a Bio-Gutta foi mais biocompatível que a guta-percha convencional em tecido subcutâneo de camundongos apresentando uma boa resposta tecidual.

O transplante de células mononucleares de medula óssea contribui para o remodelamento da matriz extracelular durante a regeneração do fígado em ratos com fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar

A fibrose hepática é o resultado de uma lesão crônica, com a ativação de células inflamatórias e fibrogênicas no fígado, as quais levam a um acúmulo excessivo de proteínas de matriz extracelular (MEC). Essas alterações resultam na morte de células do fígado, com desorganização e perda da função do parênquima hepático. A cirrose é o estágio avançado da fibrose, e culmina na falência hepática, uma condição potencialmente fatal cujo único tratamento efetivo é o transplante de fígado, o qual é limitado pela disponibilidade de órgãos. Na busca por terapias alternativas visando a regeneração hepática, o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO) mostrou resultados benéficos e promissores em modelos animais e alguns protocolos clínicos. Entre essas células, estão as células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais, que apresentam potencial regenerativo e modulador da resposta inflamatória. Este estudo pretendeu avançar na compreensão dos mecanismos pelos quais as CMMO podem ajudar na regeneração hepática. Ratos com fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) foram transplantados com CMMO e comparados com ratos com fibrose sem transplante e ratos normais. Parâmetros hepáticos como componentes da MEC (colágeno total, colágenos tipos I e IV, laminina, metaloproteinases de matriz MMPs), componentes celulares (células fibrogênicas, células de Kupffer e colangiócitos) e enzimas hepáticas foram analisados por microscopia de luz, microscopia confocal, western blotting e espectrofotometria. Os resultados mostraram que o transplante de CMMO contribui para a regeneração hepática de maneira global, (a) diminuindo o acúmulo de colágeno e laminina; (b) aumentando a produção de MMPs que favorecem o remodelamento da MEC, principalmente por células de Kupffer; (c) normalizando a quantidade de colangiócitos e diminuindo a quantidade de células fibrogênicas; e (d) normalizando os níveis sanguíneos das enzimas hepáticas. Portanto, nós sugerimos que as CMMO podem ajudar na regeneração hepática através de mecanismos parácrinos e se diferenciando em células de Kupffer, contribuindo para a secreção de fatores antiinflamatórios e anti-fibrogênicos no fígado com fibrose.

Estudo das alterações biológicas causadas pela aderência de cepas de Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno relacionado ao desenvolvimento de quadros de diarréia aguda ou persistente. A resposta inflamatória induzida por EAEC está relacionada à liberação de interleucina 8, que atua estimulando a transmigração de neutrófilos através do epitélio. Os macrófagos, de forma similar aos neutrófilos, são células fagocíticas que produzem espécies reativas de oxigênio (ERO), como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Neste trabalho, avaliamos as consequências da interação de diferentes cepas clínicas com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937. Todas as cepas testadas apresentaram filamentos nos testes de aderência aos macrófagos, diferentemente do que ocorre na interação com outras linhagens celulares como HEp-2, T84 e Caco-2. O ferro é um microelemento essencial para bactérias, sendo utilizado como cofator de enzimas e que também pode participar da geração de ERO através da reação de Fenton. Considerando-se a possibilidade de que o H2O2 produzido pelos macrófagos possa gerar radical hidroxil através da reação de Fenton, testes de aderência foram realizados com as amostras cultivadas na presença do captador de ferro 2,2-dipiridil. Tal fato não suprimiu a formação de filamentos, entretanto diminuiu a aderência das cepas EAEC 042 e 17-2. Com o objetivo de produzir uma resposta adaptativa ao H2O2, as culturas bacterianas foram pré-tratadas com uma dose sub-letal de H2O2 por 60 minutos antes de aderirem aos macrófagos. Nossos resultados mostraram que o pré-tratamento também não inibiu o aparecimento de filamentos em relação às culturas não tratadas. Além disto, foi observado que o pré-tratamento com o H2O2 reduziu a aderência das amostras de EAEC ao tapete celular. A filamentação é uma das respostas SOS, induzida pela presença de danos e/ou bloqueio na síntese da molécula de DNA. Com o objetivo de verificar se o H2O2 produzido pelos macrófagos estaria causando danos induzindo o sistema SOS e a filamentação bacteriana, foram realizados testes de viabilidade com mutantes derivados de E. coli K12 deficientes em enzimas do reparo por excisão de bases (BW535) e na resposta SOS (DM49). Nossos resultados mostram que os mutantes apresentaram os níveis de sobrevivência semelhantes ao observado para cepa selvagem isogênica (AB1157). Todos estes resultados em conjunto indicam que o H2O2 não é o indutor da filamentação nos testes de aderência. Macrófagos ativados apresentam ação microbicida através da ação da enzima indolamina dioxigenase (IDO), associada à redução do aminoácido L-triptofano. Desta forma, realizamos testes qualitativos de aderência de EAEC aos macrófagos suplementando o meio de interação com este aminoácido. Nossos resultados mostram que a adição de triptofano ao meio de interação reduz o número de filamentos por campo. Desta forma, aventamos a hipótese de que a depleção do triptofano seja responsável pela indução de resposta SOS, tendo como conseqüência a filamentação das bactérias.

Efeito do pré-condicionamento isquêmico remoto em modelo de lesão hepática por isquemia-reperfusão em ratos

A lesão por isquemia-reperfusão (I/R) é o mecanismo fisiopatológico central no desenvolvimento da insuficiência hepática pós-operatória. Diversas estratégias para minimizar suas consequências estão sendo desenvolvidas, mas ainda sem resultados satisfatórios. Recentemente o pré-condicionamento isquêmico remoto (PCIR), método em que ciclos breves de I/R aplicados em um órgão ou membro é capaz de atenuar os resultados da I/R em um órgão distante, vem sendo utilizado, em modelos experimentais, com resultados promissores. No entanto seu mecanismo de ação ainda não foi esclarecido. Um dos mecanismos propostos é a modulação na expressão das citocinas sintetizadas durante a resposta inflamatória que acompanha o processo de I/R. Foram utilizados 36 ratos (Rattus norvegicus), machos, com peso entre 250 e 280 g, divididos em três grupos: Grupo Sham, cirurgia simulada; Grupo IR, isquemia de 70% do fígado por 45 minutos e reperfusão; e Grupo PCIR, pré-condicionamento isquêmico remoto do fígado através de seis ciclos de isquemia-reperfusão da pata do animal, com quatro minutos de isquemia e quatro minutos de reperfusão em cada ciclo, seguido de isquemia hepática semelhante ao do Grupo IR. Terminado os procedimentos cirúrgicos, metade dos animais foi morta decorridos 60 minutos de reperfusão, e a outra metade após 180 minutos. Foi coletado tecido hepático do lobo submetido à isquemia, para estudo histopatológico, utilizando o índice de injúria hepática modificado; e sangue, para dosagem plasmática de TNF-α, IL-6, IL-10 e ALT. A análise histopatológica mostrou que a necrose celular foi significativamente reduzida no Grupo PCIR quando comparado com Grupo IR (p <0,0001). As transaminases mostraram o mesmo padrão com redução significativa dos seus valores no Grupo PCIR quando comparados com o Grupo I-R (p <0,0001). A dosagem das interleucinas mostrou redução significativa na expressão da IL-6 no Grupo PCIR quando comparado com o Grupo IR (p<0,001). Houve aumento da expressão de IL-10 nos grupo PCIR, porém não atingiu significância estatística. Não foi identificada diferença na dosagem de TNF-α nos grupos estudados. O PCI-R foi eficaz na redução na necrose celular resultante da lesão por I-R nos grupos estudados. A redução na síntese de IL-6 segue o padrão observado em outros estudos.

Papel regulatório da proteína anexina-1 e de seu derivado Ac2-26 no modelo experimental de asma alérgica em camundongos

A asma é uma doença inflamatória crônica caracterizada por hiper-reatividade das vias aéreas, acúmulo de eosinófilos, secreção de muco e remodelamento. No decorrer do estabelecimento do processo inflamatório, há liberação de mediadores endógenos que atuam limitando a evolução do quadro patológico e garantindo a manutenção da homeostasia (COHN, ELIAS e CHUPP, 2004). Dentre estes recebem destaque os hormônios glicocorticóides, reconhecidos por sua atividade anti-inflamatória, dependente, em parte, da geração de fatores intermediários como a proteína anexina-1 (AnxA1) (KAMAL, FLOWER e PERRETTI, 2005; PERRETTI, 2003). Neste estudo investigou-se o papel regulatório da AnxA1 e do peptídeo derivado Ac2-26 (50 - 200 g/animal) no modelo experimental de asma alérgica murina. Camundongos BALB/c (AnxA1+/+) e depletados do gene codificante para AnxA1 (AnxA1-/-) foram sensibilizados com ovoalbumina (OVA 50 g) e hidróxido de alumínio (5 mg), por via subcutânea. Após 14 dias, foi feito reforço com OVA (25 g), por via intraperitoneal, e nos dias 19, 20 e 21 foram desafiados com OVA (25 g), por via intranasal. O tratamento consistiu na administração intranasal do peptídeo Ac2-26 (50 - 200 g), 1 h antes de cada desafio. As análises foram feitas 24 h após o último desafio e incluíram: i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina (3 27 mg/ml) através de pletismografia invasiva; ii) alterações morfológicas através de histologia clássica; iii) quantificação de colágeno e iv) quantificação de mediadores inflamatórios através de ELISA. Verificou-se que camundongos AnxA1-/-, quando ativamente sensibilizados e desafiados com OVA apresentaram exacerbação do quadro de hiper-reatividade das vias aéreas, assim como do número de eosinófilos no lavado broncoalveolar e no infiltrado peribrônquico, deposição de colágeno e nos níveis de IL-13 em comparação aos controles AnxA1+/+. Em paralelo, observou-se que o peptídeo Ac2-26 levou a uma redução da hiper-reatividade das vias aéreas frente à estimulação com metacolina nos animais AnxA1+/+. O peptídeo Ac2-26 reduziu o infiltrado inflamatório no parênquima pulmonar e o número de eosinófilos peribronquiolares, além da produção de muco no tecido pulmonar e da geração IL-4, IL-13, eotaxina-1 e -2. Em conjunto, nossos achados mostram que os camundongos AnxA1-/- mostraram-se mais responsivos à estimulação antigênica, o que foi indicativo de que a AnxA1 parece exercer um papel regulatório importante sobre a resposta inflamatória alérgica murina. Além disso, o efeito inibitório do peptídeo Ac2-26 sobre a resposta alérgica pulmonar foi indicativo de que este se coloca como um composto anti-inflamatório e anti-alérgico promissor para utilização na terapia da asma.

Prevalência do polimorfismo -1031 T>C do gene TNFA em um grupo de diabéticos tipo I e sua relação com a periodontite severa

Diabetes mellitus e doenças periodontais são altamente prevalentes na população mundial. Doenças periodontais (DPs) compreendem um grupo de condições crônicas inflamatórias induzidas por microorganismos que levam à inflamação gengival, à destruição tecidual periodontal e à perda óssea alveolar. Diabetes mellitus (DM) é o termo utilizado para descrever um grupo de desordens metabólicas associadas à intolerância à glicose e ao metabolismo inadequado de carboidratos. Uma vez que DPs poderiam agir de forma similar a outros estados infecciosos sistêmicos, aumentando a severidade do diabetes, uma possível relação entre ambas tem sido considerada em todo o mundo. Polimorfismos genéticos de um único nucleotídeo (SNPs) têm sido estudados em diversas doenças. Nas periodontites, acredita-se que possam estar envolvidos na exacerbação da resposta inflamatória frente ao desafio bacteriano, modificando a susceptibilidade do hospedeiro. Neste estudo, a prevalência de periodontite foi avaliada em portadores de diabetes mellitus tipo I. Posteriormente, o SNP localizado na região promotora do gene TNFA (-1031T>C) foi analisado e sua importância para a doença periodontal destrutiva foi avaliada. O grupo teste foi constituído por diabéticos tipo I (DGT, n=113) enquanto o grupo controle por indivíduos não diabéticos (ND, n=73). Para as análises dos polimorfismos genéticos, um subgrupo foi retirado do grupo teste (DG, n=58) e comparado ao grupo ND. Os seguintes parâmetros clínicos e demográficos foram avaliados: percentual de sítios com profundidade de bolsa  6,0 mm (%PBS6,0 mm); índice gengival (IG); perda óssea radiográfica (POR); fumo; duração do diabetes ; idade; índice de massa corpórea (IMC), n de internações e n de dentes presentes. Amostras de sangue e/ou esfregaço bucal foram colhidas de 58 pacientes do grupo teste e de 73 controles. Após a extração do DNA genômico e amplificação da região genômica de interesse por PCR (Polymerase Chain Reaction), o polimorfismo TNFA 1031T>C foi analisado por BbsI RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). A análise dos produtos de digestão foi feita por eletroforese em gel de poliacrilamida 8%. A análise estatística das freqüências alélica e genotípica juntamente com os dados clínicos e epidemiológicos entre os 2 grupos foi feita através do teste do Mann-Whitney e do Qui-quadrado. Os grupos de estudo obedecem ao princípio de Hardy-Weinberg. No grupo ND, as seguintes freqüências genotípicas foram encontradas: 78,1% (T/T); 20,5% (T/C) e 1,4% (C/C) enquanto no grupo D foram: 42,4%(T/T); 37,3% (T/C) e 20,3% (C/C). A frequência do alelo T no grupo diabético (D) foi de 0,610 ao passo que no grupo ND foi de 0,883. Não foi possível encontrar uma relação entre o polimorfismo -1031 T>C do gene TNFA e a presença de periodontite em diabéticos tipo I. Entretanto, o polimorfismo estudado se mostrou significativamente relacionado (p<0,0001 e OR= 4.85 95%IC 2,271-10,338) à presença do diabetes tipo I.

Produção de IL-1β, IL-6 e IL-8 por fibroblastos estimulados por cimentos endodônticos e submetidos à terapia laser de baixa potência

O sucesso do tratamento endodôntico depende da cuidadosa realização de todas as suas fases, terminando com uma obturação tridimensional que alcance todo o sistema de canais radiculares. Desta forma, os materiais obturadores, ou as substâncias liberadas, entrarão em contato com os tecidos perirradiculares, o que poderá influenciar a resposta inflamatória e o processo de reparo. A terapia laser de baixa potência (TLBP) tem sido estudada quanto à sua ação anti-inflamatória, favorecendo o reparo. O objetivo deste estudo foi investigar a produção das citocinas IL-1β, IL-6 e IL-8 por fibroblastos de gengiva humana (linhagem FMM1) como resposta à presença dos extratos dos cimentos endodônticos AH Plus, MTA Fillapex e EndoSequence BC Sealer, bem como a eficácia da TLBP, neste modelo. Para isto, extratos destes cimentos, recém-manipulados e após 24 h do endurecimento, foram preparados em meio de cultura DMEM fresco, conforme as normas ISO 10993-12. Inicialmente, a citotoxicidade dos cimentos foi avaliada, após a interação das células com a diluição seriada destes extratos (1:1 a 1:16), por meio do ensaio MTT. Para a análise da produção de citocinas, 106 células por poço foram cultivadas em placas de cultura de 24 poços, para a interação com os extratos dos cimentos, na diluição 1:4. Estabeleceram-se os grupos não irradiado e irradiado. No grupo irradiado, as culturas celulares receberam duas irradiações do laser InGaAlP (660 nm, 30 mW, 5 J/cm2 e área do feixe de 0,028 cm2), com intervalo de 12 h. O grupo não irradiado foi submetido às mesmas condições ambientais que o irradiado. Os sobrenadantes das culturas foram coletados, centrifugados, aliquotados e armazenados congelados, para a posterior análise pelo ensaio de ELISA. Todos os dados obtidos (médias erro padrão) foram tratados estatisticamente por ANOVA one-way, complementado pelo teste de Tuckey e ANOVA two-way, com correção de Bonferroni (p< 0,05). A citotoxicidade dos cimentos AH Plus e EndoSequence BC Sealer revelou-se tempo/concentração-dependente, enquanto a do MTA Fillapex mostrou-se concentração-dependente. Os cimentos endodônticos induziram a produção das citocinas IL-1β, IL-6 e IL-8 pelos fibroblastos, sem diferença significativa com os controles (p> 0,05). Somente o LPS de E. coli induziu a secreção de IL-8, com diferença estatística (p< 0,05). A TLBP não foi capaz de modular a produção das citocinas em questão, significativamente.

Efeitos da terapia periodontal na função endotelial e na expressão de marcadores inflamatórios sistêmicos

A periodontite é uma doença infecciosa, crônica e altamente prevalente causando uma resposta inflamatória. A infecção e a inflamação são consideradas a base etiológica para o desenvolvimento da aterosclerose. Recentes estudos indicam que a periodontite severa pode influenciar o aumento de marcadores inflamatórios e de disfunção endotelial associados com o aumento de risco da doença coronariana e o acidente vascular cerebral. Embora alguns estudos tenham sugerido esta associação, os reais efeitos do tratamento da doença periodontal sobre a rede complexa de marcadores envolvidos na aterosclerose são pouco conhecidos. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da terapia periodontal nos biomarcadores inflamatórios (TNF-α, fibrinogênio, PCRus, INFγ, IL-1β, IL-6 e IL-10), perfil lipídico (CT, HDL, LDL, TG, oxLDL e anti-oxLDL) e função endotelial (IMT) das artérias carótidas. Um total de trinta e dois indivíduos saudáveis sistemicamente e afetados pela periodontite severa (16 mulheres, 16 homens; 51,87 anos de idade), incluindo 17 sujeitos para o grupo teste e 15 sujeitos para o grupo controle foram recrutados para o estudo. A ultrassonografia das artérias carótidas e os níveis séricos inflamatórios foram avaliados no início, 40 e 100 dias após o tratamento periodontal não-cirúrgico, comparando tempo e grupos. O tratamento periodontal resultou em significante redução dos parâmetros da doença periodontal. O grupo que recebeu tratamento mostrou decréscimos significativos de oxLDL (P<0.0001), anti-oxLDL (P<0,0001), TNF-α (P<0,0001), fibrinogênio (P=0,008), INFγ (P<0,0001), IL-1β (P<0,0001), IL-6 (P<0,0001), IMT (P=0,006) e significante aumento de IL-10 (P<0,0001) após 100 dias do tratamento periodontal comparando com grupo controle. Entretanto, os resultados não foram significativos para PCRu (P=0,109), colesterol total (P=0,438), HDL (P=0,119), LDL (P=0,425) e triglicerídeos (P=0,939). Com base nestes resultados, o tratamento da periodontite pode melhorar o perfil inflamatório e a função endotelial, sendo uma importante ferramenta adicional para a prevenção das doenças cardiovasculares.

Avaliação do papel do óxido nítrico no comprometimento da função pulmonar e hiper-reatividade das vias aéreas em camundongos estimulados com sílica

Silicose é uma doença pulmonar causada pela inalação de partículas de sílica, na qual vários são os mediadores inflamatórios implicados. Neste estudo investigamos o envolvimento do óxido nítrico (NO) nas alterações de função pulmonar e hiper-reatividade das vias aéreas, em camundongos estimulados com sílica por via intranasal. Foram analisados parâmetros como i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas ao aerossol com metacolina (3 27 mg/mL) através de sistema de pletismografia invasiva, e ii) alterações morfológicas, mediante técnicas clássicas de histologia e imuno-histoquímica. Verificamos que a instilação de partículas de sílica (10 mg) causou aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonar, bem como de hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina, em tempos que variaram de 2 a 28 dias. Observamos uma correlação temporal com as alterações morfológicas no tecido pulmonar, que refletiram presença de resposta inflamatória e infiltrado celular intenso, seguidos de progressiva fibrose e formação de granulomas. Os tempos de 7 e 28 dias pós-estimulação com sílica foram selecionados para os ensaios subsequentes, por corresponderem às fases aguda e crônica da silicose experimental, respectivamente. Foram detectados níveis elevados de óxido nítrico (NO), bem como de peroxinitrito/expressão da enzima iNOS no lavado broncoalveolar e no tecido pulmonar de camundongos estimulados com sílica, respectivamente. Em outro grupo de experimentos, observamos que camundongos depletados para o gene codificante para a enzima NOS induzida (iNOS) apresentaram abolidas as respostas de aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonares, bem como da hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina em comparação aos animais selvagens (C57BL/6). A inibição da resposta inflamatória e fibrótica granulomatosa foi também notada no caso dos animais nocautes para iNOS. O tratamento com 1400W, um inibidor da enzima iNOS, diminui de forma marcada as alterações de função pulmonar e fibrose tecidual verificadas nos camundongos silicóticos. Em conclusão, nossos resultados mostram que o comprometimento da função pulmonar, representado pelo aumento na resistência/elastância e hiper-reatividade das vias aéreas, mostraram-se correlacionados à maior geração de NO e de peroxinitrito, assim como da expressão da enzima iNOS. A depleção do gene codificante ou, ainda, o bloqueio da enzima iNOS aboliram a resposta de comprometimento da função pulmonar e fibrose tecidual na silicose experimental. Em conjunto estes achados indicam que o NO parece ser um mediador importante no contexto da silicose, colocando-se como um alvo terapêutico em potencial no tratamento de doenças de caráter fibrótico.

Avaliação estereológica glomerular em rins de ratos após isquemia-reperfusão por clampeamento arteriovenoso e arterial

A técnica de isquemia-reperfusão tem sido utilizada em cirurgias conservadoras do rim como a nefrectomia parcial e em transplantes renais. Para se realizar a isquemia pode-se fazer o bloqueio do fluxo sanguíneo da artéria renal ou o bloqueio simultâneo da artéria e da veia renal. O evento isquêmico acarreta em dano celular ao rim principalmente pelo estresse oxidativo local e a liberação de radicais livres assim como o aumento da resposta inflamatória. Diversos autores verificaram lesão renal após a isquemia-reperfusão, porém, apenas testes funcionais foram realizados até o momento. Os autores que tentaram avaliar a lesão morfológica do rim apenas fizeram a quantificação de escores subjetivos. O nosso objetivo é avaliar por quantificação estereológica o dano causado pela isquemia-reperfusão comparando o clampeamento somente arterial com o clampeamento arteriovenoso. Utilizamos 24 ratos wistar, machos, de quatro meses de idade. Os animais foram divididos em três grupos: o grupo Sham (n=8), o grupo de clampeamento somente da artéria renal (n=8) e o grupo de clampeamento simultâneo da artéria e da veia renal (n=8). Os animais foram submetidos a laparotomia mediana. Os animais do grupo Sham permaneceram os 60 minutos anestesiados mas sem obstrução do fluxo sanguíneo de seus vasos renais. Os animais do grupo de clampeamento arterial foram submetidos à clampeamento de sua arterial renal esquerda por 60 minutos e os animais do grupo de clampeamento arterial e venoso tiveram seus vasos renais esquerdos clampeados simultaneamente e em bloco pelo mesmo tempo. Após os 60 minutos os animais foram suturados e mantidos por 30 dias em caixas próprias sendo mortos por sobredose anestésica após decorrido esse tempo. Os rins foram coletados e mantidos em solução de formalina tamponada e posteriormente processados para análise histológica e estereológica. Foram analisados a densidade volumétrica (Vv) dos glomérulos, o número de glomérulos/mm3(Nv) e o volume glomerular médio (VGM). A Vv e Nv se encontrou reduzida nos rins esquerdos submetidos à isquemia mas foi somente significativa nos animais do grupo de clampeamento arterial e venoso. Mesmo usando o rato como modelo animal experimental, a partir de nossos resultados recomendamos o uso do clampeamento somente arterial nos casos em que mínina lesão ao rim é imperiosa.

Efeitos tardios no tecido ovariano de ratas Wistar após tratamento com Docetaxel e Ciclofosfamida

O câncer de mama (CM) é o segundo tipo de câncer mais comum no mundo. Sabe-se que a maior incidência de CM ocorre nas mulheres pós-menopausa, entretanto é crescente o número de mulheres jovens acometidas por esta doença. O tratamento do CM pode incluir: quimioterapia, radioterapia e/ou hormonioterapia. A quimioterapia, por se ser um tratamento sistêmico, pode causar importantes efeitos colaterais, entre eles a falência ovariana induzida por quimioterapia (FOIQ). As principais consequências da FOIQ são a infertilidade, além de complicações tardias relacionadas à diminuição do estrogênio, como a osteoporose e doenças cardiovasculares. O regime quimioterápico TC, adota a associação do docetaxel com a ciclofosfamida, como uma opção por fármacos que resultem numa taxa de sobrevida livre do câncer, e menores efeitos colaterais. Este trabalho teve como objetivo estudar os efeitos tardios no ovário causados pelo tratamento com a associação dos quimioterápicos docetaxel e ciclofosfamida (TC), em modelo animal com ratos Wistar. Para verificar o sinergismo desses quimioterápicos e assim analisar o efeito da administração conjunta, ratos Wistar fêmeas foram divididos em dois grupos: um grupo controle e um grupo que recebeu quimioterapia (TC). Os animais foram submetidos a eutanasia cinco meses após o fim do tratamento, e foram recolhidos o plasma e os ovários. Foram observadas alterações importantes. O nível de estradiol no plasma foi significativamente reduzido no grupo de TC em comparação com o grupo controle. Além disso, o número de núcleos apoptóticos foi maior no grupo TC. O papel da resposta inflamatória no desenvolvimento da lesão ovariana foi também investigado, e notou-se um aumento do número de mastócitos, e aumento da expressão de Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-α) no grupo TC. O envolvimento de fibrose nesse processo, foi também investigado. Os resultados mostraram que níveis de expressão de Fator de Crescimento Tumoral-β1 (TGF-β1), Colágeno Tipo I (Col-I) e Colágeno Tipo III (Col-III) estavam maiores no grupo TC em comparação com o grupo de controle. A análise ultraestrutural revelou a presença de feixes de colágeno no grupo tratado, e mostrou que a arquitetura do tecido do ovário estava mais desorganizada neste grupo comparado ao grupo controle. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a combinação de ciclofosfamida e docetaxel, um recente regime quimioterápico proposto para o tratamento do CM, pode levar a importantes alterações no ovário. O processo inflamatório, desencadeado pela administração dos quimioterápicos, estimula a apoptose e liberação de TGF-β no estroma ovariano, que induz a produção de matriz extracelular e subsequente, substituição do tecido sadio por tecido fibrótico. A principal consequência deste processo é a diminuição, ou perda, da função ovariana, levando à menopausa precoce e possível infertilidade. É importante compreender os mecanismos envolvidos na infertilidade provocada pelo regime TC, a fim de estudar novos métodos que evitem este efeito indesejável em mulheres submetidas a tratamento do CM.

Estudo do perfil salivar proteico de crianças obesas pré-púberes com foco nas alterações de mediadores da metainflamação

O objetivo deste estudo foi investigar na saliva de crianças pré-púberes obesas, em comparação com crianças eutróficas, a presença de possíveis diferenças na expressão de mediadores proteicos relacionados à metainflamação através de um estudo observacional transversal. Foram selecionadas 105 crianças pré-púberes com idade entre 5 e 9 anos, sem quaisquer outros comprometimentos sistêmicos ou bucais sendo realizada a mensuração do comprimento da circunferência da cintura (CC), além do peso e estatura para cálculo do IMC e seu escore Z (zscore IMC), de forma a compor 3 grupos: EU - eutrofia (-2SD≤ zscore IMC≤1SD), SP - sobrepeso (1SD < zscore IMC < 2SD) e OB obesidade (zscore IMC ≥ 2SD). Após o exame médico e odontológico foi feita a coleta de sangue e de saliva total não estimulada, de forma protocolada. Amostras séricas e salivares foram analisadas, individualmente, para a dosagem de IL1β, IL6, IL8. IL10, IL12p70, TNFα, MCP1, leptina, grelina e insulina, por Multiplex e adiponectina total e de alto peso molecular (adipoHMW), por ELISA. Além disso, as amostras séricas foram utilizadas para o delineamento hemodinâmico dos pacientes. As amostras salivares de EU e OB foram também analisadas em pools por espectrometria de massa (MS) e a presença de algumas proteínas foi validada por imunoblotting, para a comparação do perfil salivar proteico. As concentrações dos analitos foram comparadas tanto entre os grupos (teste de Kruswall-Wallis), como em relação ao zscore IMC e ao CC (Correlação de Spearman ou Pearson). Dos 12 analitos, somente a adipoHMW não foi detectada em nenhuma das amostras salivares. Na comparação OBxEU houve aumento na concentração total de proteínas salivares, da insulina e leptina sérica e salivar e do MCP1, além de diminuição da adiponectina sérica total e de adipoHMW e uma menor relação adiponectina/leptina (A/L) no grupo OB. As principais correlações obtidas com o zscore IMC foram com as concentrações séricas e salivares de insulina e leptina (positivas) e com a relação A/L (negativa), observando-se também a correlação negativa com a adiponectina total e adipoHMW séricas. Na comparação entre as concentrações séricas e salivares, foi possível detectar correlação positiva entre as dosagens de insulina e leptina, assim como com os valores da relação A/L. Na análise proteômica por MS foram identificadas 670 proteínas, sendo 163 delas com expressão diferenciada na saliva de OB em relação a EU. Dentre estas, encontram-se alteradas proteínas relacionadas à resposta inflamatória humoral, em especial com a via alternativa do sistema complemento e do metabolismo redox. Foram selecionadas três destas proteínas para validação por imunoblotting, que confirmou o aumento do Fator H e a diminuição do Fator B e da tioredoxina na saliva de OB em relação a EU. Considerando os resultados, podemos verificar que embora com menores concentrações absolutas dos mediadores, a saliva mostrou praticamente as mesmas associações observadas no sangue, em especial para a insulina, leptina e relação A/L, sendo possível admitir que a análise salivar venha a ser um bom método diagnóstico não invasivo para a obesidade infantil.

ExoU, uma proteína do sistema de secreção do tipo III de Pseudomonas aeruginosa, induz a secreção de eicosanóides por células epiteliais respiratórias. Papel dos corpúsculos lipídicos neste processo

Para pesquisar o papel de ExoU no desencadeamento de resposta inflamatória nas vias aéreas, células epiteliais respiratórias humanas (CERs) da linhagem BEAS-2B foram tratadas com AA radiomarcado e infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa, que secreta ExoU, e com os mutantes PA103exoU (com deleção do gene exoU), PA103ΔUT/exoU (com deleção de exoU e complementação com o gene funcional) e PA103UT/S142A (com deleção de exoU e complementação com gene com mutagênese sítio-específica no domínio catalítico da enzima). Após 1 hora, a liberação de AA pelas culturas infectadas com as cepas produtoras de ExoU foi significativamente superior à observada em culturas infectadas pelas cepas não-produtoras ou por células controle. O tratamento das bactérias com MAFP, um inibidor de PLA2, resultou em significativa redução na liberação de AA. Células infectadas pelas cepas PA103 e PA103ΔUT/exoU secretaram PGE2 e LTB4 em concentrações significativamente maiores que as secretadas por células infectadas pelas demais cepas ou não infectadas. O tratamento com o MAFP reduziu significativamente a secreção de PGE2. A análise, por citometria de fluxo, de células infectadas e não infectadas tratadas com anticorpo anti-COX-2 mostrou que o percentual de células infectadas por PA103 marcadas foi significativamente superior ao percentual encontrado em culturas controle. Nenhuma diferença foi observada quanto ao percentual de células marcadas em culturas infectadas por PA103ΔexoU. O tratamento das culturas com NS-398 (um inibidor seletivo de COX-2) resultou na diminuição significativa da concentração de PGE2, secretada por células infectadas com PA103, mas não por células infectadas com PA103ΔexoU ou por células controle. Corpúsculos lipídicos (CLs) são domínios citoplasmáticos ricos em COX-2 e outras enzimas responsáveis pelo metabolismo do AA, sede da produção de eicosanóides. Como células infectadas pelas cepas produtoras de ExoU liberam AA livre, formulamos a hipótese de que a maior produção de eicosanóides por estas células seria dependente da indução do aumento no número dos CLs. No entanto, a análise por citometria de fluxo de células tratadas com uma sonda lipofílica com afinidade com os CLs mostrou que o percentual de células marcadas em culturas infectadas pelas cepas produtoras de ExoU foi significativamente inferior ao percentual em culturas controle ou infectadas pelas outras 2 cepas bacterianas. O tratamento das células com MAFP inibiu significativamente a redução do percentual de células contendo CLs. A análise, por citometria de fluxo, de células controle ou infectadas tratadas simultaneamente com a sonda lipofílica e com o anticorpo anti-PGE2, mostrou, em células infectadas com PA103, a redução da mediana da intensidade de marcação com a sonda lipofílica e o aumento da mediana da intensidade de marcação com o anticorpo anti-PGE2. Nossa hipótese é que a presença de ExoU nas células infectadas com a cepa PA103 resulte no metabolismo de glicerofosfolipídios presente nos CLs levando à diminuição da afinidade dos CLs pela sonda lipofílica e à síntese local de PGE2.

Electrospun fibrous mats for skin and abdominal wall repair

Esta tese centra-se no desenvolvimento de materiais biodegradáveis e nãodegradáveis produzidos por eletrofiação com aplicação na área biomédica. O poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV), um poliéster biodegradável, foi selecionado como base dos materiais biodegradáveis, enquanto o poli(tereftalato de etileno) (PET), um polímero sintético, estável e biocompatível, foi selecionado para a produção das matrizes não degradáveis. Adicionou-se quitosana aos sistemas com o objetivo de melhorar o processo de eletrofiação e as propriedades morfológicas, físico-químicas e biológicas dos materiais resultantes. A composição química, bem como as características morfológicas e físicoquímicas dos materiais em estudo, foram manipuladas de modo a otimizar a sua performance como suportes celulares para engenharia de tecidos. Foram realizados estudos in vitro com cultura de fibroblastos L929 para avaliar o comportamento das células, i.e. viabilidade, adesão, proliferação e morte, quando cultivadas nas matrizes produzidas por eletrofiação. Adicionalmente foram realizados ensaios in vivo para investigar o potencial dos materiais em estudo na regeneração cutânea e como tela abdominal. Os principais resultados encontrados incluem: o desenvolvimento de novas matrizes híbridas (PHBV/quitosana) adequadas ao crescimento de fibroblastos e ao tratamento de lesões de pele; o desenvolvimento de um sistema de eletrofiação com duas seringas para a incorporação de compostos bioativos; diversas estratégias para manipulação das características morfológicas dos materiais de PHBV/quitosana e PET/quitosana produzidos por eletrofiação; uma melhoria do conhecimento das interações fibroblastos-suporte polimérico; a verificação de uma resposta inflamatória desencadeada pelos materiais nãodegradáveis quando utilizados no tratamento de defeitos da parede abdominal, o que sugere a necessidade de novos estudos para avaliar a segurança do uso de biomateriais produzidos por eletrofiação.