Anestésicos locais

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Pathogenicity of Salmonella: SopE-mediated membrane ruffling is independent of inositol phosphate signals

Studies [Zhou, D. Chen, L.-M. Hernandez, L. Shears, S.B. and Galán, J.E. (2001) A Salmonella inositol polyphosphatase acts in conjunction with other bacterial effectors to promote host-cell actin cytoskeleton rearrangements and bacterial internalization. Mol. Microbiol. 39, 248-259] with engineered Salmonella mutants showed that deletion of SopE attenuated the pathogen's ability to deplete host-cell InsP5 and remodel the cytoskeleton. We pursued these observations: In SopE-transfected host-cells, membrane ruffling was induced, but SopE did not dephosphorylate InsP5, nor did it recruit PTEN (a cytosolic InsP5 phosphatase) for this task. However, PTEN strengthened SopE-mediated membrane ruffling. We conclude SopE promotes host-cell InsP5 hydrolysis only with the assistance of other Salmonella proteins. Our demonstration that Salmonella-mediated cytoskeletal modifications are independent of inositolphosphates will focus future studies on elucidating alternate pathogenic consequences of InsP5 metabolism, including ion channel conductance and apoptosis.

Ca2+-independent phospholipase A2-dependent gating of TRPM8 by lysophospholipids

TRPM8 represents an ion channel activated by cold temperatures and cooling agents, such as menthol, that underlies the cold-induced excitation of sensory neurons. Interestingly, the only human tissue outside the peripheral nervous system, in which the expression of TRPM8 transcripts has been detected at high levels, is the prostate, a tissue not exposed to any essential temperature variations. Here we show that the TRPM8 cloned from human prostate and heterologously expressed in HEK-293 cells is regulated by the Ca(2+)-independent phospholipase A(2) (iPLA(2)) signaling pathway with its end products, lysophospholipids (LPLs), acting as its endogenous ligands. LPLs induce prominent prolongation of TRPM8 channel openings that are hardly detectable with other stimuli (e.g. cold, menthol, and depolarization) and that account for more than 90% of the total channel open time. Down-regulation of iPLA(2) resulted in a strong inhibition of TRPM8-mediated functional responses and abolished channel activation. The action of LPLs on TRPM8 channels involved either changes in the local lipid bilayer tension or interaction with the critical determinant(s) in the transmembrane channel core. Based on this, we propose a novel concept of TRPM8 regulation with the involvement of iPLA(2) stimulation. This mechanism employs chemical rather than physical (temperature change) signaling and thus may be the main regulator of TRPM8 activation in organs not exposed to any essential temperature variations, as in the prostate gland.

Inward rectifier potassium channels in the HL-1 cardiomyocyte-derived cell line.

HL-1 is a line of immortalized cells of cardiomyocyte origin that are a useful complement to native cardiomyocytes in studies of cardiac gene regulation. Several types of ion channel have been identified in these cells, but not the physiologically important inward rectifier K(+) channels. Our aim was to identify and characterize inward rectifier K(+) channels in HL-1 cells. External Ba(2+) (100?µM) inhibited 44?±?0.05% (mean?±?s.e.m., n?=?11) of inward current in whole-cell patch-clamp recordings. The reversal potential of the Ba(2+)-sensitive current shifted with external [K(+)] as expected for K(+)-selective channels. The slope conductance of the inward Ba(2+)-sensitive current increased with external [K(+)]. The apparent Kd for Ba(2+) was voltage dependent, ranging from 15?µM at -150 ?mV to 148?µM at -75 ?mV in 120 ?mM external K(+). This current was insensitive to 10?µM glybenclamide. A component of whole-cell current was sensitive to 150?µM 4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid (DIDS), although it did not correspond to the Ba(2+)-sensitive component. The effect of external 1 mM Cs(+) was similar to that of Ba(2+). Polymerase chain reaction using HL-1 cDNA as template and primers specific for the cardiac inward rectifier K(ir)2.1 produced a fragment of the expected size that was confirmed to be K(ir)2.1 by DNA sequencing. In conclusion, HL-1 cells express a current that is characteristic of cardiac inward rectifier K(+) channels, and express K(ir)2.1 mRNA. This cell line may have use as a system for studying inward rectifier gene regulation in a cardiomyocyte phenotype.

Organizational structure and the periphery of the gene regulatory network in B-cell lymphoma

Background:
The physical periphery of a biological cell is mainly described by signaling pathways which are triggered by transmembrane proteins and receptors that are sentinels to control the whole gene regulatory network of a cell. However, our current knowledge about the gene regulatory mechanisms that are governed by extracellular signals is severely limited.Results: The purpose of this paper is three fold. First, we infer a gene regulatory network from a large-scale B-cell lymphoma expression data set using the C3NET algorithm. Second, we provide a functional and structural analysis of the largest connected component of this network, revealing that this network component corresponds to the peripheral region of a cell. Third, we analyze the hierarchical organization of network components of the whole inferred B-cell gene regulatory network by introducing a new approach which exploits the variability within the data as well as the inferential characteristics of C3NET. As a result, we find a functional bisection of the network corresponding to different cellular components.

Conclusions:
Overall, our study allows to highlight the peripheral gene regulatory network of B-cells and shows that it is centered around hub transmembrane proteins located at the physical periphery of the cell. In addition, we identify a variety of novel pathological transmembrane proteins such as ion channel complexes and signaling receptors in B-cell lymphoma. © 2012 Simoes et al.; licensee BioMed Central Ltd.

The Role of K+ and Cl- Channels in the Regulation of Retinal Arteriolar Tone and Blood Flow

Purpose: This study tested the role of K(+)- and Cl(-)-channels in retinal arteriolar smooth muscle in the regulation of retinal blood flow.

Methods: Studies were carried out in adult Male Hooded Lister rats. Selectivity of ion channel blockers was established using electrophysiological recordings from smooth muscle in isolated arterioles under voltage clamp conditions. Leukocyte velocity and retinal arteriolar diameters were measured in anesthetised animals using leukocyte fluorography and fluorescein angiography imaging with a confocal scanning laser ophthalmoscope. These values were used to estimate volumetric flow, which was compared between control conditions and following intravitreal injections of ion channel blockers, either alone or in combination with the vasoconstrictor potent Endothelin 1 (Et1).

Results: Voltage activated K(+)-current (IKv) was inhibited by correolide, large conductance (BK) Ca(2+)-activated K(+)-current (IKCa) by Penitrem A, and Ca(2+)-activated Cl(-)-current (IClCa) by disodium 4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonate (DIDS). Intravitreal injections (10µl) of DIDS (estimated intraocular concentration 10mM) increased flow by 22%, whereas the BK-blockers Penitrem A (1µM) and iberiotoxin (4µM), and the IKv-inhibitor correolide (40µM) all decreased resting flow by approximately 10%. Et1 (104nM) reduced flow by almost 65%. This effect was completely reversed by DIDS but was unaffected by Penitrem A, iberiotoxin or correolide.

Conclusions: These results suggest that Cl(-)-channels in retinal arteriolar smooth muscle limit resting blood flow and play an obligatory role in Et1 responses. K(+)-channel activity promotes basal flow but exerts little modifying effect on the Et1 response. Cl(-)-channels may be appropriate molecular targets in retinal pathologies characterised by increased Et1 activity and reduced blood flow.

AaeAP1 and AaeAP2: Novel Antimicrobial Peptides from the Venom of the Scorpion, Androctonus aeneas: Structural Characterisation, Molecular Cloning of Biosynthetic Precursor-Encoding cDNAs and Engineering of Analogues with Enhanced Antimicrobial and Anticancer Activities

The main functions of the abundant polypeptide toxins present in scorpion venoms are the debilitation of arthropod prey or defence against predators. These effects are achieved mainly through the blocking of an array of ion channel types within the membranes of excitable cells. However, while these ion channel-blocking toxins are tightly-folded by multiple disulphide bridges between cysteine residues, there are additional groups of peptides in the venoms that are devoid of cysteine residues. These non-disulphide bridged peptides are the subject of much research interest, and among these are peptides that exhibit antimicrobial activity. Here, we describe two novel non-disulphide-bridged antimicrobial peptides that are present in the venom of the North African scorpion, Androctonus aeneas. The cDNAs encoding the biosynthetic precursors of both peptides were cloned from a venom-derived cDNA library using 3'- and 5'-RACE strategies. Both translated precursors contained open-reading frames of 74 amino acid residues, each encoding one copy of a putative novel nonadecapeptide, whose primary structures were FLFSLIPSVIAGLVSAIRN and FLFSLIPSAIAGLVSAIRN, respectively. Both peptides were C-terminally amidated. Synthetic versions of each natural peptide displayed broad-spectrum antimicrobial activities, but were devoid of antiproliferative activity against human cancer cell lines. However, synthetic analogues of each peptide, engineered for enhanced cationicity and amphipathicity, exhibited increases in antimicrobial potency and acquired antiproliferative activity against a range of human cancer cell lines. These data clearly illustrate the potential that natural peptide templates provide towards the design of synthetic analogues for therapeutic exploitation.

Three motAB stator gene products in Bdellovibrio bacteriovorus contribute to motility of a single flagellum during predatory and prey-independent growth

The predatory bacterium Bdellovibrio bacteriovorus uses flagellar motility to locate regions rich in Gram-negative prey bacteria, colliding and attaching to prey and then ceasing flagellar motility. Prey are then invaded to form a "bdelloplast" in a type IV pilus-dependent process, and prey contents are digested, allowing Bdellovibrio growth and septation. After septation, Bdellovibrio flagellar motility resumes inside the prey bdelloplast prior to its lysis and escape of Bdellovibrio progeny. Bdellovibrio can also grow slowly outside prey as long flagellate host-independent (HI) cells, cultured on peptone-rich media. The B. bacteriovorus HD100 genome encodes three pairs of MotAB flagellar motor proteins, each of which could potentially form an inner membrane ion channel, interact with the FliG flagellar rotor ring, and produce flagellar rotation. In 2004, Flannagan and coworkers (R. S. Flannagan, M. A. Valvano, and S. F. Koval, Microbiology 150:649-656, 2004) used antisense RNA and green fluorescent protein (GFP) expression to downregulate a single Bdellovibrio motA gene and reported slowed release from the bdelloplast and altered motility of the progeny. Here we inactivated each pair of motAB genes and found that each pair contributes to motility, both predatorily, inside the bdelloplast and during HI growth; however, each pair was dispensable, and deletion of no pair abolished motility totally. Driving-ion studies with phenamil, carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), and different pH and sodium conditions indicated that all Mot pairs are proton driven, although the sequence similarities of each Mot pair suggests that some may originate from halophilic species. Thus, Bdellovibrio is a "dedicated motorist," retaining and expressing three pairs of mot genes.

An in vitro model of nociceptors in human trigeminal nerves

Background: The oro-facial region is densely innervated by the trigeminal nerve, which when stimulated can induce noxious pain sensation and contribute to neurogenic inflammation in local tissues. Recent research on the expression of specialised ion channels on the trigeminal nerve has highlighted the need to undertake more extensive studies on ion channel expression/functionality with the aim of elucidating their role in pain sensations. A major family of such ion channels is the transient receptor potential (TRP) channels which are activated by a wide variety of thermal, mechanical or chemical stimuli and merit investigation as possible druggable targets for future analgesics.
Objective: Study of TRP channel expression and regulation in oro-facial tissues is hindered by the fact that the cell bodies of neurons innervating these tissues are located in the trigeminal ganglion. Using dental pulp stem cells differentiated towards peripheral neuronal equivalents (PNEs), we sought to determine TRP channel expression, functionality and potential modulation by cytokines in this novel model.
Method: Dental pulp stem cells (DPSCs) were grown on substrate-coated tissue culture plates and differentiated towards a neuronal phenotype using neuronal induction media. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was performed on PNEs +/-cytokine treatment. Ion channel functionality was investigated using whole cell patch clamping.
Result: qPCR analysis showed that PNEs expressed the TRP channels TRPA1, TRPV1, TRPV4 and TRPM8. TRPA1 was the most abundantly expressed TRP channel studied whereas TRPM8 was lowly expressed. TRP channel expression was shown to be regulated by treatment with inflammatory cytokines. Patch clamp studies using specific agonists and antagonists for TRPA1 and TRPV1 showed these channels were functional.
Conclusion: PNEs differentiated from DPSCs provide a suitable model for TRP channel expression, regulation, and sensistisation in oro-facial tissues. This human neuronal model has potential for use in pre-clinical studies of novel analgesics.

Estudo exploratório da excitabilidade axonal com a "técnica threshold tracking" : controlos saudáveis e doentes com polineuropatia amilóide familiar

Tese de mestrado, Neurociências, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2015

Rôle de l’extrémité C-terminale dans l’expression du canal calcique Cav1.2 à la membrane plasmique

Le canal calcique de type L, Cav1.2, joue un rôle clé dans le couplage excitation-contraction des myocytes ventriculaires. Il a été montré que la sous-unité Cavα1 était sujette à l’épissage alternatif et que ce phénomène pouvait mener à une protéine tronquée en C-terminal au niveau de l’exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). D’autres groupes ont étudié différentes délétions au niveau de l’extrémité C-terminale (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). Les courants mesurés dans la configuration cellule entière, était significativement plus grands que le canal « pleine longueur ». Nous avons décidé de tester certaines de ces délétions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) en présence ou en absence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, susceptible d’interagir avec l’extrémité C-terminale de la sous-unité Cavα1 par l’intermédiaire de son domaine SH3 (Lao, Kobrinsky et al. 2008). Les résultats obtenus dans les ovocytes de Xénope ont mis en évidence que les sous-unités Cavα1.2 tronquées montraient des courants globaux plus élevés que le canal « pleine longueur » en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3 et que les sous-unités Cavα1.2 tronquées donnaient des courants en absence de la sous-unité Cavβ3 contrairement à la sous-unité Cavα1.2 « pleine longueur ». Afin de vérifier si l’augmentation des courants macroscopiques était le résultat d’une augmentation du nombre de sous-unités Cavα1.2 à la membrane, nous avons choisi de quantifier la fluorescence spécifiquement due à cette sous-unité en utilisant la méthode de cytométrie de flux (FACS : « Fluorescence Activated Cell Sorting »). L’épitope HA a été inséré dans une région extracellulaire de la sous-unité Cavα1 du canal calcique Cav1.2 et un anticorps anti-HA couplé au FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») a été utilisé pour observer la fluorescence. Nos résultats confirment que la sous-unité Cavα1-HA du canal calcique Cav1.2, s’exprime à la membrane plasmique en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, et qu’en absence de celle-ci, ne s’exprime que peu ou pas à la membrane. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les trois délétions testées dans les mêmes conditions soit Cavα1.2-HA ΔC1935, Cavα1.2-HA ΔC1856 et Cavα1.2-HA ΔC1733. Ensemble, ces résultats suggèrent que l’augmentation des courants macroscopiques observés après une délétion partielle du C-terminal n’est pas causée par une augmentation du nombre de protéines Cavα1.2 à la membrane.

Influence des glycines du lien S4-S5 sur le couplage électromécanique des canaux ioniques dépendants du voltage

Les canaux potassiques dépendants du voltage sont formés de quatre sous-unités, chacune possédant six segments transmembranaires (S1-S6) et une boucle (p-loop) qui se trouve entre le cinquième et le sixième segment au niveau du pore. Il est connu que le segment senseur du voltage (S1-S4) subit un mouvement lorsque le potentiel membranaire change. Pour ouvrir le canal, il est nécessaire de transférer l'énergie du senseur du voltage (généré par le mouvement des charges positives de S4) au pore. Le mécanisme exact de ce couplage électromécanique est encore sous étude. Un des points de liaison entre le senseur de voltage et le pore est le lien physique fait par le segment S4-S5 (S45L). Le but de cette étude est de déterminer l'influence de la flexibilité du segment S45L sur le processus de couplage. Dans le S45L, trois glycines sont distribuées dans des positions différentes. Elles sont responsables de la flexibilité des hélices-alpha. Ces glycines (mais pas leurs positions exactes) sont conservées pour tous les canaux potassiques dépendants de potentiel. En utilisant la technique de mutagènes dirigé, la glycine a été remplacée dans chacune de ces différentes positions par une alanine et dans une deuxième étape, par une proline (pour introduire un angle dans l'hélice). Pour étudier le comportement des canaux dans cette nouvelle conformation, on a appliqué la technique de « patch clamp » pour déterminer les effets lors de l'ouverture du pore (courant ionique). Avec le « cut-open oocyte voltage-clamp », nous avons étudié les effets sur le mouvement du senseur de voltage (courant “gating”) et la coordination temporelle avec l'ouverture du pore (courant ionique). Les données ont montré qu’en réduisant la flexibilité dans le S45L, il faut avoir plus d'énergie pour faire ouvrir le canal. Le changement pour une proline suggère que le mouvement du senseur est indépendant du pore pendant l'ouverture du canal.

Étude du couplage entre les sous-unités du canal potassique KcsA par des mesures de spectroscopie de fluorescence en canal unitaire

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Étude structurale et fonctionnelle du canal potassium dépendant du voltage KvAP

Les canaux ioniques dépendants du voltage sont responsables de l'initiation et de la propagation des potentiels d'action dans les cellules excitables. De nombreuses maladies héréditaires (channelopathies) sont associées à un contrôle défectueux du voltage par ces canaux (arythmies, épilepsie, etc.). L’établissement de la relation structure-fonction exacte de ces canaux est donc crucial pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques spécifiques. Dans ce contexte, le canal procaryote dépendant du voltage et sélectif au potassium KvAP a servi de modèle d’étude afin d’approfondir i) le processus du couplage électromécanique, ii) l’influence des lipides sur l’activité voltage-dépendante et iii) l’inactivation de type closed-state. Afin de pallier à l’absence de données structurales dynamiques du côté cytosolique ainsi que de structure cristalline dans l’état fermé, nous avons mesuré le mouvement du linker S4-S5 durant le gating par spectroscopie de fluorescence (LRET). Pour ce faire, nous avons utilisé une technique novatrice du contrôle de l’état conformationnel du canal en utilisant les lipides (phospholipides et non phospholipides) au lieu du voltage. Un modèle dans l’état fermé a ainsi été produit et a démontré qu’un mouvement latéral modeste de 4 Å du linker S4-S5 est suffisant pour mener à la fermeture du pore de conduction. Les interactions lipides - canaux jouent un rôle déterminant dans la régulation de la fonction des canaux ioniques mais ne sont pas encore bien caractérisées. Nous avons donc également étudié l’influence de différents lipides sur l’activation voltage - dépendante de KvAP et mis en évidence deux sites distincts d’interactions menant à des effets différents : au niveau du senseur de voltage, menant au déplacement de la courbe conductance-voltage, et du côté intracellulaire, influençant le degré de la pente de cette même courbe. Nous avons également démontré que l’échange de lipides autour de KvAP est extrêmement limité et affiche une dépendance à l’état conformationnel du canal, ne se produisant que dans l’état ouvert. KvAP possède une inactivation lente particulière, accessible depuis l'état ouvert. Nous avons étudié les effets de la composition lipidique et de la température sur l'entrée dans l'état inactivé et le temps de récupération. Nous avons également utilisé la spectroscopie de fluorescence (quenching) en voltage imposé afin d'élucider les bases moléculaires de l’inactivation de type closed-state. Nous avons identifié une position à la base de l’hélice S4 qui semble impliquée à la fois dans le mécanisme responsable de ce type d'inactivation et dans la récupération particulièrement lente qui est typique du canal KvAP.

Physiological analysis of central and peripheral insect circadian pacemaker neurons

Alle bisher untersuchten Lebewesen besitzen (circadiane) innere Uhren, die eine endogene Perioden-länge von ungefähr 24 Stunden generieren. Eine innere Uhr kann über Zeitgeber mit der Umwelt synchronisiert werden und ermöglicht dem Organismus, rhythmische Umweltveränderungen vorweg zu nehmen. Neben einem zentralen Schrittmacher, der Physiologie und Verhalten des Organismus steuert, gibt es in unterschiedlichen Organen auch periphere Uhren, die die zeitlichen Abläufe in der spezifischen Funktion dieser Organe steuern. In dieser Arbeit sollten zentrale und periphere Schrittmacherneurone von Insekten physiologisch untersucht und verglichen werden. Die Neurone der akzessorischen Medulla (AME) von Rhyparobia maderae dienten als Modellsystem für zentrale Schrittmacher, während olfaktorische Rezeptorneurone (ORNs) von Manduca sexta als Modellsystem für periphere Schrittmacher dienten. Die zentralen Schrittmacherneurone wurden in extrazellulären Ableitungen an der isolierten AME (Netzwerkebene) und in Patch-Clamp Experimenten an primären AME Zellkulturen (Einzelzellebene) untersucht. Auf Netzwerkebene zeigten sich zwei charakteristische Aktivitätsmuster: regelmäßige Aktivität und Wechsel zwischen hoher und niedriger Aktivität (Oszillationen). Es wurde gezeigt, dass Glutamat ein Neurotransmitter der weitverbreiteten inhibitorischen Synapsen der AME ist, und dass in geringem Maße auch exzitatorische Synapsen vorkommen. Das Neuropeptid pigment-dispersing factor (PDF), das von nur wenigen AME Neuronen exprimiert wird und ein wichtiger Kopplungsfaktor im circadianen System ist, führte zu Hemmungen, Aktivierungen oder Oszillationen. Die Effekte waren transient oder langanhaltend und wurden wahrscheinlich durch den sekundären Botenstoff cAMP vermittelt. Ein Zielmolekül von cAMP war vermutlich exchange protein directly activated by cAMP (EPAC). Auf Einzelzellebene wurde gezeigt, dass die meisten AME Neurone depolarisiert waren und deshalb nicht feuerten. Die Analyse von Strom-Spannungs-Kennlinien und pharmakologische Experimente ergaben, dass unterschiedliche Ionenkanäle vorhanden waren (Ca2+, Cl-, K+, Na+ Kanäle sowie nicht-spezifische Kationenkanäle). Starke, bei hohen Spannungen aktivierende Ca2+ Ströme (ICa) könnten eine wichtige Rolle bei Ca2+-abhängiger Neurotransmitter-Ausschüttung, Oszillationen, und Aktionspotentialen spielen. PDF hemmte unterschiedliche Ströme (ICa, IK und INa) und aktivierte nicht-spezifische Kationenströme (Ih). Es wurde angenommen, dass simultane PDF-abhängige Hyper- und Depolarisationen rhythmische Membranpotential-Oszillationen verursachen. Dieser Mechanismus könnte eine Rolle bei PDF-abhängigen Synchronisationen spielen. Die Analyse peripherer Schrittmacherneurone konzentrierte sich auf die Charakterisierung des olfaktorischen Corezeptors von M. sexta (MsexORCO). In anderen Insekten ist ORCO für die Membran-Insertion von olfaktorischen Rezeptoren (ORs) erforderlich. ORCO bildet Komplexe mit den ORs, die in heterologen Expressionssystemen als Ionenkanäle fungieren und Duft-Antworten vermitteln. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass MsexORCO in pheromonsensitiven ORNs in vivo nicht als Teil eines ionotropen Rezeptors sondern als Schrittmacherkanal fungiert, der unterschwellige Membranpotential-Oszillationen generiert. MsexORCO wurde mit vermeintlichen Pheromonrezeptoren in human embryonic kidney (HEK 293) Zellen coexprimiert. Immuncytochemie und Ca2+ Imaging Experimente zeigten sehr schwache Expressionsraten. Trotzdem war es möglich zu zeigen, dass MsexORCO wahrscheinlich ein spontan-aktiver, Ca2+-permeabler Ionenkanal ist, der durch den ORCO-Agonisten VUAA1 und cyclische Nucleotide aktiviert wird. Außerdem wiesen die Experimente darauf hin, dass MsexOR-1 offensichtlich der Bombykal-Rezeptor ist. Eine weitere Charakterisierung von MsexORCO in primären M. sexta ORN Zellkulturen konnte nicht vollendet werden, weil die ORNs nicht signifikant auf ORCO-Agonisten oder -Antagonisten reagierten.