Interação estresse salino e aplicação exógena de espermidina nos teores de glicina betaína de Guandu

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Caracterização molecular de estirpes de rotavírus em rebanhos bovinos leiteiros e de corte das regiões Nordeste e Centro-oeste no Estado de São Paulo

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Biotecnologia para conservação ex-situ de plantas medicinais do Cerrado

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Encefalite viral induzida pelo vírus da dengue em camundongos suíços albinos: a resposta inflamatória do sistema nervoso central do hospedeiro neonato

Para estudar a resposta imune inata produzida especificamente no interior do SNC em desenvolvimento, evitando a influencia do sistema imune, empregamos modelo de infeccao viral induzida pela inoculacao intracerebral do virus da dengue em camundongos neonatos. Oito camundongos lactentes de dois dias de idade da espécie Mus musculus e variedade suica albina foram inoculados por via intracerebral com homogenado cerebral infectado com a especie Flavivirus (DENV3 genotipo III). Outro conjunto de animais foi utilizado como controle (nao infectado) e inoculado com igual volume de homogenado cerebral nao infectante e mantidos nas mesmas condicoes dos infectados. Decorridos 7 dias apos a infeccao os camundongos doentes foram sacrificados e tiveram seus cerebros processados para imunomarcacao de astrocitos e microglias. Quantificou-se a resposta imune glial no stratum lacunosum molecular (Lac Mol), radiatum (Rad) e pyramidale (Pir) de CA1-2 do hipocampo e na camada molecular do giro denteado (GDMol) usando o fracionador optico para estimar o numero de microglias e astrocitos em animais infectados e controles. Intensa astrocitose reativa e intensa ativacao microglial foram encontradas em animais neonatos com sinais clinicos de meningoencefalite. Entretanto, embora tenham sido maiores as estimativas do numero de microglias ativadas nos infectados (Inf) do que nos animais controles (Cont) nas camadas GDMol (Inf: 738,95 } 3,07; Cont: 232,73 } 70,38; p = 0,0035), Rad (Inf: 392,49 } 44,13; Cont: 62,76 } 15,86; p = 0,0004), em relacao ao numero total de microglias (ativadas ou nao) apenas o stratum radiatum mostrou diferença significante (Inf: 6.187,49 } 291,62; Cont: 4.011,89 } 509,73; p = 0,01). Por outro lado apenas a camada molecular do giro denteado mostrou diferenca no numero de astrocitos (Inf: 8.720,17 } 903,11; Cont: 13.023,13 } 1.192,14; p = 0,02). Tomados em conjunto os resultados sugerem que a resposta imune inata do camundongo neonato a encefalite induzida pelo virus da dengue (sorotipo 3, genotipo III) esta associada a um maior aumento do numero de microglias do que de astrocitos reativos e essa mudanca e dependente da camada e da regiao investigada. As implicacoes fisiopatologicas desses achados permanecem por ser investigadas.

Desarrollo del diagnóstico molecular de virus exantemáticos: epidemiología molecular del virus del sarampión en España

Programa de doctorado: Microbiología y parasitología.

Sistema nervoso enterico e scrapie sperimentale in ovini di razza sarda con diversa suscettibilità genetica nei confronti della malattia

Sebbene il sistema nervoso enterico (“enteric nervous system”, ENS) svolga un ruolo cruciale nella patogenesi della Scrapie ovina, non esistono tuttavia in letteratura dati sulle popolazioni cellulari progressivamente coinvolte nel corso dell’infezione, né sugli eventuali danni morfo-funzionali da esse subiti. Il presente studio è stato condotto sui plessi mienterici e sottomucosi dell’ileo di 46 pecore di razza Sarda, recanti diversi polimorfismi del gene Prnp (ARQ/ARQ, ARQ/AHQ, ARQ/ARR, ARR/ARR). I suddetti animali, infettati per os all’età di 8 mesi con un ceppo di Scrapie precedentemente caratterizzato nel topo, sono stati sacrificati mediante eutanasia a determinati intervalli di tempo post-infezione (p.i.). E’ stata quindi valutata, tramite immunoistochimica ed immunofluorescenza indiretta su sezioni tissutali e su preparati “wholemount”, l’immunoreattività (IR) nei confronti della PrPSc, del “marker” panneuronale Hu C/D, dell’ossido-nitrico sintetasi (nNOS), della calbindina (CALB) e della proteina fibrillare acida gliale (GFAP). In 8 pecore con genotipo ARQ/ARQ, clinicamente sane e sacrificate a 12-24 mesi p.i., nonché in 5 ovini clinicamente affetti (2 con genotipo ARQ/ARQ, 3 con genotipo ARQ/AHQ), questi ultimi sacrificati rispettivamente a 24, 36 e 40 mesi p.i., le indagini immunoistochimiche hanno consentito di dimostrare la presenza di PrPSc a livello sia dell’encefalo (obex), sia dell’ENS, in particolar modo nei plessi mienterici. In tali distretti il deposito della PrPSc risultava pienamente compatibile con un interessamento delle cellule enterogliali (“enteroglial cells”, EGCs), mentre occasionalmente si notava un contestuale coinvolgimento della componente neuronale ivi residente. In conclusione, i dati della presente indagine consentono di ipotizzare un verosimile coinvolgimento delle EGCs e dei neuroni residenti a livello dei plessi dell’ENS nella patogenesi della Scrapie sperimentale realizzata per os in ovini di razza Sarda.

Epatite E: ruolo del suino nella trasmissione dell'infezione all'uomo, studio di prevalenza in aree rurali della Bolivia

L’infezione da virus dell’ epatite E (HEV) nei suini e nell’uomo è stata segnalata in diversi Paesi. Nei suini, il virus causa infezioni asintomatiche, mentre nell’uomo è responsabile di epidemie di epatite ad andamento acuto nei Paesi a clima tropicale o subtropicale con condizioni igieniche scadenti, di casi sporadici in quelli sviluppati. HEV è stato isolato anche in diversi animali e l’analisi nucleotidica degli isolati virali di origine animale ha mostrato un elevato grado di omologia con i ceppi di HEV umani isolati nelle stesse aree geografiche, avvalorando l’ipotesi che l'infezione da HEV sia una zoonosi. In America del Sud HEV suino è stato isolato per la prima volta in suini argentini nel 2006, mentre solo dal 1998 esistono dati sull’ infezione da HEV nell’uomo in Bolivia. In questa indagine è stato eseguito uno studio di sieroprevalenza in due comunità rurali boliviane e i risultati sono stati confrontati con quelli dello studio di sieroprevalenza sopra menzionato condotto in altre zone rurali della Bolivia. Inoltre, mediante Nested RT-PCR, è stata verificata la presenza di HEV nella popolazione umana e suina. La sieroprevalenza per anticorpi IgG anti-HEV è risultata pari al 6,2%, molto simile a quella evidenziata nello studio precedente. La prevalenza maggiore (24%) si è osservata nei soggetti di età compresa tra 41 e 50 anni, confermando che l’ infezione da HEV è maggiore fra i giovani-adulti. La ricerca di anticorpi anti HEV di classe IgM eseguita su 52 sieri ha fornito 4 risultati positivi. Il genoma virale è stato identificato in uno dei 22 pool di feci umane e l'esame virologico di 30 campioni individuali fecali e 7 individuali di siero ha fornito rispettivamente risultati positivi in 4/30 e 1/7. La Nested RT-PCR eseguita sui 22 pool di feci suine ha dato esito positivo in 7 pool. L’analisi delle sequenze genomiche di tutti gli amplificati ha consentito di stabilire che gli isolati umani appartenevano allo stesso genotipo III di quelli suini e presentavano con questi una elevata omologia aminoacidica (92%).

Marker molecolari relativi all'infezione da Papillomavirus umani: significato diagnostico e prognostico in lesioni virus-correlate

Introduzione: Il cervico-carcinoma è la seconda neoplasia maligna per incidenza e mortalità nelle donne in tutto il mondo dopo il cancro al seno. L’infezione persistente da Papillomavirus Umani (HPV) è causa necessaria dell’insorgenza del cervico-carcinoma e delle sue lesioni pre-cancerose. L’infezione da HPV si associa anche ad altri carcinomi del distretto ano-genitale (a livello anale, vulvare, vaginale e del pene) e a circa il 25% dei carcinomi squamosi dell’orofaringe. I circa 40 genotipi di HPV che infettano la mucosa genitale vengono suddivisi in alto rischio (HR-HPV) e basso rischio (LR-HPV) oncogeno a seconda della alta e bassa associazione con la neoplasia cervicale. I 13 genotipi a più alto rischio oncogeno sono 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68. Di questi, otto (16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 e 58) sono associati alla maggior parte dei carcinomi cervicali (circa 89%) e i genotipi 16 e 18 da soli sono riscontrati nel 70% circa delle neoplasie. L’insorgenza e progressione delle lesioni preneoplastiche cervicali è, però, associata non solo alla presenza di HPV ad alto rischio, ma, soprattutto, alla persistenza virale (> 18 mesi), alla capacità di integrazione degli HPV ad alto rischio e alla conseguente sovraespressione delle oncoproteine E6/E7. Inoltre, l’integrazione è spesso favorita da un’alta carica virale soprattutto per quanto riguarda alcuni genotipi (HPV16 e 18). L’infezione da HPV non interessa solo la cervice uterina ma tutto il distretto ano-genitale e quello testa-collo. L’HPV, in particolare il genotipo 16, è implicato, infatti, nell’insorgenza delle lesioni preneoplastiche della vulva (VIN) classificate come VIN classiche e nei carcinomi ad esse associati. L’incidenza del carcinoma vulvare in Europa è di 1.5/100.000 di cui circa il 45% è dovuto a HR-HPV (80% ad HPV16). Nonostante l’associazione tra HPV16 e carcinoma vulvare sia alta, ancora poco si conosce sul ruolo della carica virale e dell’integrazione in tali lesioni. Le lesioni che possono presentarsi nella regione testa-collo possono essere sia di natura benigna che maligna. I genotipi più frequentemente riscontrati in associazione a lesioni benigne (papillomi) sono HPV 6 e 11, quelli associati a forme tumorali (HNSCC) sono il genotipo 18 ma soprattutto il 16. Molti aspetti del coinvolgimento di HPV in queste patologie non sono ancora perfettamente conosciuti e spesso studi su tale argomento hanno mostrato risultati contraddittori, soprattutto perché vengono utilizzate metodiche con gradi diversi di sensibilità e specificità. Recenti dati di letteratura hanno tuttavia messo in evidenza che i pazienti affetti da HNSCC positivi ad HPV hanno una elevata risposta al trattamento chemioradioterapico rispetto ai pazienti HPV-negativi con un notevole impatto sul controllo locale e sulla sopravvivenza ma soprattutto sulla qualità di vita di tali pazienti, evitando di sottoporli a chirurgia sicuramente demolitiva. Scopo del lavoro: Sulla base di queste premesse, scopo di questo lavoro è stato quello di valutare l’importanza di marker quali la presenza/persistenza di HPV, la carica virale, la valutazione dello stato fisico del genoma virale e l’espressione degli mRNA oncogeni nella gestione di pazienti con lesioni preneoplastiche e neoplastiche di diverso grado, associate a papillomavirus mucosi. Per la valutazione dei markers virologici di progressione neoplastica abbiamo sviluppato dei saggi di real time PCR qualitativi e quantitativi studiati in modo da poter fornire, contemporaneamente e a seconda delle esigenze, risposte specifiche non solo sulla presenza e persistenza dei diversi genotipi di HPV, ma anche sul rischio di insorgenza, progressione e recidiva delle lesioni mediante lo studio di markers virologici quali carica virale, integrazione ed espressione degli mRNA. Abbiamo pertanto indirizzato la nostra attenzione verso tre popolazioni specifiche di pazienti: - donne con lesioni vulvari preneoplastiche (VIN) e neoplastiche, allo scopo di comprendere i complessi meccanismi patogenetici di tali patologie non sempre associate ad infezione da HPV; - pazienti con lesioni maligne a livello della regione testa-collo allo scopo di fornire informazioni utili all’elaborazione di un percorso terapeutico mirato (radiochemioterapico o chirurgico) a seconda o meno della presenza di infezione virale; - donne con lesioni cervicali di alto grado, trattate chirurgicamente per la rimozione delle lesioni e seguite nel follow-up, per stabilire l’importanza di tali marker nella valutazione della persistenza virale al fine di prevenire recidive di malattia.

Studio in vitro della suscettibilità genetica degli ovini alle EST: il PMCA come alternativa agli studi di trasmissione in vivo

Le encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST), o malattie da prioni, sono malattie neurodegenerative che colpiscono l'uomo e gli animali. Le più note tra le EST animali sono la scrapie della pecora e della capra, l’encefalopatia spongiforme bovina (BSE), la Sindrome del dimagrimento cronico (CWD) dei cervidi. Negli uomini ricordiamo la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) nelle sue diverse forme (sporadica, genetica, iatrogenica e variante). La dimostrazione che la variante della CJD (vCJD) sia causata dallo stesso agente eziologico della BSE, ha evidenziato il potenziale zoonotico di queste malattie. Le EST sono caratterizzate da tempi di incubazione estremamente lunghi ed esito invariabilmente fatale. Il momento patogenetico centrale comune a tutte queste malattie è rappresentato dalla modificazione conformazionale di una proteina cellulare denominata PrPC (proteina prionica cellulare) in una isoforma patologica denominata PrPSc, insolubile e caratterizzata da una parziale resistenza alle proteasi, che tende a depositarsi sotto forma di fibrille amiloidee nel SNC dei soggetti colpiti. La suscettibilità degli ovini alla scrapie è largamente influenzata dal genotipo del gene dell’ospite che codifica per la PrP (PRNP), e più precisamente da tre polimorfismi presenti ai codoni 136, 154 e 171. Questi si combinano in cinque principali alleli, ARQ, VRQ, AHQ, ARH e ARR, correlati a differenti gradi di suscettibilità alla malattia. Risultati ottenuti da un precedente studio d’infezione sperimentale di ovini di razza Sarda con scrapie classica (Vaccari G et al 2007), hanno suggeriscono l’ordine di suscettibilità ARQ>AHQ>ARH. L’allele ARR, è risultato invece associato ai più alti livelli di protezione dalla malattia. Dallo stesso studio di trasmissione sperimentale e da uno studio epidemiologico di tipo caso-controllo, è inoltre emerso che nella razza Sarda, ovini con l’allele ARQ, con sostituzione amminoacidica al codone 137 Metionina (M)/Treonina (T) (AT137RQ) o al 176 Asparagina (N)/Lisina (K) (ARQK176) in eterozigosi sono protetti dalla scrapie. Inoltre studi di trasmissione sperimentale della BSE in ovini della stessa razza con tre differenti genotipi (ARQ/ARQ, ARQ/ARR e ARR/ARR), hanno dimostrato come la BSE abbia un targeting genetico molto simile a quello della scrapie, evidenziando il genotipo ARQ/ARQ come il più suscettibile. L’obbiettivo della seguente tesi è stato quello di verificare se fosse possibile riprodurre in vitro la differente suscettibilità genetica degli ovini alle EST evidenziata in vivo, utilizzando il PMCA (Protein Misfolding Cyclic Amplification), la metodica ad oggi più promettente e di cui è stata dimostrata la capacità di riprodurre in vitro diverse proprietà biologiche dei prioni. La tecnica, attraverso cicli ripetuti di sonicazione/incubazione, permette la conversione in vitro della PrPC presente in un omogenato cerebrale (substrato), da parte di una quantità minima di PrPSc (inoculo) che funge da “innesco” della reazione. Si è voluto inoltre utilizzare il PMCA per indagare il livello di protezione in omozigosi di alleli rari per i quali, in vivo, si avevano evidenze di protezione dalla scrapie solo in eterozigosi, e per studiare la suscettibilità degli ovini alla BSE adattata in questa specie. È stata quindi testata in PMCA la capacità diversi substrati ovini recanti differenti genotipi, di amplificare la PrPSc dello stesso isolato di scrapie classica impiegato nel precedente studio in vivo o di un inoculo di BSE bovina. Inoltre sono stati saggiati in vitro due inoculi di BSE costituiti da omogenato cerebrale di due ovini sperimentalmente infettati con BSE (BSE ovina) e recanti due differenti genotipi (ARQ/ARQ e ARR/ARR). Per poter descrivere quantitativamente il grado di correlazione osservato i risultati ottenuti in vitro e i quelli riscontrati dallo studio di sperimentazione con scrapie, espressi rispettivamente come fattori di amplificazione e tempi d’incubazione registrati in vivo, sono stati analizzati con un modello di regressione lineare. Per quanto riguarda la scrapie, i risultati ottenuti hanno evidenziato come i genotipi associati in vivo a suscettibilità (ARQ/ARQ, ARQ/AHQ and AHQ/ARH) siano anche quelli in grado di sostenere in PMCA l’amplificazione della PrPSc, e come quelli associati a resistenza (ARQ/ARR and ARR/ARR) non mostrino invece nessuna capacità di conversione. Dall’analisi di regressione lineare è inoltre emerso come l’efficienza di amplificazione in vitro dei differenti genotipi testati sia inversamente proporzionale ai tempi d’incubazione registrati in vivo. Inoltre nessuna amplificazione è stata riscontrata utilizzando il substrato con genotipo raro ARQK176/ARQK176 suggerendo come anche questo possa essere associato a resistenza, almeno nei confronti dell’isolato di scrapie classica utilizzato. Utilizzando come inoculo in PMCA l’isolato di BSE bovina, è stato possibile riscontrare, nei tre genotipi analizzati (ARQ/ARQ, ARQ/ARR e ARR/ARR) un evidente amplificazione per il solo genotipo ARQ/ARQ, sottolineando anche in questo caso l’esistenza di una correlazione tra suscettibilità riscontrata in vivo e capacità di conversione in PMCA. I tre i substrati analizzati mostrano inoltre una buona efficienza di amplificazione, per altro simile, se si utilizza la PrPSc dell’inoculo di BSE sperimentalemente trasmessa agli ovini. Questi genotipi sembrerebbero dunque ugualmente suscettibili se esposti a BSE adattata alla specie ovina. I risultati di questa tesi indicano dunque una correlazione diretta tra la capacità di conversione della PrPC con il PMCA e la suscettibilità osservata in vivo per i differenti genotipi analizzati. Mostrano inoltre come il PMCA possa essere una valida alternativa agli studi di trasmissione in vivo e un rapido strumento utile non soltanto per testare, ma anche per predire la suscettibilità genetica degli ovini a diversi ceppi di EST, rappresentando un valido aiuto per l’individuazione di ulteriori genotipi resistenti, così da incrementare la variabilità genetica dei piani di selezione attuati per gli ovini per il controllo di queste malattie.

Chlamydia psittaci nel colombo di città: aspetti anatomo-patologici, sierologici e biomolecolari

Scopo del lavoro della presente tesi è stato quello di valutare la prevalenza di Chlamydiaceae, ed in particolare Chlamydia psittaci, in una popolazione aviare con caratteristiche sinantropiche quale il colombo di città (Columba livia var. domestica) dell’areale veneziano. Per evidenziare il patogeno sono state utilizzate metodiche sierologiche, d’isolamento e biomolecolari tradizionali. Contestualmente, mediante tecnologie molecolari innovative, quali microarray ed MLVA (Multilocus VNTR Assay) sono stati valutati i genotipi di C. psittaci e le eventuali altre specie di Chlamydia presenti in tale popolazione. Inoltre, si è proceduto ad una classificazione delle lesioni anatomo-patologiche ed ad una loro correlazione con la presenza del patogeno. I risultati dimostrano che la prevalenza di C. psittaci nella popolazione oggetto dello studio è del 10%. Durante tale studio è stata dimostrata la presenza di un ceppo di C. psittaci atipico, in quanto non classificabile con le attuali tecniche a disposizione. La genotipizzazione dei ceppi di C. psittaci conferma la presenza nel colombo di città del genotipo B, E ed E/B, che solitamente risultano essere coinvolti con minore frequenza in episodi di infezione umana. Inoltre sono stati dimostrati alcuni ceppi classificati come Chlamydia spp., in quanto le metodologie applicate e le conoscenze attuali non permettono ulteriori distinzioni, prospettando la possibilità di un nuovo ceppo. Infine, attraverso l’analisi dei dati raccolti durante la prima fase di campionamenti e successivamente confermati durante la seconda fase, siamo riusciti a strutturare un sistema di selezione, basato su caratteristiche funzionali ed anatomopatologiche, che permette di selezionare in sede necroscopica i colombi molto probabilmente infetti, permettendo conseguentemente una migliore organizzazione e gestione dei campioni di interesse contenendo nel contempo i costi ma mantenendo elevati gli standards diagnostici.

Isolamento, variabilità ed espressione del gene PIMT in Girasole

Il vigore è un aspetto rilevante della qualità delle sementi, strettamente connesso al loro status fisiologico, al genotipo e alle condizioni di stoccaggio. Stress ossidativi e danni alle macromolecole sono alla base del deterioramento del seme, che è equipaggiato con sistemi protettivi e di riparazione. Uno di questi coinvolge l’L-isoaspartil metiltransferasi (PIMT) che ripara i misfolding proteici catalizzando la riconversione in aspartato dell’isoaspartile anomalo accumulato. Scopo di questo studio era valutare il possibile ruolo del meccanismo di riparazione di PIMT nel vigore del seme in girasole. Per questo il relativo gene è stato isolato e caratterizzato, la variabilità allelica determinata su un campione di linee inbred e l’espressione genica misurata in risposta all’invecchiamento accelerato (aging) e al priming. La sequenza codificante ottenuta è costituita da 4 esoni e contiene i 5 domini caratteristici delle metiltransferasi. Il gene mostra elevata similarità con gli ortologhi vegetali e scarsa diversità nucleotidica nei genotipi coltivati rappresentativi della variabilità della specie. Nella sequenza aminoacidica, comunque, sono state rinvenute tre sostituzioni che potrebbero influenzare la funzionalità enzimatica. Dal punto di vista fisiologico i genotipi considerati hanno esibito notevole variabilità di risposte ai trattamenti, sia in termini di vigore che di espressione genica. Aging e priming hanno prodotto generalmente gli effetti attesi, rispettivamente negativi e positivi, sulla germinabilità e sulla sua velocità. In generale l’espressione di PIMT è risultata massima nel seme secco, come riportato altrove, e ridotta dall’aging. Anche il priming ha diminuito l’espressione rispetto al seme quiescente, mentre il suo effetto dopo l’aging è risultato genotipo-dipendente. Tuttavia, nelle condizioni descritte, non si sono evidenziate correlazioni significative tra vigore ed espressione di PIMT, tali da suggerire un chiaro ruolo di questo meccanismo nella qualità fisiologica del seme.

Human papillomavirus (HPV) and associated diseases: between applied diagnostic and basic research

Human Papillomavirus (HPV) is the cause of cervical cancers (among these, adenocarcinoma, AdCa) and is associated to a subgroup of oropharyngeal carcinomas (OPSCCs). Even if the risk for cancer development is linked to the infection by some viral genotypes, mainly HPV16 and 18, viral DNA alone seems not to be sufficient for diagnosis. Moreover, the role of the virus in OPSCCs has not been totally clarified yet. In the first part of the thesis, the performances concerning viral genotyping in clinical cervical samples of a new pyrosequencing-based test and a well-known hybridization-based assay have been compared. Similar results between the methods have been obtained. However, the former showed advantages in detecting intratype variants, higher specificity and a broader spectrum of detectable HPV types. The second part deals with the evaluation of virological markers (genotyping, viral oncoproteins expression, viral load, physical state and CpG methylation of HPV16 genome) in the diagnosis/prognosis of cervical AdCa and HPV-associated OPSCCs. HPV16 has been confirmed the most prevalent genotype in both the populations. Interestingly, the mean methylation frequency of viral DNA at the early promoter showed the tendency to be associated to invasion for cervical AdCa and to a worse prognosis for OPSCCs, suggesting a promising role as diagnostic/prognostic biomarker. The experiments of the third part were performed at the DKFZ in Heidelberg (Germany) and dealt with the analysis of the response to IFN-k transfection in HPV16-positive cervical cancer and head&neck carcinoma cell lines to evaluate its potential role as new treatment. After 24h, we observed increased IFN-b expression which lead to the up-regulation of genes involved in the antigens presentation pathway (MHC class I and immunoproteasome) and antiviral response as well, in particular in cervical cancer cell lines. This fact suggested also the presence of different HPV-mediated carcinogenic pathways between the two anatomical districts.

Valutazione dell’impiego dei test per la genotipizzazione di HPV e l’espressione degli oncogeni virali nel follow-up di donne conizzate per lesioni cervicali di alto grado nello screening del cervico-carcinoma della Regione Emilia-Romagna

Obiettivi: Valutare la prevalenza dei diversi genotipi di HPV in pazienti con diagnosi di CIN2/3 nella Regione Emilia-Romagna, la persistenza genotipo-specifica di HPV e l’espressione degli oncogeni virali E6/E7 nel follow-up post-trattamento come fattori di rischio di recidiva/persistenza o progressione di malattia; verificare l’applicabilità di nuovi test diagnostici biomolecolari nello screening del cervicocarcinoma. Metodi: Sono state incluse pazienti con citologia di screening anormale, sottoposte a trattamento escissionale (T0) per diagnosi di CIN2/3 su biopsia mirata. Al T0 e durante il follow-up a 6, 12, 18 e 24 mesi, oltre al Pap test e alla colposcopia, sono state effettuate la ricerca e la genotipizzazione dell'HPV DNA di 28 genotipi. In caso di positività al DNA dei 5 genotipi 16, 18, 31, 33 e/o 45, si è proceduto alla ricerca dell'HPV mRNA di E6/E7. Risultati preliminari: Il 95.8% delle 168 pazienti selezionate è risultato HPV DNA positivo al T0. Nel 60.9% dei casi le infezioni erano singole (prevalentemente da HPV 16 e 31), nel 39.1% erano multiple. L'HPV 16 è stato il genotipo maggiormente rilevato (57%). Il 94.3% (117/124) delle pazienti positive per i 5 genotipi di HPV DNA sono risultate mRNA positive. Abbiamo avuto un drop-out di 38/168 pazienti. A 18 mesi (95% delle pazienti) la persistenza dell'HPV DNA di qualsiasi genotipo era del 46%, quella dell'HPV DNA dei 5 genotipi era del 39%, con espressione di mRNA nel 21%. Abbiamo avuto recidiva di malattia (CIN2+) nel 10.8% (14/130) a 18 mesi. Il pap test era negativo in 4/14 casi, l'HPV DNA test era positivo in tutti i casi, l'mRNA test in 11/12 casi. Conclusioni: L'HR-HPV DNA test è più sensibile della citologia, l'mRNA test è più specifico nell'individuare una recidiva. I dati definitivi saranno disponibili al termine del follow-up programmato.

Virus oncogeni a dna in tumori umani: studio delle infezioni da papillomavirus e poliomavirus in neoplasie di diversa origine.

I virus tumorali inducono oncogenesi nel loro ospite naturale o in sistemi animali sperimentali, manipolando diverse vie cellulari. Ad oggi, sono stati identificati sette virus capaci di causare specifici tumori umani. Inoltre HPV, JCV ed SV40, sono stati associati con un grande numero di tumori umani in sedi corporee non convenzionali, ma, nonostante molti anni di ricerca, nessuna eziologia virale è stata ancora confermata. Lo scopo di questo studio è stato di valutare la presenza ed il significato sia di JCV ed SV40 in tumori ossei umani, e di HPV nel carcinoma della mammella (BC), galattoforectomie (GF), secrezioni mammarie patologiche (ND) e glioblastoma multiforme (GBM). Tecniche di biologia molecolare sono state impiegate per esaminare campioni di tessuto tumorale di 70 tumori ossei (20 osteosarcomi [OS], 20 tumori a cellule giganti [TCG], 30 condrosarcomi [CS]), 168 BCs , 30 GFs, 59 GBM e 30 campioni di ND. Il genoma di SV40 e JCV è stato trovato nel 70% dei CS + 20% degli OS, e nel 13% dei CS +10% dei TCG, rispettivamente. Il DNA di HPV è stato rilevato nel 30% dei pazienti con BC, nel 27% dei campioni GF e nel 13% dei NDs. HPV16 è stato il genotipo maggiormente osservato in tutti questi campioni, seguito da HPV18 e HPV35. Inoltre, il DNA di HPV è stato trovato nel 22% dei pazienti con GBM, in questo tumore HPV6 era il tipo più frequentemente rilevato, seguito da HPV16. L’ ISH ha mostrato che il DNA di HPV è situato all’interno di cellule tumorali mammarie e di GBM. I nostri risultati suggeriscono un possibile ruolo di JCV, SV40 e HPV in questi tumori, se non come induttori come promotori del processo neoplastico, tuttavia diversi criteri devono ancora essere soddisfatti prima di chiarirne il ruolo.

Studio di caratteri correlati a stress idrico in una collezione di cultivar di frumento duro (Triticum durum Desf.)

L’agricoltura si trova ad affrontare una diminuzione della disponibilità d’acqua ed una crescente domanda della produzione di cereali per scopi alimentari. Sono perciò necessarie strategie di coltivazione innovative per migliorare la produttività e nuovi genotipi migliorati nell'efficienza dell’uso delle risorse in condizioni di siccità. Questi rappresentano gli obietti principali del progetto “DROPS” (Drought tolerant yielding Plants) all’interno del quale ha avuto luogo il mio progetto di Dottorato. La mia attività di ricerca è stata svolta come segue: 1. Caratterizzazione molecolare di un panel di188 accessioni di frumento duro con marcatori SSR e DaRT; 2. Esperimenti in serra su 100 accessioni del panel per valutare la Water-Use Efficiency (WUE) in sei repliche secondo un Alpha Lattice design; 3. Prove sul campo, effettuate secondo un Alpha Lattice design, in due stagioni di crescita: a. 2010/11, valutazione di 100 accessioni presso l’Azienda sperimentale dell'Università di Cadriano (BO); b. 2011/12, valutazione del panel completo in 3 ambienti, con due diversi regimi irrigui In entrambi gli anni, abbiamo valutato caratteri agronomici correlati con il ciclo di sviluppo, la resa di granella e sue componenti, nonché diversi fattori ambientali e del suolo. Per quanto riguarda WUE, abbiamo trovato differenze altamente significative tra accessioni; inoltre, cinque accessioni hanno mostrato elevati valori di WUE e cinque accessioni valori molto bassi di WUE in tutte e sei le repliche. Gli esperimenti di campo nelle stagioni 2011 e 2012 hanno evidenziato differenze altamente significative tra le accessioni del panel per la maggior parte dei caratteri analizzati, confermando inoltre che il panel di fiorisce entro una settimana. L'esperimento del secondo anno ci ha permesso osservare un significativa interazione Genotipo X Ambiente. Questi risultati saranno integrati con ulteriori analisi QTL, per identificare regioni cromosomiche coinvolte nel controllo genetico dei caratteri di interesse e verificare la stabilità dei QTL in diversi ambienti.