Role of the HCF-1 basic region in sustaining cell proliferation.

BACKGROUND: The human herpes simplex virus-associated host cell factor 1 (HCF-1) is a conserved human transcriptional co-regulator that links positive and negative histone modifying activities with sequence-specific DNA-binding transcription factors. It is synthesized as a 2035 amino acid precursor that is cleaved to generate an amino- (HCF-1(N)) terminal subunit, which promotes G1-to-S phase progression, and a carboxy- (HCF-1(C)) terminal subunit, which controls multiple aspects of cell division during M phase. The HCF-1(N) subunit contains a Kelch domain that tethers HCF-1 to sequence-specific DNA-binding transcription factors, and a poorly characterized so called "Basic" region (owing to a high ratio of basic vs. acidic amino acids) that is required for cell proliferation and has been shown to associate with the Sin3 histone deacetylase (HDAC) component. Here we studied the role of the Basic region in cell proliferation and G1-to-S phase transition assays. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Surprisingly, much like the transcriptional activation domains of sequence-specific DNA-binding transcription factors, there is no unique sequence within the Basic region required for promoting cell proliferation or G1-to-S phase transition. Indeed, the ability to promote these activities is size dependent such that the shorter the Basic region segment the less activity observed. We find, however, that the Basic region requirements for promoting cell proliferation in a temperature-sensitive tsBN67 cell assay are more stringent than for G1-to-S phase progression in an HCF-1 siRNA-depletion HeLa-cell assay. Thus, either half of the Basic region alone can support G1-to-S phase progression but not cell proliferation effectively in these assays. Nevertheless, the Basic region displays considerable structural plasticity because each half is able to promote cell proliferation when duplicated in tandem. Consistent with a potential role in promoting cell-cycle progression, the Sin3a HDAC component can associate independently with either half of the Basic region fused to the HCF-1 Kelch domain. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: While conserved, the HCF-1 Basic region displays striking structural flexibility for controlling cell proliferation.

The role of Toll-like Receptor (TLR) 9 in the development of a T-helper (Th)1/Th2 response in the murine model of infection with " Leishmania major "

1.1 SUMMARY The role of the non-specific innate immune system is as important as the elaboration of the adaptive immune system in the initiation of an immune response to pathogens. The role of the Toll-like receptors (TLRs) in the innate immune response to virus and bacterial pathogens is widely recognised, however, little is known about the role of TLRs in host defence against eukaryotic pathogens. Immunologic investigations on the marine model of infection with Leishmania major (L. major) have correlated the outcome of the disease with expansion of different subsets of CD4+ cells, designated Th1 and Th2. The resistance of C57BL/6, CBA and C3H/He mice is linked with an IL-12 driven Th1 response. In BALB/c mice the susceptibility correlates with an IL-4 driven Th2 response. The initial event promoting the development of a Th1 or Th2 response still remains elusive. Recently, the contribution of the TLR signalling pathway in the innate and acquired immune response to infection with the intracellular protozoan parasite L. major has been demonstrated. Thus, the purpose of this study is to determine whether TLRs may play a role in influencing the outcome of the infection by directing the development of a Th1 or a Th2 response during infection with L, major parasites, in resistant C57BL/6 and susceptible BALB/c mice, respectively. We demonstrated that MyD88, the major TLR adaptor molecule is necessary for C57BL/6 to develop a resistant Th1 response following L. major infection. Our data show the essential role of MyD88 in the establishment of a protective Th1 response. We subsequently aimed to determine which TLRs may be involved in the protective response. Since TLR2 and TLR4 have shown to have a potential role for Leishmania recognition, we analysed the course of infection in TLR2 and TLR4 deficient mice on a C57BL/6 resistant background following L. major infection. Our results clearly demonstrate that TLR2 or TLR4 aze dispensable to control the outcome of the disease as the TLR2 and TLR4 knockout mice developed a protective Th1 response. With the aim of determining a potential TLR candidate important in the initiation of the Thl response, we assessed the mRNA expression of different TLRs (TLR1 to TLR9) using quantitative real-time RT-PCR at different time points during the first week of infection. The results clearly showed an upregulation of TLR7 and TLR9 mRNA expression during the early phase of infection in resistant C57BL/6 mice but not in susceptible BALB/c mice. To provide in vivo evidence for the role for, these TLRs in the outcome of cutaneous leishmaniasis, studies using TLR7 and TLR9 deficient mice on a resistant C57BL/6 background were performed. The TLR7 deficient mice developed a resistance phenotype that was comparable with C57BL/6 wild type mice. Thus, the presence of TLR7 is not indispensable for the development of a Th1 response and resistance to infection. On the contrary, TLR9 deficient mice on the C57BL/6 resistant background showed high variability in the outcome of the disease. Although some mice behave as resistant C57BL/6 mice, half of them developed high lesion following infection and showed a decrease in IFN-γ production and an increase in IL-4 as compared to wild type mice. These results suggest that TLR9 may be involved in the control of infection. To test the hypothesis that regulatory T cells (Treg) are playing a role in the high variability in the disease outcome in TLR9 deficient mice, depletion of CD4+CD25+ T cells with a specific antibody three days before infection with L. major were performed Interestingly, these treated mice developed large lesions, low IL-4 and decreased IFN-γ producion when compared to untreated mice. A better understanding of the mechanism by which Treg cells influence the outcome of the disease in TLR9 deficient mice following L. major infection is currently under investigation. Altogether, this study demonstrates the importance of TLR9 in the induction of a protective T'h1 response, a process that is involved in the resolution of the lesion induced by L. major infection. 1.2 RÉSUMÉ Le rôle de la réponse immunitaire innée a longtemps été négligé quant à l'impact qu'elle pourrait avoir dans l'initiation d'une réponse immune adaptative efficace dirigée contre un pathogène. Si l'importance des récepteurs Toll-like (TLR) du système inné dans la reconnaissance des virus et bactéries a été démontrée, son rôle dans la défense contre les pathogènes eucaryotes reste encore très élusif. Récemment, il a été montré que les voies de signalisation provenant de l'activation des TLRs pouvaient initier la réponse immunitaire innée et adaptative après une infection avec le parasite protozoaire Leishmania major (L. major). Dans un modèle marin d'infection avec L. major alors que la plupart des souches de souris telles que C57BL/6 sont résistantes à l'infection et développent une réponse immunitaire de type T helper 1 (Th1) induite par IL-12, peu de souches dont les BALB/c sont sensibles et développent une réponse Th2 induite par IL-4. La différentiation Th1/Th2 est un événement qui prend place de manière définitive lors de la première semaine après infection. Les événements précoces promouvant le développement d'une réponse Th1 ou Th2 n'étant pas connus, l'objectif de ce travail a été de démontrer un rôle des TLRs dans l'initiation d'une réponse immune innée et adaptative suite à l'infection par L. major. Nous avons démontré que MyD88, une molécule importante dans le processus de signalisation des TLRs, est nécessaire pour que les souris résistantes C57BL/6 développent une réponse Th1 protectrice. L'importance du rôle de TLR2 et TLR4 dans la reconnaissance du parasite Leishmania ayant été démontrée, nous avons privilégié l'analyse de la réponse immunitaire suite à une infection in vivo de souris déficiente en TLR2 ou TLR4 sur un fond génétique résistant. Les résultats obtenus montrent que la présence de ces récepteurs n'est pas indispensable pour le contrôle de l'infection et la polarisation d'une réponse Th1 caractéristique de la résistance à L. major. Cependant d'autres TLRs peuvent aussi activer la voie de signalisation MyD88 dépendante. L'expression de l'ARNm des différents TLRs dans les ganglions drainant de souris sensibles et résistantes pendant la première semaine d'infection a été déterminée par PCR quantitative en temps réel. Les résultats obtenus montrent que l'ARNm de TLR7 et TLR9 était régulé positivement suite à l'infection par L. major chez les souris résistantes C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'était détectable chez les souris sensibles BALB/c. Le rôle des récepteurs TLR7 et TLR9 a donc été évalué par l'infection par L. major des souris déficientes en TLR7 et TLR9 sur fond génétique C57BL/6. Nos résultats ont clairement démontré que les souris déficientes en TLR7 montrent une réponse immunitaire identique à celle des souris résistantes C57BL/6, signifiant que TLR7 n'est pas indispensable au développement d'une Th1 ainsi qu'au contrôle de la parasitémie. Paz contre, les souris déficientes en TLR9 sur un fond génétique résistant ont montré une grande variabilité dans la réponse à l'infection. En effet, la moitié des souris deviennent sensibles à l'infection, ceci étant associé à une diminution dans la production d'IFN-γ et à une augmentation de la production d'IL-4. Ces résultats suggèrent que TLR9 est impliqué dans le contrôle de la lésion et de la réponse immunitaire suite à l'infection avec L. major. Cependant les résultats avec les souris déficientes en TLR9 montrant une grande hétérogénéité et une balance Th1/Th2 instable, nous avons émis l'hypothèse que les cellules T régulatrices pouvaient être impliquées dans ce phénomène. Nous avons effectivement constaté qu'après déplétion des cellules CD4+CD25+, les souris déficientes en TLR9 développent des lésions aussi grandes que les souris BALB/c après infection par L. major. Cependant le nombre de parasites reste le même que chez les souris C57BL/6. De plus la production d'IL-4 ainsi que celle d'IFN-γ reste extrêment bas. Les mécanismes régulateurs impliqués dans ce processus sont en cours d'analyse. Ce travail met en évidence l'importance du TLR9 dans le développement d'une réponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus nécessaire pour la résistance à l'infection. 1.3 RESUME POUR UN LARGE PUBLIC La leishmaniose est une maladie parasitaire répandue dans le monde entier et touchant plus de 88 pays. L'incidence mondiale de la leishmaniose cutanée et de 1 à 1,5 million de nouveaux cas par année. Plus de 12 millions de personnes sont affectées par la maladie et 350 millions de personnes sont une population à risque. Un modèle marin d'infection avec Leishmania major (L. major) a été établi qui reproduit plusieurs tableaux cliniques observés dans le cas de la leishmaniose cutanée chez l'homme. L'analyse de la réponse immunitaire dans les souris infectées par L. major a permis de distinguer deux groupes : les souris de la plupart des souches telles que C57BL/6 sont résistantes à l'infection et développent une réponse immunitaire de type T helper 1 (Th1), alors que quelques souches dont les BALB/c sont sensibles et développent une réponse de type Th2. La réponse immune adaptative dans le modèle d'infection avec L. major à été largement étudiée. Cependant, les événements précoces déterminants pour le développement d'une réponse Th1 ou Th2 restent encore très flous. Récemment, plusieurs publications ont montré que les récepteurs Toll-like (TLR) peuvent contribuer à l'initiation de la réponse immunitaire lors d'une infection avec le parasite intracellulaire L. major. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié le rôle de MyD88, une molécule importante dans le processus de signalisation des TLRs, dans la réponse immune suite à une infection avec L. major. En l'absence de MyD88, les souris normalement résistantes à l'infection avec L. major deviennent sensibles et développent des lésions importantes. Ces souris ne sont plus capables de développer une réponse Thl, normalement caractéristique de leur phénotype résistant. Nous avons ensuite tenté de comprendre quels TLRs, plus précisément, pouvait être impliqué dans ce processus. Malgré quelques évidences démontrant que TLR2 et TLR4 pouvaient avoir un rôle important dans l'initiation d'une réponse immunitaire adaptative à Leishmania, nous avons montré que, in vivo après infection avec L. major, la déficience d'un de ces récepteurs n'était pas suffisante à faire basculer la réponse immunitaire. Les souris C57BL/6 déficient en TLR2 ou TLR4 peuvent parfaitement contrôler l'évolution de la maladie. De plus, ces souris, malgré l'absence de TLR2 ou TLR4, sont capables de monter une parfaite réponse Thl. Etant donné que TLR2 et TLR4 n'étaient pas essentiels pour la résistance à la maladie, nous avons analysé les TLRs, parmi les 12 décrits qui pouvaient être indispensables au développement d'une réponse de type Th1 associée à la résistance à l'infection par Leishmania. Nos expériences ont montré que l'expression de l'ARN messager (ARNm) de TLR7 et TLR9 était modulée suite à l'infection par L. major chez la souris résistante C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'était visible chez les souris sensible BALB/c. Pensant que ces TLRs pourraient jouer un rôle dans la réponse immunitaire au parasite, nous avons étudié l'évolution de l'infection dans les souris déficientes en TLR7 et TLR9. Nos résultats ont clairement démontré que TLR7 n'était pas indispensable à la résistance au parasite alors que l'absence de TLR9 avait des conséquences radicales sur le contrôle de la lésion et de la réponse immunitaire suite à l'infection avec L. major. Ce travail révèle ainsi l'importance du TLR9 dans le développement d'une réponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus nécessaire pour la résistance à l'infection. Il est a noté que nos résultats sont en accord avec le fait que les motifs CpG, qui sont des immunostimulateurs interagissant avec le TLR9, ont une activité adjuvante importante dans la préparation de vaccins contre la leishmaniose. Une meilleure compréhension des mécanismes immunologiques impliquant le TLR9 dans la reconnaissance du parasite est alors indispensable pour le développement de vaccins thérapeutiques efficaces.

A limited role for beta-selection during gamma delta T cell development.

T cells belong to two distinct lineages expressing either alpha beta or gamma delta TCR. During alpha beta T cell development, it is clearly established that productive rearrangement at the TCR beta locus in immature precursor cells leads to the expression of a pre-TCR complex. Signaling through the pre-TCR results in the selective proliferation and maturation of TCR beta+ cells, a process that is known as beta-selection. However, the potential role of beta-selection during gamma delta T cell development is controversial. Whereas PCR-RFLP and sequencing techniques have provided evidence for a bias toward in-frame VDJ beta rearrangements in gamma delta cells (consistent with beta-selection), gamma delta cells apparently develop normally in mice that are unable to assemble a pre-TCR complex due to a deficiency in TCR beta or pT alpha genes. In this report, we have directly addressed the physiologic significance of beta-selection during gamma delta cell development in normal mice by quantitating intracellular TCR beta protein in gamma delta cells and correlating its presence with cell cycle status. Our results indicate that beta-selection plays a significant (although limited) role in gamma delta cell development by selectively amplifying a minor subset of gamma delta precursor cells with productively rearranged TCR beta genes.

Evaluation of the potential use of trabecular bone score to complement bone mineral density in the diagnosis of osteoporosis: a preliminary spine BMD-matched, case-control study.

The trabecular bone score (TBS) is a new parameter that is determined from gray-level analysis of dual-energy X-ray absorptiometry (DXA) images. It relies on the mean thickness and volume fraction of trabecular bone microarchitecture. This was a preliminary case-control study to evaluate the potential diagnostic value of TBS as a complement to bone mineral density (BMD), by comparing postmenopausal women with and without fractures. The sample consisted of 45 women with osteoporotic fractures (5 hip fractures, 20 vertebral fractures, and 20 other types of fracture) and 155 women without a fracture. Stratification was performed, taking into account each type of fracture (except hip), and women with and without fractures were matched for age and spine BMD. BMD and TBS were measured at the total spine. TBS measured at the total spine revealed a significant difference between the fracture and age- and spine BMD-matched nonfracture group, when considering all types of fractures and vertebral fractures. In these cases, the diagnostic value of the combination of BMD and TBS likely will be higher compared with that of BMD alone. TBS, as evaluated from standard DXA scans directly, potentially complements BMD in the detection of osteoporotic fractures. Prospective studies are necessary to fully evaluate the potential role of TBS as a complementary risk factor for fracture.

Role of β-TrCP1, variant and homologue in HIV-1 life cycle

Summary The CD4 molecule plays a key role in AIDS pathogenesis, it is required for entry of the virus into permissive cells and its subsequent down-modulation of the cell surface is a hallmark of HN-1 infected cells. The virus encodes no less than three proteins that participate in this process: Nef, Vpu and Env. Vpu protein interacts with CD4 within the endoplasmic reticulum of infected cells, where it targets CD4 for degradation through the interaction with a cellular protein named ß-TrCP1. This F-box protein functions as the substrate recognition subunit of the SCF ß-Trcr E3 ubiquitin ligase, which normally induce the ubiquitination and subsequent degradation of various proteins such as ß-catenin and IxBa. Mammals possess a homologue of ß-TrCP1, HOS, also named ß-TrCP2 which has a cytoplasmic subcellular distribution. Structural analysis of the ligand-binding domain of both homologues shows striking surface similarities. Both F-box proteins have a redundant role in a number of cellular processes; however the potential role of ß-TrCP2 in HIV-1 infected cells has not been evaluated. In the present study, we assessed the existence of génetic variants of BRTC, encoding ß-TrCP1, and evaluated whether these variants would affect CD4 down-modulation. Additionally, we determined whether ß-TrCP2 shares with its homologue structural and functional properties that would allow it to bind Vpu, modulate CD4 expression, and thus participate in HN-1 pathogenesis. We identified a single nucleotide polymorphism present in the human population with an allelic frequency of 0.03 that leads to the substitution of alanine 507 by a serine. However, we showed by transient transfection in HeLa CD4+ cells that this variant behaves as ß-TrCP1 with respect to CD4 down-modulation. We established transient expression systems in HeLa CD4+ cells to test whether ß-TrCP2 is implicated in Vpu-mediated CD4 down-modulation. We show by coimmunoprecipitation experiments that ß-TrCP2 binds Vpu and is able to induce CD4 down-modulation as efficiently as ß-TrCP1. In two different cell lines, HeLa CD4+ and Jurkat, Vpu-mediated CD4 down-modulation could not be completely reversed through the silencing of endogenous ß-TrCP 1 or ß-TrCP2 individually, but required both genes to be silenced simultaneously. We evaluated the role of ß-TrCP1 and ß-TrCP2 in HIV-1 life cycle using silencing prior to actual viral infection. Both ß-TrCP1 and ß-TrCP2 contributed to CD4 down-modulation during aone-cycle viral infection iri Ghost cells. In addition, the combined silencing of both homologues in the absence of env and nef reversed CD4 down-modulation, showing that ß-TrCP 1 and ß-TrCP2 represent the main and additive effectors of HIV-1 encoded Vpu. In addition, we showed that silencing of ß-TrCPI but not ß-TrCP2 induced a decrease of HIV-1 LTR-driven expression. In a transient transfection system with Tat and a LTR luciferase reporter, both homologues modulated LTR-driven expression. The present study revealed that ß-TrCP2 represents a novel protein participating in HIV-1 cycle and complete comprehension of the complex interplay occurring between the two F-Box will improve our understanding of HIV-1 infection. Résumé La molécule CD4 joue un rôle clef dans la pathogenèse du SIDA ; elle est requise pour l'entrée du virus dans les cellules permissives et la diminution de sa concentration au niveau de la surface cellulaire est une importante caractéristique des cellules infectées par le VIH-1. Le virus encode pas moins de trois protéines qui participent à ce processus Nef, Vpu et Env. La protéine Vpu lie CD4 au niveau du réticulum endoplasmique et induit sa dégradation en interagissant avec une protéine cellulaire nommée ß-TrCP 1. Cette protéine de type F-Box est une sous unité du complexe ubiquitine-ligase E3 SCFß-TrCP. Elle permet la reconnaissance du substrat par le complexe qui induit l'ubiquitination et la subséquente dégradation de diverses protéines cellulaires comme la ß-catenin ou IκBα. Les mammifères possèdent un homologue à ß-TrCP1appelé ß-TrCP2 (ou HOS). L'analyse comparative du domaine permettant la reconnaissance des substrats des deux homologues montre de frappantes similarités. Le rôle de ß-TrCP2 dans le cycle viral du VIH-1 n'a pas encore été évalué. Lors de cette étude, nous avons recherché l'existence de variants génétique de BTRC (codant pour ß-TrCP1) et nous avons évalué si ces variants pourraient affecter la dégradation des molécules CD4 induite par le virus. Nous avons ainsi identifié un polymorphisme présent dans la population humaine avec une fréquence allélique de 0.03 qui consiste en une substitution de l'alanine 507 par une sérine. Nous avons cependant montré par transfection dans des cellules HeLa CD4+ que ce variant se comporte comme ß-TrCP 1 en ce qui concerne la modulation de CD4. De plus, nous avons déterminé si ß-TrCP2 partageait avec son homologue des propriétés structurelles et fonctionnelles qui lui permettraient de lier Vpu, moduler la concentration de CD4 et ainsi prendre part à la pathogenèse du SIDA. Pour ce faire, nous avons établi un système d'expression temporaire dans des cellules HeLa CD4+. Par co-immunoprécipitation, nous avons montré que ß-TrCP2 lie Vpu et est capable d'induire la dégradation de CD4 aussi efficacement que ß-TrCP1. Dans deux différentes lignées cellulaires, HeLa CD4+ et Jurkat, la dégradation de CD4 n'a pu être complètement inhibée par le silencing individuel de ß-TrCP 1 ou ß-TrCP2, mais nécessitait le silencing simultané des 2 gènes. Nous avons évalué le rôle des deux homologues dans le cycle viral du VIH-1 en infectant des cellules Ghost avec le virus après avoir effectué un silencing des deux protéines. Nous avons ainsi montré que ß-TrCP 1 et ß-TrCP2 contribuent de manière additive à la dégradation de CD4 induite par une infection du VIH-1. Le silencing combiné des deux homologues inhiba complètement cette dégradation en l'absence de env et nef, prouvant qu'aucune autre voie ne participe à ce processus: En outre, nous avons montré que le silencing de ß-TrCP 1 mais pas celui de ß-TrCP2 induisait une diminution de l'expression virale sous contrôle du LTR. Nous n'avons cependant pas été en mesure de reconstituer cet effet en exprimant Tat et un gène reporteur sous contrôle du LTR dans des cellules HeLa CD4+. Le présent travail révèle que ß-TrCP2 représente une nouvelle protéine participant dans le cycle viral du VIH-1. Une complète compréhension de l'effet de chacun des deux homologues sur le cycle viral permettra d'améliorer notre compréhension de l'infection par le VIH-1.

Role of Staphylococcus aureus surface proteins in experimental endocarditis

Résumé Le staphylocoque doré est un pathogène responsable d'une grande variété de maladies chez l'être humain. Il est extrêmement bien équipé de facteurs de virulence, dont les adhésines. Jusqu'à présent, 21 protéines liant des composants de tissus de l'hôte ("microbial surface components reacting with adherence matrix molecules, MSCRAMM") ont été identifiées, par exemple le "clumping factor" A (CIfA) ou la "fibronectin-binding protein" A (FnBPA). Néanmoins, pour la plupart de ces protéines, leur rôle dans la pathogénie des infections à staphylocoque doré reste à être élucidé. Le but de cette thèse est de contribuer à ce processus. Premièrement, les "MSCRAMM" CIfA, CIfB, FnBPA, FnBPB, Cna, SpA, Pls, SdrC, SdrD, SdrE, SasD, SasE, SasF, SasG, Sasl, SasJ et SasK ont été exprimés dans une bactérie substitut, Lactococcus lactis, et testés pour leurs propriétés adhésives et leur pathogénicité dans un modèle d'endocardite expérimentale (voir chapitre 1). Cette technique a préalablement été utilisée avec succès et a l'avantage d'éviter le contexte complexe des redondances et systèmes de régulations propres au staphylocoque doré. Les résultats montrent que, de tous les facteurs de virulence testés, seuls CIfA et FnBPA sont d'importance primordiale dans le développement d'endocardite expérimentale. En ce qui concerne l'internalisation dans les cellules endothéliales, seulement FnPBA et FnBPB en sont capables. En outre, l'adhérence à chacun des ligands testés (fibrinogène, fibronectine, kératine, élastine, collagène, et les caillots de fibrine et plaquettes) est très spécifique et est médiée par une ou plusieures adhésines provenant du staphylocoque doré. Par conséquence, ces protéines pourraient représenter des cibles potentielles pour de futures thérapies anti-adhésives contre le staphylocoque doré. Deuxièmement, l'expression des facteurs de virulence décrits dans le chapitre 1 par les souches recombinantes de lactocoques a été vérifiée par une nouvelle méthode utilisant la spectrométrie de masse (voir chapitre 2). L'expression de toutes ces protéines par les souches recombinantes a pu être confirmée. Cette méthode pourrait être de grande valeur dans la vérification de la présence de protéines quelconques dans toutes sortes d'applications. Troisièmement, deux facteurs de virulence du staphylocoque, CIfA et une forme tronquée de FnBPA, ont été exprimés de façon simultanée dans une souche recombinante de lactocoque (voir chapitre 3}. Contrairement à une souche exprimant la FnBPA entière, une souche exprimant la forme tronquée de FnPBA, qui ne contient plus le domaine capable de lier le fibrinogène, perd complètement sa capacité d'infecter dans le modèle d'endocardite expérimentale. Par contre, il est montré que, en cas de complémentation de la forme tronquée de FnPBA avec le domaine de liaison au fibrinogène de CIfA dans la souche double recombinante, le phénotype intégral de FnBPA est récupéré. En conséquence, les facteurs de virulence sont capables de coopérer dans le but de la pathogénie des infections à staphylocoque doré. Summary Staphylococcus aureus is a human pathogen causing a wide variety of disease. It is extremely well equipped with both secreted and surface-attached virulence factors, which can act as adhesins to host tissues. In total, twenty-one microbial surface components reacting with adherence matrix molecules (MSCRAMMs) have been identified, so far. These include well-characterized adhesins such as clumping factor A (CIfA) or fibronectin-binding protein A (FnBPA). However, for most of them their potential role in the pathogenesis of staphylococcal infections remains to be elucidated. This has been attempted in this thesis work. Firstly, the staphylococcal MSCRAMMs CIfA, CIfB, FnBPA, FnBPB, Cna, SpA, Pls, SdrC, SdrD, SdrE, SasD, SasE, SasF, SasG, Sasl, SasJ, and SasK have been expressed in a surrogate bacterium, Lactococcus lactis, and tested for their in vitro adherence properties and their pathogenicity in the rat model of experimental endocarditis (see chapter 1). This model has successfully been used previously, and has the advantage of bypassing the complex S. aureus background of redundancies and differential regulation. Here, it is shown that of the seventeen tested potential virulence factors, only CIfA and FnBPA are critical for the pathogenesis of experimental endocarditis in rats, while internalization into bovine endothelial cells is mediated exclusively by FnBPA and FnBPB. In addition, the adherence to specific host ligands (fibrinogen, fibronectin, keratin, elastin, collagen, and fibrin-platelet clots) is highly specific and mediated by one or few staphylococcal adhesins, respectively. Thus, these surface proteins may represent potential targets for an anti-adhesive strategy against S. aureus infections. Secondly, the expression of the staphylococcal proteins by L. lactis recombinants described in chapter 1 was tested by a novel method using mass spectrometry (see chapter 2). The expression of all the staphylococcal proteins by the respective recombinant lactococcal strain could be confirmed. This method may prove to be of great value in the confirmation of the presence of any given protein in various experimental settings. Thirdly, two staphylococcal virulence factors, CIfA and a truncated form of FnBPA, were expressed simultaneously in one recombinant lactococcal strain (see chapter 3). In contrast to a recombinant strain expressing full-length FnPBA, a recombinant strain expressing a truncated FnPBA, lacking the domain capable of binding fibrinogen, completely lost infectivity in experimental endocarditis. However, it is shown that the complementation of the truncated form of FnBPA with the fibrinogenbinding domain of CIfA in a double recombinant strain results in the recovery of the complete phenotype of full-length FnBPA. Thus, virulence factors can cooperate in the pathogenesis of staphylococcal infections.

The role of MIC-1/GDF15 cytokine in glioblastoma

AbstractDespite advances in diagnosis and treatment made over the past two decades, high-gradeprimary brain tumors remain incurable neoplasms. Glioblastoma (GBM) represents the mostmalignant stage of astrocytic brain tumors. Identification of diagnostic and prognostic markers ineasily accessible biological material, such as plasma or cerebro-spinal fluid (CSF), would greatlyfacilitate the management of GBM patients. Elucidation of the molecular mechanisms that underlie thefunction of the factors implicated in GBM development would pave the way towards their potentialutility in cancer-targeting therapy.MIC-1/GDF15 (Macrophage Inhibitory Cytokine-1/ Growth Differentiation Factor 15), asecreted protein of the TGF-β superfamily, emerged as a candidate marker exhibiting increasingmRNA expression during astrocytoma malignant progression. However, injection of MIC-1/GDF15over-expressing GBM cell lines into nude mice has been previously shown to completely abolish theinherent tumorigenicity.In this study, determination of MIC-1/GDF15 protein levels in the CSF of a cohort of 94patients with intracranial tumors including astrocytomas (grades II, III and IV), meningioma, andmetastasis revealed significantly increased concentrations in GBM patients as compared to controlcohort of patients treated for non-neoplastic diseases. However, MIC-1/GDF15 levels were notelevated in the matching plasma samples from these patients. Most interestingly, GBM patients withthe increased concentrations of MIC-1/GDF15 in the CSF had worse outcome.In GBM tissue, it was found that the expression of MIC-1/GDF15 gene is low. Promotermethylation of the gene may partially explain the overall low expression levels. Investigation of thecellular origin of MIC-1/GDF15 expression in GBM tissue led to the MIC-1/GDF15 protein detectionin a subpopulation of the tumor infiltrating macrophages. These findings substantiated the workinghypothesis of MIC-1/GDF15 as harboring tumor-suppressive properties in GBM. Analysis of thesignaling pathway mediated by MIC-1/GDF15 in GBM highlighted the potential role of TGF-β signaltransduction. However, the lack of the functional response to the presence of MIC-1/GDF15 in-vitrosuggested operation of a paracrine loop for suppression of tumor formation which is evident solely invivo.In conclusion, MIC-1/GDF15 protein measured in the CSF may have diagnostic andprognostic values in patients with intracranial tumors. Molecular studies collectively proposeimplication of the tumor-host interactions in mediating the MIC-1/GDF15 tumor-suppressing activityduring GBM development.RésuméMalgré les progrès durant ces deux dernières décennies dans le diagnostique et le traitementdes tumeurs du cerveau primaires, ces néoplasmes restent incurables. Le glioblastome représente laforme la plus maligne des tumeurs astrocytiques du cerveau (astrocytomes). Pour le diagnostic et lepronostic, l'identification de marqueurs présents dans des substances facilement accessibles comme leplasma où le liquide céphalorachidien (LCR) faciliterait beaucoup la prise en charge des patients. Lacompréhension des mécanismes moléculaires de facteurs impliqués dans le développement du GBMpourrait ouvrir la voie vers l'utilisation de ces mécanismes dans des thérapies ciblées.MIC-1/GDF15 (Macrophage Inhibitory Cytokine-1/ Growth Differentiation Factor 15), uneprotéine secrétée qui appartient à la superfamille TGF-β, s'est révélé être un marqueur candidat, dontl'expression d'ARN messager augmente pendant la progression des astrocytomes malins. Cependant,une précedente étude montre que l'injection des lignées cellulaires de GBM fortement productrices deMIC-1/GDF15 dans des souris immunodéprimées abolit la tumorigénicité.Dans cette étude, les mesures dans une cohorte de 94 patients atteints de tumeursintracrâniennes comprenant des astrocytomes (grades II, III et IV), méningiomes et métastases,présentent des augmentations significatives des niveaux protéiques de MIC-1/GDF15 dans le LCRdes patients atteints de GBM par rapport aux patients traités pour des maladies non cancéreuses.Cependant, les niveaux de MIC-1/GDF15 n'étaient pas spécialement élevés dans le plasma. De plus,les patients atteints d'un GBM avec des niveaux élevés de MIC-1/GDF15 dans le LCR ont survécumoins longtemps. Dans les tissus de glioblastome, on observe que le gène MIC-1/GDF15 est peuexprimé. La méthylation du promoteur explique partiellement le faible niveau d'expression du gène.La recherche l'origine cellulaire de l'expression de MIC-1/GDF15, a permis de découvrir la présencede protéines MIC-1/GDF15 dans une sous-population de macrophages qui infiltrent les tumeurs. Cetteobservation supporte l'hypothèse que MIC-1/GDF15 présentait des propriétés de suppression destumeurs de type GBM. Des études sur les voies de signalisation régulées par MIC-1/GDF15 dans lesGBMs ont souligné l'importance de la voie de transduction du signal TGF-β. Cependant, l'absence deréponse fonctionnelle à MIC-1/GDF15 in vitro suggère fortement l'activité d'une boucle paracrinepour la répression de la formation de tumeur, qui n'est observé que in vivo.En conclusion, la protéine MIC-1/GDF15 mesurée dans le LCR pourrait avoir une valeur pourle diagnostic et le pronostic chez les patients atteints de GBM. Les études moléculaires suggèrent unepossible implication de l'interaction hôte-tumeur dans l'activité anti-tumorale de MIC-1/GDF15 sur leGBM.

Newly described human polyomaviruses Merkel Cell, KI and WU are present in urban sewage and may represent potential environmental contaminants

Recently, three new polyomaviruses (KI, WU and Merkel cell polyomavirus) have been reported to infect humans. It has also been suggested that lymphotropic polyomavirus, a virus of simian origin, infects humans. KI and WU polyomaviruses have been detected mainly in specimens from the respiratory tract while Merkel cell polyomavirus has been described in a very high percentage of Merkel cell carcinomas. The distribution, excretion level and transmission routes of these viruses remain unknown. Here we analyzed the presence and characteristics of newly described human polyomaviruses in urban sewage and river water in order to assess the excretion level and the potential role of water as a route of transmission of these viruses. Nested-PCR assays were designed for the sensitive detection of the viruses studied and the amplicons obtained were confirmed by sequencing analysis. The viruses were concentrated following a methodology previously developed for the detection of JC and BK human polyomaviruses in environmental samples. JC polyomavirus and human adenoviruses were used as markers of human contamination in the samples. Merkel cell polyomavirus was detected in 7/8 urban sewage samples collected and in 2/7 river water samples. Also one urine sample from a pregnant woman, out of 4 samples analyzed, was positive for this virus. KI and WU polyomaviruses were identified in 1/8 and 2/8 sewage samples respectively. The viral strains detected were highly homologous with other strains reported from several other geographical areas. Lymphotropic polyomavirus was not detected in any of the 13 sewage neither in 9 biosolid/sludge samples analyzed. This is the first description of a virus isolated from sewage and river water with a strong association with cancer. Our data indicate that the Merkel cell polyomavirus is prevalent in the population and that it may be disseminated through the fecal/urine contamination of water. The procedure developed may constitute a useful tool for studying the excreted strains, prevalence and transmission of these recently described polyomaviruses.

The role of MAR elements in DNA recombination

The untargeted integration of foreign DNA into the mammalian cell genome, extensively used in gene therapy and biotechnology, remains an incompletely understood process. It is believed to be based on cellular DNA double strand break (DSB) repair machinery and to involve two major steps: i) the formation of long gene arrays (concatemers), and ii) recombination of the resulting concatemer with the genome. The main DSB repair pathways in eukaryotes include non-homologous end-joining (NHEJ), homologous recombination (HR), and microhomology-mediated end-joining (MMEJ). However, it is still not clear, which of these pathways are responsible for transgene integration. Here, we show that NHEJ is not the primary pathway used by mammalian cells in the transgene integration process, while the components of the HR pathway seem to be important for genomic integration but not concatemerization. Instead, concatemer formation appears to be mediated by a subset of the MMEJ pathway, termed synthesis-dependent MMEJ (SD-MMEJ). This mechanism also seems to be preferentially used for plasmid integration into the genome, as confirmed by the analysis of plasmid-to-genome junction sequences, which were found to display an SD-MMEJ pattern. Therefore, we propose the existence of two distinct SD-MMEJ subpathways, relying on different subsets of enzymes. One of these mechanisms appears to be responsible for concatemerization, while the other mechanism, partially dependent in HR enzymes, seems to mediate recombination with the genome. Previous studies performed by our group suggested that matrix attachment regions (MARs), which are epigenetic regulatory DNA elements that participate in the formation of chromatin boundaries and augment transcription, may mediate increased plasmid integration into the genome of CHO cells by stimulating DNA recombination. In the present work, we demonstrate that MAR-mediated plasmid integration results from the enhanced SD-MMEJ pathway. Analysis of transgene integration loci and junction DNA sequences validated the prevalent use of this pathway by the MAR elements to target plasmid DNA into gene-rich areas of the CHO genome. We propose that this finding should in the future help to engineer cells for improved recombinant protein production. In addition to investigating the process of transgene integration, we designed recombination assays to better characterize the components of the MMEJ and SD-MMEJ pathways. We also used CHO cells expressing cycle-sensitive reporter genes to demonstrate a potential role of HR proteins in the cell cycle regulation.

The role of the microRNAs in the age-associated oancreatic β-cell dysfunction

Le corps humain emploie le glucose comme source principale d'énergie. L'insuline, sécrétée par les cellules ß-pancreatiques situées dans les îlots de Langerhans, est l'hormone principale assurant un maintien constant du taux de glucose sanguin (glycémie). Les prédispositions génétiques, le manque d'activité physique et un régime déséquilibré peuvent entraîner une perte de sensibilité à l'insuline et des taux de glucose dans le sang élevé (hyperglycémie), une condition nommée diabète de type 2. Cette maladie est initiée par une sensibilité diminuée à l'insuline dans les tissus périphériques, entraînant une demande accrue en insuline. Cette pression continue finie par épuiser les cellules ß-pancreatiques, qui sécrètent alors des niveaux d'insuline insuffisant en trainant l'apparition du diabète. Le vieillissement est un facteur de risque important pour les maladies métaboliques dont le diabète de type 2 faits partis. En effet la majeure partie des diabétiques de type 2 ont plus de 45 ans. Il est connu que le vieillissement entraine une perte de sensibilité à l'insuline, une sécrétion altérée d'insuline, une baisse de réplication et une plus grande mort des ß-cellules pancréatiques. Le but de ma thèse était de mieux comprendre les mécanismes contribuante au dysfonctionnement des cellules ß- pancréatiques lors du vieillissement. Les travaux du « Human Genome Project » ont révélés que seulement 2% de notre génome code pour des protéines. Le reste non-codant fut alors désigné sous le nom de « ADN déchets ». Cependant, l'étude approfondie de cet ADN non-codant ces dernières deux décennies a démontré qu'une grande partie code pour des «MicroARNs », des ARNs courts (20-22 nucleotides) découverts en 1997 chez le vers C.elegans. Depuis lors ces molécules ont été intensivement étudiées, révélant un rôle crucial de ces molécules dans la fonction et la survie des cellules en conditions normales et pathologiques. Le but de cette thèse était d'étudier le rôle des microARNs dans le dysfonctionnement des cellules ß lors du vieillissement. Nos données suggèrent qu'ils peuvent jouer un rôle tantôt salutaire, tantôt nocif sur les cellules ß. Par exemple, certains microARNs réduisent la capacité des cellules ß à se multiplier ou réduisent leur survie, alors que d'autres protègent ces cellules contre la mort. Pour conclure, nous avons démontré les microARNs jouent un rôle important dans le dysfonctionnement des cellules ß lors du vieillissement. Ces nouvelles découvertes préparent le terrain pour la conception de futures stratégies visant à améliorer la résistance des cellules ß pancréatiques afin de trouver de nouveaux traitements du diabète de type 2. -- Le diabète de type 2 est une maladie métabolique due à la résistance à l'action de l'insuline des tissus cibles combinée à l'incapacité des cellules ß pancréatiques à sécréter les niveaux adéquats d'insuline. Le vieillissement est associé à un déclin global des fonctions de l'organisme incluant une diminution de la fonction et du renouvellement des cellules ß pancréatiques. Il constitue ainsi un risque majeur de développement des maladies métaboliques dont le diabète de type 2. Le but de cette thèse était d'étudier le rôle des microARNs (une classe d'ARN non- codants) dans le dysfonctionnement lié au vieillissement des cellules ß. L'analyse par microarray des niveaux d'expression des microARN dans les îlots pancréatiques de rats Wistar mâles âgés de 3 et 12 mois nous a permis d'identifier de nombreux changements d'expression de microARNs associés au vieillissement. Afin d'étudier les liens entre ces modifications et le déclin des cellules ß, les changements observés lors du vieillissement ont été reproduits spécifiquement dans une lignée cellulaire, dans des cellules ß primaires de jeune rats ou de donneurs humains sains. La diminution du miR-181a réduit la prolifération des cellules ß, tandis que la diminution du miR-130b ou l'augmentation du miR-383 protège contre l'apoptose induite par les cytokines. L'augmentation du miR-34a induit l'apoptose et inhibe la prolifération des cellules ß en réponse aux hormones Exendin-4 et prolactine et au facteur de croissance PDGF-AA. Cette perte de capacité réplicative est similaire à celle observée dans des cellules ß de rats âgés de 12 mois. Dans la littérature, la perte du récepteur au PDGF-r-a est associée à la diminution de la capacité proliférative des cellules ß observée lors du vieillissement. Nous avons pu démontrer que PDGF-r-a est une cible directe de miR- 34a, suggérant que l'effet néfaste de miR-34a sur la prolifération des cellules ß est, du moins en partie, lié à l'inhibition de l'expression de PDGF-r-a. L'expression de ce miR est aussi plus élevée dans le foie et le cerveau des animaux de 1 an et augmente avec l'âge dans les ilôts de donneurs non-diabétiques. Ces résultats suggèrent que miR-34a pourrait être non seulement impliqué dans l'affaiblissement des fonctions pancréatiques associé à l'âge, mais également jouer un rôle dans les tissus cibles de l'insuline et ainsi contribuer au vieillissement de l'organisme en général. Pour conclure, les travaux obtenus durant cette thèse suggèrent que des microARNs sont impliqués dans le dysfonctionnement des cellules ß pancréatiques durant le vieillissement. -- Type 2 diabetes is a metabolic disease characterized by impaired glucose tolerance, of the insulin sensitive tissues and insufficient insulin secretion from the pancreatic ß-cells to sustain the organism demand. Aging is a risk factor for the majority of the metabolic diseases including type 2 diabetes. With aging is observed a decline in all body function, due to decrease both in cell efficiency and renewal. The aim of this thesis was to investigate the potential role of microRNAs (short non- coding RNAs) in the pancreatic ß-cell dysfunction associated with aging. Microarray analysis of microRNA expression profile in pancreatic islets from 3 and 12 month old Wistar male rats revealed important changes in several microRNAs. To further study the link between those alterations and the decline of ß-cells, the changes observed in old rats were mimicked in immortalized ß-cell lines, primary young rat and human islets. Downregulation of miR-181a inhibited pancreatic ß-cell proliferation in response to proliferative drugs, whereas downregulation of miR-130b and upregulation of miR-383 protected pancreatic ß-cells from cytokine stimulated apoptosis. Interestingly, miR-34a augmented pancreatic ß-cell apoptosis and inhibited ß-cell proliferation in response to the proliferative chemicals Exendin-4, prolactin and PDGF-AA. This loss of replicative capacity is reminiscent of what we observed in pancreatic ß-cells isolated from 12 month old rats. We further observed a correlation between the inhibitory effect of miR-34a on pancreatic ß-cell proliferation and its direct interfering effect of this microRNA on PDGF-r-a, which was previously reported to be involved in the age-associated decline of pancreatic ß-cell proliferation. Interestingly miR-34a was upregulated in the liver and brain of 1 year old animals and positively correlated with age in pancreatic islets of normoglycemic human donors. These results suggest that miR-34a might be not only involved in the age-associated impairment of the pancreatic ß-cell functions, but also play a role in insulin target tissues and contribute to the aging phenotype on the organism level. To conclude, we have demonstrated that microRNAs are indeed involved in the age-associated pancreatic ß-cell dysfunction and they can play both beneficial and harmful roles in the context of pancreatic ß-cell aging.

Role of high mobility group box-1 and protection of growth hormone and somatostatin in severe acute pancreatitis

In this study, we investigated the potential role of high-mobility group box 1 (HMGB1) in severe acute pancreatitis (SAP) and the effects of growth hormone (G) and somatostatin (S) in SAP rats. The rats were randomly divided into 6 groups of 20 each: sham-operated, SAP, SAP+saline, SAP+G, SAP+S and SAP+G+S. Ileum and pancreas tissues of rats in each group were evaluated histologically. HMGB1 mRNA expression was measured by reverse transcription-PCR. Levels of circulating TNF-α, IL-1, IL-6, and endotoxin were also measured. In the SAP group, interstitial congestion and edema, inflammatory cell infiltration, and interstitial hemorrhage occurred in ileum and pancreas tissues. The levels of HMGB1, TNF-α, IL-1, IL-6 and endotoxin were significantly up-regulated in the SAP group compared with those in the sham-operated group, and the 7-day survival rate was 0%. In the SAP+G and SAP+S groups, the inflammatory response of the morphological structures was alleviated, the levels of HMGB1, TNF-α, IL-1, IL-6, and endotoxin were significantly decreased compared with those in the SAP group, and the survival rate was increased. Moreover, in the SAP+G+S group, all histological scores were significantly improved and the survival rate was significantly higher compared with the SAP group. In conclusion, HMGB1 might participate in pancreas and ileum injury in SAP. Growth hormone and somatostatin might play a therapeutic role in the inflammatory response of SAP.

Resveratrol plays important role in protective mechanisms in renal disease - mini-review

Resveratrol (RESV) is a polyphenolic compound found in various plants, including grapes, berries and peanuts, and its processed foods as red wine. RESV possesses a variety of bioactivities, including antioxidant, anti-inflammatory, cardioprotective, antidiabetic, anticancer, chemopreventive, neuroprotective, renal lipotoxicity preventative, and renal protective effects. Numerous studies have demonstrated that polyphenols promote cardiovascular health. Furthermore, RESV can ameliorate several types of renal injury in animal models, including diabetic nephropathy, hyperuricemic, drug-induced injury, aldosterone-induced injury, ischemia-reperfusion injury, sepsis-related injury, and endothelial dysfunction. In addition, RESV can prevent the increase in vasoconstrictors, such as angiotensin II (AII) and endothelin-1 (ET-1), as well as intracellular calcium, in mesangial cells. Together, these findings suggest a potential role for RESV as a supplemental therapy for the prevention of renal injury.

The Role of MicroRNA Regulation of Cardiac Ion Channel in Arrhythmia

La fibrillation auriculaire (FA) est le trouble du rythme le plus fréquemment observé en pratique clinique. Elle constitue un risque important de morbi-mortalité. Le traitement de la FA reste un défi majeur en lien avec les nombreux effets secondaires associés aux approches thérapeutiques actuelles. Dans ce contexte, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la FA est essentielle pour le développement de nouvelles thérapies offrant un meilleur rapport bénéfice/risque pour les patients. La FA est caractérisée par i) un remodelage électrique délétère associé le plus souvent ii) à un remodelage structurel du myocarde favorisant la récurrence et le maintien de l’arythmie. La diminution de la période réfractaire effective au sein du tissu auriculaire est un élément clef du remodelage électrique. Le remodelage structurel, quant à lui, se manifeste principalement par une fibrose tissulaire qui altère la propagation de l’influx électrique dans les oreillettes. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la mise en place de ces deux substrats restent mal connus. Récemment, le rôle des microARNs (miARNs) a été pointé du doigt dans de nombreuses pathologies notamment cardiaques. Dans ce contexte les objectifs principaux de ce travail ont été i) d'acquérir une compréhension approfondie du rôle des miARNs dans la régulation de l’expression des canaux ioniques et ii) de mieux comprendre le rôle de ces molécules dans l’installation d’un substrat favorable a la FA. Nous avons, dans un premier temps, effectué une analyse bio-informatique combinée à des approches expérimentales spécifiques afin d’identifier clairement les miARNs démontrant un fort potentiel de régulation des gènes codant pour l’expression des canaux ioniques cardiaques humains. Nous avons identifié un nombre limité de miARNs cardiaques qui possédaient ces propriétés. Sur la base de ces résultats, nous avons démontré que l’altération de l'expression des canaux ioniques, observée dans diverse maladies cardiaques (par exemple, les cardiomyopathies, l’ischémie myocardique, et la fibrillation auriculaire), peut être soumise à ces miARNs suggérant leur implication dans l’arythmogénèse. La régulation du courant potassique IK1 est un facteur déterminant du remodelage électrique auriculaire associée à la FA. Les mécanismes moléculaires sous-jacents sont peu connus. Nous avons émis l’hypothèse que l'altération de l’expression des miARNs soit corrélée à l’augmentation de l’expression d’IK1 dans la FA. Nous avons constaté que l’expression de miR-26 est réduite dans la FA et qu’elle régule IK1 en modulant l’expression de sa sous-unité Kir2.1. Nous avons démontré que miR-26 est sous la répression transcriptionnelle du facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) et que l’activité accrue de NFATc3/c4, aboutit à une expression réduite de miR-26. En conséquence IK1 augmente lors de la FA. Nous avons enfin démontré que l’interférence in vivo de miR-26 influence la susceptibilité à la FA en régulant IK1, confirmant le rôle prépondérant de miR-26 dans le remodelage auriculaire électrique. La fibrose auriculaire est un constituant majeur du remodelage structurel associé à la FA, impliquant l'activation des fibroblastes et l’influx cellulaire du Ca2 +. Nous avons cherché à déterminer i) si le canal perméable au Ca2+, TRPC3, jouait un rôle dans la fibrose auriculaire en favorisant l'activation des fibroblastes et ii) étudié le rôle potentiel des miARNs dans ce contexte. Nous avons démontré que les canaux TRPC3 favorisent l’influx du Ca2 +, activant la signalisation Ca2 +-dépendante ERK et en conséquence activent la prolifération des fibroblastes. Nous avons également démontré que l’expression du TRPC3 est augmentée dans la FA et que le blocage in vivo de TRPC3 empêche le développement de substrats reliés à la FA. Nous avons par ailleurs validé que miR-26 régule les canaux TRPC3 en diminuant leur expression dans les fibroblastes. Enfin, nous avons montré que l'expression réduite du miR-26 est également due à l’activité augmentée de NFATc3/c4 dans les fibroblastes, expliquant ainsi l’augmentation de TRPC3 lors de la FA, confirmant la contribution de miR-26 dans le processus de remodelage structurel lié à la FA. En conclusion, nos résultats mettent en évidence l'importance des miARNs dans la régulation des canaux ioniques cardiaques. Notamment, miR-26 joue un rôle important dans le remodelage électrique et structurel associé à la FA et ce, en régulant IK1 et l’expression du canal TRPC3. Notre étude démasque ainsi un mécanisme moléculaire de contrôle de la FA innovateur associant des miARNs. miR-26 en particulier représente apres ces travaux une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour traiter la FA.

Regenerative potential of corneal endothelium from patients with fuchs endothelial corneal dystrophy

La dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD, pour l’abréviation du terme anglais « Fuchs endothelial corneal dystrophy ») est une maladie de l'endothélium cornéen. Sa pathogenèse est mal connue. Aucun traitement médical n’est efficace. Le seul traitement existant est chirurgical et consiste dans le remplacement de l’endothélium pathologique par un endothélium sain provenant de cornées de la Banque des yeux. Le traitement chirurgical, en revanche, comporte 10% de rejet immunologique. Des modèles expérimentaux sont donc nécessaires afin de mieux comprendre cette maladie ainsi que pour le développement de traitements alternatifs. Le but général de cette thèse est de développer un modèle expérimental de la FECD en utilisant le génie tissulaire. Ceci a été réalisé en trois étapes. 1) Tout d'abord, l'endothélium cornéen a été reconstruit par génie tissulaire en utilisant des cellules endothéliales en culture, provenant de patients atteints de FECD. Ce modèle a ensuite été caractérisé in vitro. Brièvement, les cellules endothéliales cornéennes FECD ont été isolées à partir de membranes de Descemet prélevées lors de greffes de cornée. Les cellules au deuxième ou troisième passages ont ensuite été ensemencées sur une cornée humaine préalablement décellularisée. Suivant 2 semaines de culture, les endothélia cornéens reconstruits FECD (n = 6) ont été évalués à l'aide d'histologie, de microscopie électronique à transmission et d’immunomarquages de différentes protéines. Les endothélia cornéens reconstruits FECD ont formé une monocouche de cellules polygonales bien adhérées à la membrane de Descemet. Les immunomarquages ont démontré la présence des protéines importantes pour la fonctionnalité de l’endothélium cornéen telles que Na+-K+/ATPase α1 et Na+/HCO3-, ainsi qu’une expression faible et uniforme de la protéine clusterine. 2) Deux techniques chirurgicales (DSAEK ; pour « Descemet stripping automated endothelial keratoplasty » et la kératoplastie pénétrante) ont été comparées pour la transplantation cornéenne dans le modèle animal félin. Les paramètres comparés incluaient les défis chirurgicaux et les résultats cliniques. La technique « DSAEK » a été difficile à effectuer dans le modèle félin. Une formation rapide de fibrine a été observée dans tous les cas DSAEK (n = 5). 3) Finalement, la fonctionnalité in vivo des endothélia cornéens reconstruits FECD a été évaluée (n = 7). Les évaluations in vivo comprenaient la transparence, la pachymétrie et la tomographie par cohérence optique. Les évaluations post-mortem incluaient la morphométrie des cellules endothéliales, la microscopie électronique à transmission et des immunomarquage de protéines liées à la fonctionnalité. Après la transplantation, la pachymétrie a progressivement diminué et la transparence a progressivement augmenté. Sept jours après la transplantation, 6 des 7 greffes étaient claires. La microscopie électronique à transmission a montré la présence de matériel fibrillaire sous-endothélial dans toutes les greffes d’endothelia reconstruits FECD. Les endothélia reconstruits exprimaient aussi des protéines Na+-K+/ATPase et Na+/HCO3-. En résumé, cette thèse démontre que les cellules endothéliales de la cornée à un stade avancé FECD peuvent être utilisées pour reconstruire un endothélium cornéen par génie tissulaire. La kératoplastie pénétrante a été démontrée comme étant la procédure la plus appropriée pour transplanter ces tissus reconstruits dans l’œil du modèle animal félin. La restauration de l'épaisseur cornéenne et de la transparence démontrent que les greffons reconstruits FECD sont fonctionnels in vivo. Ces nouveaux modèles FECD démontrent une réhabilitation des cellules FECD, permettant d’utiliser le génie tissulaire pour reconstruire des endothelia fonctionnels à partir de cellules dystrophiques. Les applications potentielles sont nombreuses, y compris des études physiopathologiques et pharmacologiques.

Characterisation and regulation of E2F-6 and E2F-6b in the rat heart: a potential target for myocardial regeneration?

The E2F transcription factors are instrumental in regulating cell cycle progression and growth, including that in cardiomyocytes, which exit the cell cycle shortly after birth. E2F-6 has been demonstrated to act as a transcriptional repressor; however, its potential role in normal cardiomyocyte proliferation and hypertrophy has not previously been investigated. Here we report the isolation and characterisation of E2F-6 and E2F-6b in rat cardiomyocytes and consider its potential as a target for myocardial regeneration following injury. At the mRNA level, both rat E2F-6 and the alternatively spliced variant, E2F-6b, were expressed in E18 myocytes and levels were maintained throughout development into adulthood. Interestingly, E2F-6 protein expression was down-regulated during myocyte development suggesting that it is regulated post-transcriptionally in these cells. During myocyte hypertrophy, the mRNA expressions of E2F-6 and E2F-6b were not regulated whereas E2F-6 protein was up-regulated significantly. Indeed, E2F-6 protein expression levels closely parallel the developmental withdrawal of myocytes from the cell cycle and the subsequent reactivation of their cell cycle machinery during hypertrophic growth. Furthermore, depletion of E2F-6, using anti-sense technology, results in death of cultured neonatal myocytes. Taken together, abrogation of E2F-6 expression in neonatal cardiomyocytes leads to a significant decrease in their viability, consistent with the notion that E2F-6 might be required for maintaining normal myocyte growth.