Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

Contraexemplos e raciocínio dedutivo

Tese de Doutoramento em Psicologia na área de especialização de Psicologia Cognitiva apresentada ao ISPA - Instituto Universitário

Contraexemplos e raciocínio dedutivo

Tese de Doutoramento apresentada ao ISPA - Instituto Universitário

Avaliação do desempenho de fundos de investimento de obrigações: evidência para o mercado Brasileiro

Dissertação de mestrado em Finanças

Avaliação do desempenho de carteiras de fundos verdes em diferentes estados de mercado

Dissertação de mestrado em Finanças

Variabilidade espacial da chuva durante o experimento LBA/TRMM 1999 na Amazônia

O objetivo desta pesquisa foi o de estudar a variabilidade espacial de chuvas convectivas na Amazônia, durante o experimento LBA/TRMM em 1999. Um conjunto de dados consistindo de 37 pluviômetros (divididos em 4 subconjuntos e com distância máxima entre eles de 50 km) foi utilizado, sendo estas medidas de pluviometria de meados de Dezembro de 1998 ao final de Fevereiro de 1999, que é o pico da estação chuvosa em Rondônia (sudoeste da Amazônia). A metodologia de correlação interestações (baseado em probabilidade condicional) e assumindo uma distribuição estatística log-normal bivariada foi aplicada aos dados de precipitação diária e os resultados mostraram que chuvas que ocorrem em uma distância inferior a 1 km de raio têm um alto valor de correlação (variando de 0,7 a 0,9) representando a validação de uma medida pontual de chuva. A curva ajustada da variação do coeficiente de correlação ( ro ) versus distância (d em km) foi: ro = 0,72 - 0,15 ln (d).

Os fatores de risco da rendibilidade das ações: análise e evidência empírica em países da Zona Euro

Tese de Doutoramento em Ciências Empresariais.

Estimação da função de sobrevivência em dados de eventos recorrentes com censura pela direita

Dissertação de mestrado em Estatística

Las Bases Políticas de la Emergencia. Un Estudio Multidimensional de las Relaciones entre el Poder Ejecutivo Nacional y el Poder Legislativo, 2003-2009

La relación del Gobierno de Kirchner con el poder Legislativo implicó un proceso de concentración del poder en manos del Ejecutivo, no obstante lo cual, a poco de iniciado el mandato de Cristina Fernández, la relación con el Congreso queda en el medio de una crisis que llegó a poner en duda la propia continuidad de la presidenta. Este proyecto pretende examinar las características de este proceso delegativo en sus diferentes dimensiones, con el fin de entender el origen de esta crisis y especificar sus alcances. En este marco, la dinámica de la relación entre el Congreso y el Ejecutivo pareciera corresponder a lo que especifica la Teoría del Cártel tal como ha sido reformulada por Jones y Hwang. Esta perspectiva, no obstante, se centra exclusivamente en los aspectos distributivos de la relación entre el Ejecutivo y el Legislativo, obviando la dimensión electoral y la ideológicodiscursiva. Dadas las características del Gobierno de Kirchner, en este proyecto abordaremos el estudio de aquella relación desde una perspectiva multidimensional, tomando en cuenta no sólo los aspectos distributivos, sino también los electorales y los discursivos. La pregunta que guía nuestro trabajo es por qué las estrategias de acumulación desplegadas simultáneamente en las tres dimensiones, no lograron (o sólo lo hicieron parcialmente) desactivar el carácter condicional de la delegación de los jefes políticos provinciales al liderzgo presidencial. Nuestra hipótesis general es que, aún cuando el Gobierno consiguió reforzar sustancialmente su posición en la dimensión distributiva a partir de la prolongación de la situación de emergencia, tuvo un éxito parcial en las dimensiones electoral e ideológico-discursiva. Sin compromiso ideológico articulado en un discurso común, y sin una conexión electoral que vincule los intereses electorales a nivel provincial con los del nivel nacional, la estrategia distributiva sólo puede contener parcialmente la defección de buena parte del oficialismo en el Congreso frente a una crisis de grandes proporciones.

Avaliação da flexibilidade: valores normativos do flexiteste dos 5 aos 91 anos de idade

FUNDAMENTO: O exercício físico é um instrumento de promoção de saúde e sua prescrição deve ser baseada em evidências científicas. A flexibilidade é um dos principais componentes da aptidão física, está relacionada ao desempenho e à saúde, e é definida como a amplitude máxima passiva fisiológica de um dado movimento articular. Considerando sua especificidade, a avaliação da flexibilidade deve contemplar diversos movimentos. Introduzido em 1980 e com a publicação de mapas redesenhados em 1986, o Flexiteste consiste na avaliação da mobilidade em uma escala de 0 a 4. Pela soma dos resultados da mobilidade de cada um dos vinte movimentos articulares testados, é possível obter um escore global denominado Flexíndice. OBJETIVO: Apresentar valores normativos atualizados do Flexiteste. MÉTODOS: Este trabalho baseia-se em dados de 4.711 indivíduos não-atletas (2.943 homens e 1.768 mulheres) com idade entre 5 e 91 anos. Todos os dados foram colhidos por avaliadores experientes e cerca de 70% deles pelo próprio autor do método. RESULTADOS: Considerando a distribuição não-paramétrica e a heterocedasticidade dos dados, optou-se por trabalhar com tabela de percentis para faixas etárias separadas por gêneros. O Flexíndice diminui com a idade, e os resultados femininos medianos são superiores aos masculinos para a mesma idade desde a infância, o que se acentua com o desenvolvimento físico e, posteriormente, com o envelhecimento. CONCLUSÃO: Esses dados normativos contribuem para o melhor conhecimento do comportamento da flexibilidade com a idade e o gênero, e favorecerão os profissionais que avaliam a flexibilidade na sua prática profissional.

Fatores de risco para acidente vascular encefálico após cirurgia de revascularização do miocárdio

FUNDAMENTO: O acidente vascular encefálico (AVE) é uma temida complicação após cirurgia de revascularização do miocárdio (CRM), com incidência entre 1,3% e 4,3%. OBJETIVO: Identificar fatores preditores de AVE após CRM, na era moderna da cirurgia cardíaca. MÉTODOS: Este é um estudo caso-controle de 65 pares de pacientes, no qual o pareamento foi realizado por sexo, idade (+ 3 anos) e data da CRM (+ 3 meses). Os casos são pacientes submetidos à CRM eletiva com circulação extracorpórea (CEC), que apresentaram AVE (definido como déficit clínico neurológico até 24 horas de pós-operatório e confirmado por exame de imagem), e os controles aqueles submetidos à CRM eletiva com CEC sem AVE. RESULTADOS: A análise univariada revelou que o número de vasos revascularizados foi associado com a ocorrência de AVE após a CRM (3 ± 0,8 vs. 2,76 ± 0,8, p = 0,01). Na análise multivariada por regressão logística condicional, a hipertensão arterial sistêmica [OR: 6,1 (1,5 - 24), p = 0,009] e o diabete melito [OR: 3,1 (1,09 - 11), p= 0,03] foram determinantes de maior chance de AVE após CRM, e o infarto agudo do miocárdio > 1 mês determinante de menor chance [OR: 0,1 (0,03 - 0,36), p = 0,003]. CONCLUSÃO: Hipertensão e diabete melito foram identificados como preditores independentes de AVE nas primeiras 24 horas de pós-operatório de CRM. Em pacientes com tais fatores de risco, é possível que o conhecimento dos mecanismos causadores da injúria cerebral represente uma estratégia capaz de diminuir a incidência de AVE após CRM.

Associação do índice tornozelo-braço com inflamação e alterações minerais ósseas em pacientes em hemodiálise

FUNDAMENTO: O índice tornozelo-braço (ITB) reduzido, inflamação e distúrbio mineral ósseo (DMO) estão associados com aumento no risco de morte e complicações cardiovasculares em pacientes em hemodiálise (HD), mas a relação entre esses fatores necessita ser elucidada. OBJETIVO: Avaliar a associação entre ITB anormal e DMO com inflamação em pacientes em HD. MÉTODOS: Esta análise transversal avaliou 478 pacientes em HD por pelo menos 1 ano. O ITB foi avaliado através de um Doppler portátil e manômetro de coluna de mercúrio. Os pacientes foram divididos em três grupos, de acordo com o ITB (baixo: <0,9, normal: 0,9 a 1,3, e alto: >1,3). As medidas de proteína C-reativa foram utilizadas como marcador inflamatório, enquanto a DMO foi avaliada através dos níveis de cálcio, fósforo e hormônio paratireoidiano intacto (iPTH). RESULTADOS: Os participantes tinham 54 (18 a 75) anos, 56% eram do sexo masculino, 17% eram diabéticos e estavam em HM por 5 (1 a 35) anos. A prevalência de ITB baixo, normal e alto AAI foi 26,8%, 64,6% e 8,6%, respectivamente. Usando um modelo de regressão logística condicional com procedimento backward, idade (p<0,001), diabetes (p= 0,001), e níveis de proteína C-reativa >6 mg/L (p= 0,006) estavam associados com a presença de ITB baixo, enquanto o sexo masculino (p<0,001), diabetes (p= 0,001) e produto cálcio x fósforo elevado (p= 0,026) estavam associados com ITB alto. CONCLUSÃO: Em pacientes em HD, a presença de diabetes estava associada com ITB alto e baixo. O risco de ter ITB baixo parece aumentar com a idade e inflamação, enquanto a DMO estava associada com ITB alto.

Avaluació de variables estàtiques i dinàmiques predictives del risc de reincidència en delinqüents sexuals: estudi d’una mostra dels interns de les presons de Catalunya

Aquest treball presenta un estudi sobre les variables de risc de reincidència d’un grup de 315 delinqüents sexuals. Els subjectes han estat obtinguts del total d’interns que van sortir en llibertat condicional o definitiva de les presons de Catalunya entre 1998 i 2003. La investigació té dues parts. Una primera quantitativa on s’analitza la capacitat predictiva de 18 variables representatives de la carrera delictiva, l’incompliment de les mesures de supervisió a la comunitat, la conflictivitat a la presó, el tractament i les condicions de la condemna. Durant un període de seguiment que va de tres anys i 10 mesos a nou anys i dos mesos s’ha enregistrat la reincidència en delictes sexuals, delictes violents, qualsevol tipus de delicte violent (tant sexual com no sexual) i reincidència general. A la segona part, qualitativa, s’han fet entrevistes semiestructurades a un grup de 14 delinqüents sexuals dels quals nou havien reincidit i cinc estaven en llibertat condicional. Si bé les variables més comunes a la investigació sobre delinqüència general han mostrat relació amb la reincidència general, només tres variables de la carrera delictiva han mostrat relació amb la reincidència sexual. L’estudi qualitatiu ha permès obtenir informació sobre la influència de les variables dinàmiques més importants. A partir de l’anàlisi del procés del delicte es configuren tres perfils de delinqüents sexuals que ja s’havien trobat a altres investigacions. A partir de la informació obtinguda es proposen algunes orientacions pels programes de tractament.

La mesura substitutiva de la pena de presó prevista a l’Art 89 Codi penal: aplicació judicial i pràctica penitenciària a Catalunya en el cas de dones penades

L’objecte de la recerca és analitzar l’aplicació a Catalunya de la mesura d’expulsió prevista a l’article 89 del Codi penal en el cas de les dones penades, fer-ne la valoració corresponent i, si s’escau, plantejar alternatives d’actuació. La recerca constata les dificultats d’aplicació del principi constitucional de reinserció i d’altres de previstos a la legislació penitenciària en relació amb el col•lectiu de penats estrangers en situació irregular. La pràctica penitenciària observada a Catalunya en els darrers anys ha fet una aposta clara per l’acolliment dels penats estrangers en el territori, en general, amb independència de la seva situació administrativa. Aquesta pràctica ha generat una important expectativa de romandre en el territori per part de bona part d’aquests penats. Per la seva banda, els jutges i tribunals han obviat en general i sota diversos arguments i fonaments el mandat del legislador en les diverses ocasions en què aquest ha fet l’aposta per l’expulsió dels penats estrangers en situació irregular. Aquesta posició oficial majoritària contrària a l’expulsió ha coincidit plenament amb el desig de la majoria de la població reclusa estrangera clarament contrària a la seva expulsió. Les diverses opcions legals que poden implicar el retorn del penat al seu país de residència resulten estranyament aplicades per part dels tribunals i en menor mesura per la mateixa Administració penitenciària. Aquesta no-actuació i la manca d’alternatives legals provoquen situacions divergents de caràcter negatiu que atempten clarament contra el principi d’igualtat, contra la finalitat reinsertadora de les penes i poden resultar generadores d’inseguretat pública. Conscients i coneixedors de les dificultats actuals, els autors estableixen diverses vies d’actuació en la línia de superar aquesta situació. Es proposa una reforma en profunditat de l’art. 89 del Codi penal i s’obre la via favorable a l’establiment d’una nova llibertat condicional per a penats estrangers en situació irregular i que han assolit el compliment de la meitat de la pena privativa imposada.

La utilització dels sistemes de control electrònic monitorat a la població penada de Catalunya

La present recerca té per objecte l’estudi de la utilització dels sistemes de control electrònic monitorat a la població penada a Catalunya. La finalitat principal del projecte és la d’analitzar l’adequació d’aquests sistemes als fins que la llei penal, processal i penitenciària els encomana i valorar la viabilitat d’ampliació de la utilització d’aquests sistemes. L’interès en la realització d’aquest estudi deriva de la constatació, per una banda, de l’existència d’una àmplia oferta de sistemes tecnològics, en constant desenvolupament i millora, que permeten un seguiment i control dels individus en la comunitat, i per altra banda, de la progressiva incorporació d’aquestes tecnologies en la legislació penal i penitenciària. La recerca parteix de la base que en l’actual context de presons superpoblades, de creixent volum de la població interna en centres penitenciaris i de recerca de mesures de major control del risc, l’anàlisi de l’ús que s’ha donat a aquest recurs legal i la valoració que de la seva utilització en fan els subjectes involucrats en la seva aplicació pot resultar cabdal per al disseny de noves polítiques penitenciàries. A més, la recerca hauria de permetre plantejar l’eventual extensió d’aquests sistemes a un major nombre de supòsits en el mateix context del tercer grau penitenciari o bé fins i tot plantejar la seva utilització en la llibertat condicional o en altres àmbits de l’execució penal.