Basic biochemical investigations as rationale for the design of original antimalarial drugs. An example of phospholipid metabolism

The future of antimalarial chemotherapy is particulary alarming in view of the spread of parasite cross-resistances to drugs that are not even structurally related. Only the availability of new pharmacological models will make it possible to select molecules with novel mechanisms of action, thus delaving resistance and allowing the development of new chemotherapeutic strategies. We reached this objective in mice. Our approach is hunged on fundamental and applied research begun in 1980 to investigate to phospholipid (PL) metabolism of intraerythrocytic Plasmodium. This metabolism is abundant, specific and indispensable for the production of Plasmodium membranes. Any drug to interfere with this metabolism blocks parasitic development. The most effective interference yet found involves blockage of the choline transporter, which supplies Plasmodium with choline for the synthesis of phosphatidylcholine, its major PL, this is a limiting step in the pathway. The drug sensitivity thereshold is much lower for the parasite, which is more dependent on this metabolism than host cells. The compounds show in vitro activity against P. falciparum at 1 to 10 nM. They show a very low toxicity against a lymphblastoid cell line, demonstrating a total abscence of correlation between growth inhibition of parasites and lymphoblastoid cells. They show antimalarial activity in vivo, in the P. berghei or P. chabaudi/mouse system, at doses 20-to 100-fold lower than their in acute toxicity limit. The bioavailability of a radiolabeled form of the product seemed to be advantageous (slow blood clearance and no significant concentration in tissues). Lastly, the compounds are inexpensive to produce. They are stable and water-soluble.

No role for CSF myelin basic protein levels in patients treated for childhood acute lymphoblastic leukemia

RESUME Introduction : La prophylaxie du système nerveux central lors d'un diagnostic de leucémie lymphoblastique aiguë de l'enfant a permis de réduire le risque de rechute mais a été associée dans certains cas à des neurotoxicités cliniques ou des anomalies radiologiques. Des moyens de prédire ces neurotoxicités font défaut, en particulier en raison de l'absence de corrélation claire entre les signes cliniques et les images radiologiques. Quelques auteurs ont suggéré que les taux de protéine basique de la myéline (MBP) mesurés dans le liquide céphalo-rachidien pouvaient avoir un intérêt dans ce contexte. Uné étude rétrospective de ces taux en relation avec des données cliniques et radiologiques est présentée dans ce travail. Matériel et Méthodes : Les taux de MBP mesurés dans le liquide céphalo-rachidien lors d'administration de chimiothérapie intrathécale, les examens cliniques neurologiques et les rapports radiologiques ont été rétrospectivement étudiés chez nos patients. Les données concernant des difficultés académiques éventuelles, ainsi que le niveau académique atteint ont été récoltées par l'intermédiaire de contacts téléphoniques réguliers organisés dans le cadre du suivi à long terme de nos patients. Résultats : Un total de 1248 dosages de MBP chez 83 patients, 381 examens neurologiques chez 34 patients et 69 rapports d'investigations neuroradiologiques chez 27 patients ont été analysés. Cinquante-deux patients ont eut au moins un taux anormal de MBP. Des anomalies radiologiques ont été décrites chez 47% de ces patients, parmi lesquels 14% ont présenté des difficultés scolaires sous une forme ou sous une autre. La proportion de patients ayant présenté des difficultés scolaires dans les groupes avec taux de MBP normal mais sans anomalies radiologiques décrites ou sans investigations radiologiques étaient respectivement de 0% et 3%, inférieurs dans tous les cas au groupe avec des taux normaux de MBP (100%, 22% and 5% respectivement). Discussion : Tout en prenant en compte les limitations dues à l'aspect rétrospectif de cette étude, nous avons conclu à une utilité limitée de ces dosages systématiques comme indicateur d'une neurotoxicité induite parle traitement dans le contexte de nos patients oncologiques. ABSTRACT Introduction : Central nervous system (CSF) prophylaxis of childhood acute lymphoblastic leukemia has dropped rates of relapses but has been associated wíth neurotoxicity and imaging abnormalities. Predictors of neurotoxícity are lacking, because of inconsistency between clinical symptoms and imaging. Some have suggested CSF Myelin Basic Protein (MBP) levels to be of potential interest. A retrospective analysis of MBP levels in correlation with clinical and radiological data is presented. Materials and Methods : MBP levels obtained at the time of intrathecals, charts, and neuroradiology reports were retrospectively analyzed. Academic achievement data were obtained from phone contacts with patients and families. Results : We retrieved 1248 dosages of MBP in 83 patients, 381 neurological exams in 34 patients and 69 neuroradiological investigations in 27 patients. Fifty-two patients had abnormal MBP levels. Radiological anomalies were present in 47% of those investigated, 14% of them having school difficulties. Proportions of patients with school difficulties in the groups with abnormal MBP levels but no radiological anomalies or with no radiological investigations were 0% and 3% respectively, which was lower than in the group of patients with normal MBP levels (100%, 22% and 5% respectively). Discussion : Notwithstanding the retrospective character of our study, we conclude that there is limited usefulness of systematic dosage of MBP as indicator of treatment-induced neurotoxicity in ALL patients.

Dibenzofuran degradation by Sphingomonas wittichii RW1 under environmental stresses

Sphingomonas wittichii is a gram-negative Alpha-proteobacterium, capable of degrading xenobiotic compounds such as dibenzofuran (DBF), dibenzo-p-dioxin, carbazole, 2-hydroxybiphenyl or nitro diphenyl ether herbicides. The metabolism of strain RW1 has been the subject of previous studies and a number of genes involved in DBF degradation have been characterized. It is known that RW1 posseses a unique initial DBF dioxygenase (encoded by the dxnAl gene) that catalyzes the first step in the degradation pathway. None of the organisms known to be able to degrade DBF have a similar dioxygenase, the closest match being the DBF dioxygenase from Rhodococcus sp. with an overall amino acid similarity of 45%. Genes participating in the conversion of the metabolite salicylate via the ortho-cleavage pathway to TCA cycle intermediates were identified as well. Apart from this scarce information, however, there is a lack of global knowledge on the genes that are involved in DBF degradation by strain RW1 and the influence of environmental stresses on DBF-dependent global gene expression. A global analysis is necessary, because it may help to better understand the behaviour of the strain under field conditions and suggest improvements for the current bioaugmentation practice. Chapter 2 describes the results of whole-genome analysis to characterize the genes involved in DBF degradation by RW1. Micro-array analysis allowed us to detect differences in gene transcription when strain RW1 was exposed to DBF. This was complemented by ultra-high throughput sequencing of mutants no longer capable of growing on salicylate and DBF. Some of the genes of the ortho-cleavage pathway were induced 2 to 4 times in the presence of DBF, as well as the initial DBF dioxygenase. However two gene clusters, named 4925 and 5102 were induced up to 19 times in response to DBF induction. The cluster 4925 is putatively participating in a meta-cleavage pathway while the cluster 5102 might be part of a gentisate pathway. The three pathways, ortho-cleavage, meta-cleavage and gentisate pathway seem to be active in parallel when strain RW1 is exposed to DBF, presenting evidence for a redundancy of genes for DBF degradation in the genome of RW1. Chapter 3 focuses on exploiting genetic tools to construct bioreporters representative for DBF degradation in RW1. A set of basic tools for genetic manipulation in Sphingomonas wittichii RW1 was tested and optimized. Both plasmids and mini-transposons were evaluated for their ability to be maintained in RW1 with or without antibiotic selection pressure, and for their ability to lead to fluorescent protein expression in strain RW1 from a constitutive promoter. Putative promoter regions of three of the previously found DBF-induced genes (Swit_4925, Swit_5102 and Swit_4897-dxnAl) were then used to construct eg/^-bioreporters in RW1. Chapter 4 describes the use of the constructed RW1-based bioreporter strains for examining the expression of the DBF degradation pathway genes under microcosm conditions. The bioreporter strains were first exposed to different carbon sources in liquid culture to calibrate the egfp induction. Contrary to our expectations from micro-array analysis only the construct with the promoter from gene cluster 4925 responded to DBF, whereas the other two constructs did not show specific induction with DBF. The response from the bioreporters was subsequently tested for sensitivity to water stress, given that this could have an important impact in soils. Exposure to liquid cultures with decreasing water potential, achieved by NaCl or PEG addition to the growth media, showed that eGFP expression in RW1 from the promoter regions 4925 and 5102 was not directly influenced by water stress, but only through an overall reduction in growth rate. In contrast, expression of eGFP from the dxnAl or an uspA promoter was also directly dependent on the extent of water stress. The RW1 with the 4925 construct was subsequently used in soil microcosms to evaluate DBF bioavailability to the cells in presence or absence of native microbiota or other contaminated material. We found that RW1 could grow on DBF added to soil, but bioreporter expression suggested that competition with native microbiota for DBF intermediates may limit its ability to proliferate to a maximum. Chapter 5 describes the results from the experiments carried out to more specifically detect genes of RW1 that might be implicated in water stress resistance. Hereto we created transposon mutagenesis libraries in RW1, either with a classical mini-Tn5 or with a variant that would express egfp when the transposon would insert in a gene induced under water stress. Classical mutant libraries were screened by replica plating under high and low water stress conditions (achieved by adding NaCl to the agar medium). In addition, we screened for smaller microcolonies formed by mutants in agarose beads that could be analized with flow cytometry. A number of mutants impaired to grow on NaCl-supplemented media were recovered and the transposon insertion sites sequenced. In a second procedure we screened by flow cytometry for mutants with a higher eGFP production after exposure to growth medium with higher NaCl concentrations. Mutants from both libraries rarely overlapped. Discovered gene functions of the transposon insertions pointed to compatible solute synthesis (glutamate and proline), cell membrane synthesis and modification of cell membrane composition. The results obtained in the present study give us a more complete picture of the mechanisms of DBF degradation by S. wittichii RW1, how it reacts to different DBF availability and how the DBF catabolic activity may be affected by the conditions found in contaminated environments. - Sphingomonas wittichii est une alpha-protéobactérie gram-négative, capable de dégrader des composés xénobiotiques tels que le dibenzofurane (DBF), la dibenzo-p-dioxine, le carbazole, le 2-hydroxybiphényle ou les herbicides dérivés du nitro-diphényléther. Le métabolisme de la souche RW1 a fait l'objet d'études antérieures et un certain nombre de gènes impliqués dans la dégradation du DBF ont été caractérisés. Il est connu que RW1 possède une unique dioxygénase DBF initiale (codée par le gène dxnAl) qui catalyse la première étape de la voie de dégradation. Aucun des organismes connus pour être capables de dégrader le DBF n'a de dioxygénase similaire. L'enzyme la plus proche étant la DBF dioxygénase de Rhodococcus sp. avec 45% d'acides aminés conservés. Les gènes qui participent à la transformation du salicylate en métabolites intermédiaires du cycle de Krebs par la voie ort/io-cleavage ont aussi été identifiés. Outre ces informations lacunaires, il y a un manque de connaissances sur l'ensemble des gènes impliqués dans la dégradation du DBF par la souche RW1 ainsi que l'effet des stress environnementaux sur l'expression génétique globale, en présence du DBF. Une analyse globale est nécessaire, car elle peut aider à mieux comprendre le comportement de la souche dans les conditions de terrain et de proposer des améliorations pour l'utilisation de la bio-augmentation comme technique de bio-remédiation. Le chapitre 2 décrit les résultats de l'analyse du génome pour caractériser les gènes impliqués dans la dégradation du DBF par RW1. Une analyse de micro-arrays nous a permis de détecter des différences dans la transcription des gènes lorsque la souche RW1 a été exposée au DBF. L'analyse a été complétée par le criblage à ultra-haut débit de mutants qui n'étaient plus capables de croître avec le salicylate ou le DBF comme seule source de carbone. Certains des gènes de la voie ortho-cleavage, dont la DBF dioxygénase initiale, ont xî été induits 2 à 4 fois, en présence du DBF. Cependant, deux groupes de gènes, nommés 4925 et 5102 ont été induits jusqu'à 19 fois en réponse au DBF. Le cluster 4925 participe probablement dans une voie de meta-cleavage tandis que le cluster 5102 pourrait faire partie d'une voie du gentisate. Les trois voies, ortho-cleavage, meta-cleavage et la voie du gentisate semblent être activées en parallèle lorsque la souche RW1 est exposée au DBF, ce qui représente une redondance de voies pour la dégradation du DBF dans le génome de RW1. Le chapitre 3 se concentre sur l'exploitation des outils génétiques pour la construction de biorapporteurs de la dégradation du DBF par RW1. Un ensemble d'outils de base pour la manipulation génétique dans Sphingomonas wittichii RW1 a été testé et optimisé. Deux plasmides et mini-transposons ont été évalués pour leur capacité à être maintenu dans RW1 avec ou sans pression de sélection par des antibiotiques, et pour leur capacité à exprimer la protéine fluorescente verte (eGFP) dans la souche RW1. Les trois promoteurs des gènes Swit_4925, Swit_5102 et Swit_4897 (dxnAl), induits en réponse au DBF, ont ensuite été utilisés pour construire des biorapporteurs dans RW1. Le chapitre 4 décrit l'utilisation des souches biorapportrices construites pour l'analyse de l'expression des gènes de la voie de dégradation du DBF dans des microcosmes avec différents types de sols. Les souches biorapportrices ont d'abord été exposées à différentes sources de carbone en cultures liquides afin de calibrer l'induction de la eGFP. La construction avec le promoteur du gène 4925 a permis une réponse au DBF. Mais contrairement à nos attentes, basées sur les résultats de l'analyse des micro-arrays, les deux autres constructions n'ont pas montré d'induction spécifique au DBF. La réponse des biorapporteurs a ensuite été testée pour la sensibilité au stress hydrique, étant donné que cela pourrait avoir un impact important dans les microcosmes. La diminution du potentiel hydrique en culture liquide est obtenue par addition de NaCl ou de PEG au milieu de croissance. Nous avons montré que l'expression de la eGFP contrôlée par les promoteurs 4925 et 5102 n'était pas directement influencée par le stress hydrique, mais seulement par une réduction globale des taux de croissance. En revanche, l'expression de la eGFP dépendante des promoteurs dxnAl et uspA était aussi directement dépendante de l'ampleur du stress hydrique. La souche avec la construction 4925 a été utilisée par la suite dans des microcosmes avec différents types de sols pour évaluer la biodisponibilité du DBF en présence ou absence des microbes indigènes et d'autres composés contaminants. Nous avons constaté que RW1 pouvait se développer si le DBF a été ajouté au sol, mais l'expression de la eGFP par le biorapporteur suggère que la compétition avec la microbiota indigène pour les métabolites intermédiaires du DBF peut limiter sa capacité à proliférer de manière optimale. Le chapitre 5 décrit les résultats des expériences réalisées afin de détecter spécifiquement les gènes de RW1 qui pourraient être impliquées dans la résistance au stress hydrique. Ici on a crée des bibliothèques de mutants de RW1 par transposon, soit avec un mini-Tn5 classique ou avec une variante qui exprime la eGFP lorsque le transposon s'insère dans un gène induit par le stress hydrique. Les bibliothèques de mutants ont été criblées par la méthode classique de repiquage sur boîtes, dans des conditions de stress hydrique élevé (obtenu par l'addition de NaCl dans les boîtes). En outre, nous avons criblé des micro¬colonies dans des billes d'agarose qui ont pu être analysées par cytométrie de flux. Un certain nombre de mutants déficients à croître sur des milieux supplémentés avec du NaCl ont été isolés et les sites d'insertion du transposon séquencés. Dans une deuxième procédure nous avons criblé par cytométrie de flux des mutants avec une production de eGFP supérieure, après exposition à un milieu de croissance avec une concentration élevée de NaCl. Les mutants obtenus dans les deux bibliothèques n'étaient pas similaires. Les fonctions des gènes où se trouvent les insertions de transposons sont impliqués dans la synthèse de solutés compatibles (glutamate et de la proline), dans la synthèse de la membrane cellulaire et dans la modification de la composition de la membrane cellulaire. Les résultats obtenus dans la présente étude nous donnent une image plus complète des mécanismes de dégradation du DBF par S. wittichii RW1, comment cette souche réagit à la disponibilité du DBF et comment l'activité catabolique peut être affectée par les conditions rencontrées dans des environnements contaminés.

Modified differentials and basic cohomology for Riemannian foliations

We define a new version of the exterior derivative on the basic forms of a Riemannian foliation to obtain a new form of basic cohomology that satisfies Poincaré duality in the transversally orientable case. We use this twisted basic cohomology to show relationships between curvature, tautness, and vanishing of the basic Euler characteristic and basic signature.

Index theory for basic Dirac operators on Riemannian foliations

In this paper we prove a formula for the analytic index of a basic Dirac-type operator on a Riemannian foliation, solving a problem that has been open for many years. We also consider more general indices given by twisting the basic Dirac operator by a representation of the orthogonal group. The formula is a sum of integrals over blowups of the strata of the foliation and also involves eta invariants of associated elliptic operators. As a special case, a Gauss-Bonnet formula for the basic Euler characteristic is obtained using two independent proofs.

Molecular Basis of Ribotype Variation in the Seventh Pandemic Clone and its O139 Variant of Vibrio cholerae

Ribotyping has been widely used to characterise the seventh pandemic clone including South American and O139 variants which appeared in 1991 and 1992 respectively. To reveal the molecular basis of ribotype variation we analysed the rrn operons and their flanking regions. All but one variation detected by BglI, the most discriminatory enzyme, was found to be due to changes within the rrn operons, resulting from recombination between operons. The recombinants are detected because of the presence of a BglI site in the 16S gene in three of the nine rrn operons and/or changes of intergenic spacer types of which four variants were identified. As the frequency of rrn recombination is high, ribotyping becomes a less useful tool for evolutionary studies and long term monitoring of the pathogenic clones of Vibrio cholerae as variation could undergo precise reversion by the same recombination event.

The Amazonia Variant of Vibrio cholerae: Molecular Identification and Study of Virulence Genes

The pathogenic O1 Amazonia variant of Vibrio cholerae has been shown previously to have a cytotoxin acting on cultured Vero and Y-1 cells, and to lack important virulence factors such as the cholera toxin (Coelho et al. 1995a). This study extends the molecular analysis of the Amazonia strains, detecting the presence of the toxR gene, with a very similar sequence to that of the El Tor and classical biotypes. The outer membrane proteins are analyzed, detecting a variation among the group of Amazonia strains, with three different patterns found. As a by-product of this work a polymerase chain reaction fragment was sequenced, reading part of the sequence of the Lon protease of the Amazonia strains. This gene was not previously described in V. cholerae, but its sequence is present in the TIGR database specific for this species.

Basic Surface Properties of Mononuclear Cells from Didelphis marsupialis

The electrostatic surface charge and surface tension of mononuclear cells/monocytes obtained from young and adult marsupials (Didelphis marsupialis) were investigated by using cationized ferritin and colloidal iron hydroxyde, whole cell electrophoresis, and measurements of contact angles. Anionic sites were found distributed throughout the entire investigated cell surfaces. The results revealed that the anionic character of the cells is given by electrostatic charges corresponding to -18.8 mV (cells from young animals) and -29.3 mV (cells from adult animals). The surface electrostatic charge decreased from 10 to 65.2% after treatment of the cells with each one of trypsin, neuraminidase and phospholipase C. The hydrophobic nature of the mononuclear cell surfaces studied by using the contact angle method revealed that both young and adult cells possess cell surfaces of high hidrofilicity since the angles formed with drops of saline water were 42.5°and 40.8°, respectively. Treatment of the cells with trypsin or neuraminidase rendered their surfaces more hydrophobic, suggesting that sialic acid-containing glycoproteins are responsible for most of the hydrophilicity observed in the mononuclear cell surfaces from D. marsupialis.