Caractérisation et évaluation de la virulence de souches cliniques de Clostridium perfringens chez le poulet à griller élevé sans antibiotique.

réalisé en cotutelle avec Marie Archambault

Spezifität der quantitativen Resistenz von Blättern und Früchten der Tomate (Lycopersicon ssp. L.) gegenüber Phytophthora infestans (Mont.) de Bary.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen Beitrag zur Resistenzforschung bei Tomaten gegenüber P. infestans zu leisten, um erste Grundlagen für eine mögliche Züchtungsstrategie auf Basis unterschiedlicher quantitativer Resistenzen zu erarbeiten. Hierzu wurde untersucht, inwieweit unterschiedliche qualitative und quantitative Resistenzen bei Tomatenblättern und -früchten vorliegen, und ob hierfür verantwortliche Mechanismen identifiziert werden können. Zudem wurde untersucht, ob isolatspezifische quantitative Resistenzen identifiziert werden können. Zu diesem Zweck wurde mit einer erweiterten Clusteranalyse, basierend auf einer modifizierten Sanghvi-T2 Distanz, ein statistisches Verfahren entwickelt, welches die Identifikation von quantitativen, isolatspezifischen Resistenzen unter der Berücksichtigung der Variabilität ermöglicht. Des weiteren wurde geprüft, inwieweit zwischen den Resistenzausprägungen auf dem Blatt und den Resistenzausprägungen auf der Frucht ein Zusammenhang besteht und inwieweit die im Labor beobachteten Resistenzen unter Freilandbedingungen eine Rolle spielen. Im Labortest wurde die qualitative und quantitative Blattresistenz von 109 Akzessionen aus elf Lycopersicon und Solanum Arten gegenüber zwölf unterschiedlich aggressiven und teilweise auch unterschiedlich virulenten P. infestans Isolaten untersucht (Kap. 3). Die Früchte von 38 Tomatensorten wurden auf ihre Resistenz gegenüber drei P. infestans Isolaten geprüft. Zusätzlich wurde der Einfluss der Fruchtnachreife auf die Resistenzeigenschaften der Tomatenfrüchte gegenüber P. infestans analysiert (Kap. 4). Insgesamt 40 Sorten wurden auch unter Feldbedingungen auf Blatt- und Fruchtbefall untersucht (Kap. 5). Die frühen Stadien der Infektion von Tomatenblättern mit P. infestans Sporangien wurden mikroskopisch bei acht Tomatensorten mit unterschiedlichen quantitativen Reaktionsprofilen und drei Isolaten untersucht (Kap. 6). Hierzu wurden die Entwicklungsstadien von P. infestans Sporangien nach 24h, 48h und 60h nach der Inokulation auf und im Blatt mit der Calcofluor und der KOH - Anilin Blau Färbung sichtbar gemacht. Das Auftreten und die Lokalisation von H2O2 im Blatt nach 48h und 60h nach der Inokulation in Reaktion auf die Infektion wurde mithilfe einer DAB (3,3′ - Diaminobenzidine) Färbung untersucht. Es wurden einige, z.T. auch wahrscheinlich neue, qualitative Blattresistenzen gegenüber P. infestans gefunden, jedoch war keine der 109 Akzessionen vollständig resistent gegenüber allen Isolaten. Für die quantitative Resistenz von Blättern lagen in vielen Fällen isolatspezifische Unterschiede vor. Die Sorte x Isolat Interaktionen konnten mit Hilfe der erweiterten Clusteranalyse erfolgreich analysiert werden und die Akzessionen in Gruppen mit unterschiedlichen quantitativen Resistenzprofilen bzgl. der Interaktion mit den Isolaten und des Resistenzniveaus eingeteilt werden. Für die Fruchtresistenz konnten keine qualitativen Resistenzen gegenüber den drei getesteten Isolaten gefunden werden. Im Gegensatz dazu unterschieden sich die Tomatensorten in ihrer quantitativen Resistenz und Sorten und Isolate interagierten signifikant. Auch für die Fruchtresistenz konnten Gruppen mit unterschiedlichen quantitativen Reaktionsprofilen gebildet werden. Insgesamt nimmt die Anfälligkeit von Tomatenfrüchten mit zunehmender Reife kontinuierlich und signifikant ab. Unter Laborbedingungen korrelierten nur die Sporulationskapazität der Früchte und der prozentuale Blattbefall. Im Feldversuch über zwei Jahre und mit bis zu 40 Tomatensorten war der Zusammenhang hoch signifikant, jedoch asymptotisch, d.h. bereits bei sehr geringem Blattbefall war der Fruchtbefall sehr hoch. Bei den Tomatenherkünften, die sowohl im Labor als auch im Feld auf ihre Anfälligkeit getestet wurden, erschienen die Blattanfälligkeiten ähnlich, während kein klarer Zusammenhang zwischen der Fruchtanfälligkeit im Feld und im Labor bestand. Die Entwicklung von P. infestans auf der Blattoberfläche war unabhängig von der Sorte. Sowohl beim Eindringen und der Etablierung von P. infestans ins Blatt als auch bei der damit verbunden H2O2 Aktivität im Wirt wurden deutliche isolat- und sortenspezifische Effekte gefunden, die aber nur zum Teil mit den quantitativen Unterschieden der Blattresistenz korrespondierten. Sorten, die bei hoher Resistenz unterschiedliche Reaktionsprofile aufweisen, sind grundsätzlich interessante Kreuzungspartner, um die quantitative Resistenz gegenüber P. infestans zu verbessern. Hier sind vor allem Sorten, die sich auch in ihrer H2O2 Aktivität unterscheiden von Interesse.

Espécies crípticas em Paracoccidioides brasiliensis: diferenciação antigênica e de resposta a fatores estressantes

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Análise da expressão gênica global da bactéria Xylella fastidiosa em laranja doce por microarranjos de DNA

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Increased carbon dioxide concentration in the air reduces the severity of Ceratocystis wilt in Eucalyptus clonal plantlets

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Comprehensive Analysis of Gene Expression Profiles of the Beet Armyworm Spodoptera exigua Larvae Challenged with Bacillus thuringiensis Vip3Aa Toxin

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Different extracts of Zingiber officinale decrease Enterococcus faecalis infection in Galleria mellonella

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Lepstospira interrogans shotgun phage display identified LigB as a heparin-binding protein

LigB is an adhesin from pathogenic Leptospira that is able to bind to extracellular matrix and is considered a virulence factor. A shotgun phage display genomic library was constructed and used for panning against Heparan Sulfate Proteoglycan (HSPG). A phage clone encoding part of LigB protein was selected in panning experiments and showed specific binding to heparin. To validate the selected clone, fragments of LigB were produced as recombinant proteins and showed affinity to heparin and to mammalian cells. Heparin was also able to reduce the binding of rLB-Ct to mammalian cells. Our data suggests that the glycosaminoglycan moiety of the HSPG is responsible for its binding and could mediate the attachment of the recombinant protein rLB-Ct. Thus, heparin may act as a receptor for Leptospira to colonize and to invade the host tissue. (C) 2012 Elsevier Inc. All rights reserved.

Molecular evolution of a malaria resistance gene (DARC) in primates

Genes involved in host-pathogen interactions are often strongly affected by positive natural selection. The Duffy antigen, coded by the Duffy antigen receptor for chemokines (DARC) gene, serves as a receptor for Plasmodium vivax in humans and for Plasmodium knowlesi in some nonhuman primates. In the majority of sub-Saharan Africans, a nucleic acid variant in GATA-1 of the gene promoter is responsible for the nonexpression of the Duffy antigen on red blood cells and consequently resistance to invasion by P. vivax. The Duffy antigen also acts as a receptor for chemokines and is expressed in red blood cells and many other tissues of the body. Because of this dual role, we sequenced a 3,000-bp region encompassing the entire DARC gene as well as part of its 5' and 3' flanking regions in a phylogenetic sample of primates and used statistical methods to evaluate the nature of selection pressures acting on the gene during its evolution. We analyzed both coding and regulatory regions of the DARC gene. The regulatory analysis showed accelerated rates of substitution at several sites near known motifs. Our tests of positive selection in the coding region using maximum likelihood by branch sites and maximum likelihood by codon sites did not yield statistically significant evidence for the action of positive selection. However, the maximum likelihood test in which the gene was subdivided into different structural regions showed that the known binding region for P. vivax/P. knowlesi is under very different selective pressures than the remainder of the gene. In fact, most of the gene appears to be under strong purifying selection, but this is not evident in the binding region. We suggest that the binding region is under the influence of two opposing selective pressures, positive selection possibly exerted by the parasite and purifying selection exerted by chemokines.

Untersuchungen zur Bedeutung von Histidinkinasen in Magnaporthe oryzae und zum Wirkmechanismus des Fungizids Fludioxonil

Das aus wissenschaftlicher und ökonomischer Sicht wichtigste Pflanzenpathogen M. oryzae entwickelte im Laufe der Evolution konservierte aber auch einzigartige Mechanismen zur Signaltransduktion. Das Erforschen dieser Mechanismen und Prozesse ist essenziell für das Verständnis von Differenzierungsprozessen bei der Pathogen-Wirt-Interaktion.rnIm ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Signalweg zur Osmoregulation, der „High Osmolarity Glycerol“ (HOG)-Signalweg, erstmals anhand physiologischer Experimente in entsprechenden Mutantenstämmen in M. oryzae untersucht. Dabei konnten klare Unter-schiede zum HOG-Signalweg von S. cerevisiae aufgezeigt werden. rnDas in M. oryzae bisher noch nicht beschriebene Gen MoYPD1, welches das Phosphotransferprotein MoYpd1p kodiert, wurde erfolgreich inaktiviert. Diese Inaktivierung ist in S. cerevisiae und vielen anderen Pilzen letal und resultierte bei M. oryzae in einer apathoge¬nen Albinomutante, deren Konidiogenese gestört ist. Insbesondere die Funktion des Phosphotransferproteins MoYpd1p, sowohl im Phosphorelaysystem des HOG-Signal¬wegs als auch im Wirkmechanismus des Fungizids Fludioxonil, konnte eindeutig mittels Y2H- und Western Blot-Analysen nachgewiesen werden.rnEs wurden entscheidende Fortschritte für das Verständnis des Aufbaus und der Funktion des HOG-Signalwegs sowohl als physiologisches Regulationssystem für Umweltreize als auch als Fungizidtarget im Pflanzenschutz erzielt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Zweikompo-nenten-Hybrid-Histidinkinase (HIK) MoSln1p als Signalsensor für Salzstress und MoHik1p als Signalsensor für Zuckerstress fungiert. Die Beteiligung der Histidinkinasen MoHik5p und MoHik9p als Sensorproteine für Hypoxie im HOG-Signalweg ist durchaus denk¬bar und wurde durch erste Ergebnisse bekräftigt. rnSo konnte der HOG-Signalweg in mehreren Modellen dargestellt werden. Die Modelle der Signalerkennung und –transduktion von osmotischem Stress, von Hypoxie und der Wirkmecha¬nismus von Fludioxonil wurden erstmals in diesem Umfang für M. oryzae ausgearbei¬tet.rnDer zweite Teil dieser Arbeit repräsentiert die erste umfassende Untersuchung aller zehn HIK-codierender Gensequenzen, die im Genom von M. oryzae identifiziert werden konnten. Diese Signalproteine waren bisher noch nicht Gegenstand wissenschaftlicher Studien. Die Untersuchung beginnt mit einer phylogenetischen Einordnung aller untersuchten Proteinsequen¬zen in die verschiedenen Gruppen von Histidinkinasen in Pilzen. Eine ausführli-che phänotypische Charakterisierung aller HIK-codierender Gene folgt und wurde anhand von Mutanten durchgeführt, in denen diese Gene einzeln inaktiviert wurden.rnDie Beteiligung von MoHik5p und MoHik9p als mögliche Sauerstoffsensoren im HOG-Signal-weg konnte dokumentiert werden und die anschließenden Western Blot-Analysen bestätig¬ten erstmals die Aktivierung des HOG-Signalwegs bei hypoxieähnlichen Zuständen.rnDes Weiteren wurden mit MoHik5p und MoHik8p zwei neue Pathogenitätsfaktoren in M. oryzae identifiziert. Die apathogenen Mutantenstämme ΔMohik5 und ΔMohik8 sind in der Konidiogenese gestört und nicht in der Lage Appressorien zu differenzieren. Der Einsatz dieser Proteine als Fungizidtarget im protektiven Pflanzenschutz in der Zukunft ist somit denk-bar.rn

Identification of novel rhoptry proteins in Neospora caninum by LC/MS-MS analysis of subcellular fractions

Apicomplexan parasites possess an apical complex that is composed of two secretory organelles recognized as micronemes and rhoptries. Rhoptry contents are secreted into the parasitophorous vacuole during the host cell invasion process. Several rhoptry proteins have been identified in Toxoplasma gondii and seem to be involved in host-pathogen interactions and some of them are considered to be important virulence factors. Only one rhoptry protein, NcROP2, has been identified and extensively characterized in the closely related parasite Neospora caninum, and this has showed immunoprotective properties. Thus, with the aim of increasing knowledge of the rhoptry protein repertoire in N. caninum, a subcellular fractionation of tachyzoites was performed to obtain fractions enriched for this secretory organelle. 2-D SDS-PAGE followed by MS and LC/MS-MS were applied for fraction analysis and 8 potential novel rhoptry components (NcROP1, 5, 8, 30 and NcRON2, 3, 4, 8) and several kinases, proteases and phosphatases proteins were identified with a high homology to those previously found in T. gondii. Their existence in N. caninum tachyzoites suggests their involvement in similar events or pathways that occur in T. gondii. These novel proteins may be considered as targets that could be useful in the future development of immunoprophylactic measures.

Ruminant organotypic brain-slice cultures as a model for the investigation of CNS listeriosis

Central nervous system (CNS) infections in ruminant livestock, such as listeriosis, are of major concern for veterinary and public health. To date, no host-specific in vitro models for ruminant CNS infections are available. Here, we established and evaluated the suitability of organotypic brain-slices of ruminant origin as in vitro model to study mechanisms of Listeria monocytogenes CNS infection. Ruminants are frequently affected by fatal listeric rhombencephalitis that closely resembles the same condition occurring in humans. Better insight into host-pathogen interactions in ruminants is therefore of interest, not only from a veterinary but also from a public health perspective. Brains were obtained at the slaughterhouse, and hippocampal and cerebellar brain-slices were cultured up to 49 days. Viability as well as the composition of cell populations was assessed weekly. Viable neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes were observed up to 49 days in vitro. Slice cultures were infected with L. monocytogenes, and infection kinetics were monitored. Infected brain cells were identified by double immunofluorescence, and results were compared to natural cases of listeric rhombencephalitis. Similar to the natural infection, infected brain-slices showed focal replication of L. monocytogenes and bacteria were predominantly observed in microglia, but also in astrocytes, and associated with axons. These results demonstrate that organotypic brain-slice cultures of bovine origin survive for extended periods and can be infected easily with L. monocytogenes. Therefore, they are a suitable model to study aspects of host-pathogen interaction in listeric encephalitis and potentially in other neuroinfectious diseases.

Establishment and characterization of a primary canine duodenal epithelial cell culture

Many mechanisms involved in the pathogenesis of chronic enteropathies or host-pathogen interactions in canine intestine have not been elucidated so far. Next to the clinical and in vivo research tools, an in vitro model of canine intestinal cell culture would be very helpful for studies at the cellular level. Therefore, the purpose of this study was to establish and characterize a primary canine duodenal epithelial cell culture. Neonatal duodenum was disrupted with trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and the mucosa scraped off and digested with collagenase and dispase. After centrifugation on a 2% sorbitol gradient, the cells were incubated at 37 degrees C in OptiMEM supplemented with Primocin, epidermal growth factor, insulin, hydrocortisone, and 10% fetal calf serum (FCS). After 24 h, the FCS concentration was reduced to 2.5%, and the temperature decreased to 33 degrees C. With this method, the cultures were growing to confluent monolayers within 5-6 d and remained viable for an average of 2 wk. Their epithelial nature was confirmed by electron microscopy and immunofluorescence staining using antibodies directed against specific cytokeratins, desmosomes, and tight junctions. The intestinal cells proliferated, as evidenced by immunolabeling with a Ki-67 antibody, and cryptal cell subpopulations could be identified. Furthermore, alkaline phosphatase and sucrase activity were detected.

Outer membrane porin M35 of Moraxella catarrhalis mediates susceptibility to aminopenicillins

BACKGROUND: The outer membrane protein M35 is a conserved porin of type 1 strains of the respiratory pathogen Moraxella catarrhalis. It was previously shown that M35 is involved in the uptake of essential nutrients required for bacterial growth and for nasal colonization in mice. The aim of this study was (i) to characterize the potential roles of M35 in the host-pathogen interactions considering the known multifunctionality of porins and (ii) to characterize the degree of conservation in the phylogenetic older subpopulation (type 2) of M. catarrhalis. RESULTS: Isogenic m35 mutants of the type 1 strains O35E, 300 and 415 were tested for their antimicrobial susceptibility against 15 different agents. Differences in the MIC (Minimum Inhibitory Concentration) between wild-type and mutant strains were found for eight antibiotics. For ampicillin and amoxicillin, we observed a statistically significant 2.5 to 2.9-fold MIC increase (p < 0.03) in the m35 mutants. Immunoblot analysis demonstrated that human saliva contains anti-M35 IgA. Wild-type strains and their respective m35 mutants were indistinguishable with respect to the phenotypes of autoagglutination, serum resistance, iron acquisition from human lactoferrin, adherence to and invasion of respiratory tract epithelial cells, and proinflammatory stimulation of human monocytes. DNA sequencing of m35 from the phylogenetic subpopulation type 2 strain 287 revealed 94.2% and 92.8% identity on the DNA and amino acid levels, respectively, in comparison with type 1 strains. CONCLUSION: The increase in MIC for ampicillin and amoxicillin, respectively, in the M35-deficient mutants indicates that this porin affects the outer membrane permeability for aminopenicillins in a clinically relevant manner. The presence of IgA antibodies in healthy human donors indicates that M35 is expressed in vivo and recognized as a mucosal antigen by the human host. However, immunoblot analysis of human saliva suggests the possibility of antigenic variation of immunoreactive epitopes, which warrants further analysis before M35 can be considered a potential vaccine candidate.

Proteomic analysis of the Theileria annulata schizont

The apicomplexan parasite, Theileria annulata, is the causative agent of tropical theileriosis, a devastating lymphoproliferative disease of cattle. The schizont stage transforms bovine leukocytes and provides an intriguing model to study host/pathogen interactions. The genome of T. annulata has been sequenced and transcriptomic data are rapidly accumulating. In contrast, little is known about the proteome of the schizont, the pathogenic, transforming life cycle stage of the parasite. Using one-dimensional (1-D) gel LC-MS/MS, a proteomic analysis of purified T. annulata schizonts was carried out. In whole parasite lysates, 645 proteins were identified. Proteins with transmembrane domains (TMDs) were under-represented and no proteins with more than four TMDs could be detected. To tackle this problem, Triton X-114 treatment was applied, which facilitates the extraction of membrane proteins, followed by 1-D gel LC-MS/MS. This resulted in the identification of an additional 153 proteins. Half of those had one or more TMD and 30 proteins with more than four TMDs were identified. This demonstrates that Triton X-114 treatment can provide a valuable additional tool for the identification of new membrane proteins in proteomic studies. With two exceptions, all proteins involved in glycolysis and the citric acid cycle were identified. For at least 29% of identified proteins, the corresponding transcripts were not present in the existing expressed sequence tag databases. The proteomics data were integrated into the publicly accessible database resource at EuPathDB (www.eupathdb.org) so that mass spectrometry-based protein expression evidence for T. annulata can be queried alongside transcriptional and other genomics data available for these parasites.