Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Il modello geotecnico delle strutture arginali in sponda sinistra del Po presso Dosolo (MN) per la verifica delle condizioni di stabilità delle scarpate lato fiume.

Nell’Ottobre 2015, a seguito di alcuni fenomeni di instabilità avvenuti in corrispondenza delle scarpate lato fiume in sponda sinistra del Po, nel tratto compreso tra Casalmaggiore (CR) e Dosolo (MN), l'Agenzia Interregionale per il fiume Po (AIPO) ha commissionato un' estesa campagna di indagini geognostiche. L'ampio database reso disponibile è stato utilizzato in questa tesi di laurea con l'obiettivo di sviluppare, in collaborazione con i tecnici AIPO, una valida procedura per analizzare i dissesti delle scarpate lato fiume in questo tratto del Po e per identificare gli eventuali interventi di messa in sicurezza più idonei. Lo studio proposto si prefigge i seguenti obiettivi: • La caratterizzazione geotecnica dei terreni costituenti le strutture arginali in esame ed il relativo substrato; • La definizione del modello geotecnico del sistema arginale; • La valutazione della stabilità dell'argine; • La individuazione degli interventi di messa in sicurezza delle scarpate. Attraverso l’elaborazione delle prove CPTU è stato possibile determinare la stratigrafia e i parametri geotecnici delle diverse unità stratigrafiche presenti nelle sezioni considerate significative. Sono state quindi effettuate una serie di analisi con il metodo all'equilibrio limite, verificando la stabilità delle scarpate in condizioni di magra ordinaria e in condizioni di rapido svaso. Tenendo conto che la maggior parte dei tratti analizzati aveva già manifestato segni di instabilità o comunque indicava condizioni prossime al limite dell’equilibrio, si è proceduto in "back analysis" alla individuazione dei parametri di resistenza al taglio operativi, tenendo conto della variabilità degli stessi nell'ambito di una stessa unità stratigrafica. Infine tenendo presente i criteri di progetto degli interventi normalmente adottati sulle sponde, è stato possibile procedere alla modellazione di interventi mirati ad aumentare il fattore di sicurezza, analizzandone i relativi vantaggi e svantaggi.

Caratterizzazione, analisi a ritroso e di stabilità attuale di uno scorrimento traslativo in Marnoso Arenacea (Casola Valsenio, RA)

Il lavoro di tesi consiste nella caratterizzazione, nell’analisi a ritroso e di stabilità attuale di un fenomeno franoso avvenuto a Casola Valsenio, in provincia di Ravenna. La caratterizzazione è comprensiva di analisi geomorfologica dell’area, indagine sismo-stratigrafica e indagine geotecnica di laboratorio. Quindi è stato definito il meccanismo di rottura della frana e sono stati cartografati gli elementi morfologici costituenti l’area di frana. L’indagine geofisica si basa su tecniche ad onde di superficie e include misure tromografiche di rumore sismico ambientale e misure attive multicanale. Queste forniscono, rispettivamente, le curve H/V e gli spettri di velocità di fase e di gruppo, dalle quali è possibile ricavare informazioni di carattere stratigrafico. La caratterizzazione fisico meccanica del materiale pelitico marnoso, prelevato sul piano di scorrimento basale, include analisi granulometrica, determinazione dei limiti di consistenza e test di taglio anulare per ottenere il valore di angolo di attrito residuo. Le informazioni ottenute dalle indagini hanno consentito di definire il modello geologico tecnico del fenomeno, che viene rappresentato rispetto a quattro sezioni, tre relative alla situazione attuale e una relativa al versante prefrana. Sulla base di questi sono state condotte delle analisi a ritroso, che hanno consentito di ricavare le condizioni idrauliche del versante al momento della rottura, per differenti combinazioni di geometria del cuneo e diagramma di spinta dell’acqua. Grazie ai risultati ottenuti in modalità backward, sono state effettuate le analisi di stabilità della scarpata attuale, aventi lo scopo di determinare la distanza orizzontale tra scarpata e frattura di trazione che determinerebbe una situazione di instabilità. Infine sono state condotte analisi di sensitività rispetto ai parametri geometrici del cuneo, di resistenza del materiale e di riempimento idraulico della frattura dii trazione.

Effetto delle condizioni ambientali nella presenza di Escherichia coli in vongole lupino (Chamelea gallina L.)

Lo scopo di questo elaborato è stato individuare una possibile correlazione tra le condizioni ambientali e la presenza di Escherichia coli in vongole lupino. I dati relativi a campioni raccolti nel periodo 2008-2015 nella zona tra Cervia e Fano sono stati messi in relazione con alcuni parametri quali salinità dell’acqua, temperatura, ossigeno di fondo, pH e livello del fiume Marecchia. Sono stati presi in considerazione oltre 350 campioni, in cui i conteggi di E. coli mediante tecnica MPN sono stati suddivisi in tre categorie: cariche basse (<50 MPN/100g); cariche intermedie (50-230 MPN/100g); cariche alte, ossia non conformi al regolamento europeo (>230 MPN/100g). L’eventuale significatività della relazione tra E. coli e le variabili considerate è stata valutata attraverso il test chi-quadrato e il test di Kruskal-Wallis. Per quanto riguarda il test chi-quadrato, eseguito in relazione ad anno, mese e stagione, si è visto che i campioni più inquinati derivano dagli anni 2010 e 2012, dai mesi novembre/dicembre e in generale dalla stagione autunnale. L’analisi della varianza tramite test di Kruskal-Wallis ha evidenziato che le frequenze dei campioni nelle tre categorie non sono significative in relazione alla salinità. Al contrario, per i parametri temperatura e livello del fiume Marecchia sono stati ottenuti risultati significativi: infatti, le cariche microbiche più alte corrispondono a temperature più basse delle acque e a periodi di maggiore portata del fiume. Questo episodio riflette sicuramente un aspetto biologico legato al ciclo vitale di Chamelea gallina, che vive la sua fase riproduttiva nella stagione più calda, diminuendo quindi la sua attività filtrante, fonte di contaminazione. Al contempo questo andamento è anche spiegabile dall’apporto di contaminanti dalle precipitazioni e dai fiumi che trascinano sostanze organiche inquinanti di natura antropica, che costituiscono fonte di nutrimento per le specie microbiche come E. coli ed altri enterobatteri.

Split Up. Smart feature per contenitori asettici per liquidi basata sulla progettazione strutturale e grafica di finestre trasparenti

Il lavoro di tesi concerne la progettazione di un contenitore asettico per liquidi. In particolare, consiste nella creazione di aree/finestre trasparenti, ricavate sulla superficie del contenitore, con la funzione di indicatore di livello del liquido. Gli step che hanno delineato il lavoro consistono in un'analisi brevettuale, studio dei materiali di produzione, verifica tecnica e strutturale, progettazione grafica e test di validazione dell'idea.

Valutazione del contenuto di Escherichia Coli in vongole veraci (Tapes Philippinarum) raccolte nella zona della Sacca di Goro

Lo scopo di questo lavoro è stato individuare una possibile correlazione tra le condizioni ambientali e la presenza di Escherichia coli in vongole veraci. I dati sono relativi a campioni raccolti nel periodo 2007-2015 nella zona Sacca di Goro. Essi sono stati messi in relazione con alcuni parametri quali: salinità dell’acqua, temperatura, ossigeno di fondo, pH e livello del fiume Po di Volano. Sono stati presi in considerazione più di 523 campioni, in cui i conteggi di E. coli, mediante metodo MPN, sono stati suddivisi in tre categorie: cariche basse (<50 MPN/100g); intermedie (50-230 MPN/100g); alte, ovvero non conformi al regolamento europeo (>230 MPN/100g). La significatività della relazione tra E. coli e le variabili considerate è stata valutata attraverso il test Χ2 e il test di Kruskal-Wallis. Il test Χ2, è stato attuato ponendo in relazione anno, mese e stagione. In esso non è stato registrato nessun risultato significativo. L’analisi della varianza tramite test di Kruskal-Wallis ha evidenziato che gli unici risultati ottenuti, dando luogo ad una differenza significativa, sono relativi ai valori di salinità, dove in presenza di valori più bassi si osserva un numero maggiore di campioni con carica superiore al limite di legge. I dati ottenuti ponendo in relazione la temperatura delle acque e il livello del fiume Po di Volano non sono risultate significativamente diverse fra loro. Questi risultati sono chiaramente correlati al processo di depurazione delle vongole veraci che abbassano la carica microbica, ma ciò è correlato anche ai miglioramenti dei controlli delle acque reflue della Pianura Padana negli ultimi decenni, inoltre l’assenza di relazioni può essere imputata al fatto che la Sacca di Goro è un tratto di mare relativamente chiuso e quindi in qualche modo protetto dalle fluttuazioni stagionali di questi parametri, in una sorta di omeostasi ambientale.

Deep-learning applicato all'identificazione automatica di frutta in immagini

Analisi delle fasi per la realizzazione di uno strumento di supporto gli agricoltori, dalla creazione di un dataset, all'addestramento e test di una rete neurale artificiale, con obiettivo la localizzazione del prodotto agricolo all'interno delle immagini.

Sviluppo di nuovi algoritmi di pianificazione per sistemi non olonomici e con dinamica non linerare

L'obiettivo del kinodynamic motion planning è quello di determinare una sequenza di input di controllo per guidare un agente da uno stato iniziale ad uno finale, rispettando la dinamica del corpo e i vincoli fisici. In questa tesi sono presentate diverse versioni di algoritmi basati su Rapidly-exploring Random Tree in grado di risolvere questo tipo di problema. In particolare è preso in considerazione il caso di un sistema non lineare con vincoli non olonomici, rappresentativo del rover in dotazione al progetto europeo SHERPA. La qualità degli approcci proposti è inoltre provata con alcuni test di navigazione, in ambiente simulato, confrontando gli algoritmi proposti con alcuni presi nella letteratura di riferimento.

Misura UHF (Ultra High Frequency) delle scariche parziali nei sistemi isolati a gas: metodologie per la verifica della sensibilità di misura

Le apparecchiature di manovra tramite isolamento a gas (GIS) sono in funzione da più di 45 anni e hanno dimostrato un alto livello di affidabilità, con tassi di difetto molto bassi. Tuttavia, il riscontro pratico indica che alcuni dei guasti che si verificano durante il servizio sono legati a difetti del sistema di isolamento. Molti di questi difetti possono essere rilevati tramite diagnostica con scariche parziali (PD). Per la rilevazione PD, viene utilizzato il metodo UHF perché meno sensibile ai disturbi e quindi più facile da gestire in confronto al metodo convenzionale secondo IEC 60270. Un rapporto di Electra pubblicato nel 1999 dal CIGRE Task Force 15/33.03.05 descrive la procedura in due fasi per la verifica della sensibilità del sistema UHF in modo molto generale. Dopo 15 anni dalla sua applicazione, è diventata necessaria una descrizione più dettagliata, sia su misure necessarie al test di laboratorio (Passaggio 1) che sul test in loco (Passaggio 2).

Analisi della stabilità motoria durante il cammino: come gli indici di variabilità e stabilità dell'accelerazione del centro di massa sono influenzati da processi cognitivi (dual-task)

La valutazione strumentale del cammino è solitamente svolta chiedendo ai soggetti semplicemente di camminare (ST). Tale condizione non rappresenta la quotidianità. Infatti, nella vita di tutti i giorni la locomozione richiede di adattarsi alle necessità individuali e il coinvolgimento di attività cognitive. I paradigmi di Dual-Task (DT) sono utilizzati per valutare i cambiamenti nella strategia di controllo del cammino in situazioni di vita quotidiana. In particolare, gli indici di performance, di variabilità e di stabilità, utilizzati nella valutazione del controllo motorio, potrebbero essere utili per valutare le interferenze cognitive durante il cammino. L’obiettivo del lavoro è di valutare come tali indici cambiano durante il Dual-Task. Sono stati reclutati 16 studenti, giovani e sani, della Facoltà di Ingegneria Biomedica di Cesena, ai quali è stato chiesto di compiere un cammino rettilineo di 250 m, senza ostacoli, all’aperto, in due condizioni: svolgendo la sola attività di cammino (ST); aggiungendo al precedente task, una sottrazione consecutiva di 7 ad alta voce, partendo da un numero casuale (DT). Tramite tre sensori inerziali tri-assiali, posti sul tronco (L5) e sulle caviglie, sono stati acquisiti i segnali di accelerazione e velocità angolare. Dopo aver calcolato, a partire da tali dati, indici di performance (numero di passi, cadence, velocità e tempo di esecuzione del test), di variabilità (Standard Deviation, Coefficient of Variation, Index of the Variance, Nonstationary Index, Poincare 4 Plots) e di stabilità (Harmonic Ratio e Index of Harmonicity), nelle due condizioni (ST e DT), è stata eseguita un’analisi statistica tra i due task. Le analisi statistiche condotte su tali indici hanno evidenziato che il DT influenza prevalentemente gli indici di performance (numero di passi, cadence, velocità e tempo di esecuzione del test) e in grado minore gli indici di variabilità e stabilità.

Applicazione della tempra laser nel trattamento di pulegge in ghisa sferoidale

Nel seguente elaborato viene trattato il tema dell'applicabilità della tempra laser sulla ghisa perlitica sferoidale, al fine di incrementarne la resistenza ad usura e di ridurre i tempi di lavorazione, rispetto ai metodi tradizionali di tempra. All'introduzione sulla tecnologia laser e sul suo uso in ambito industriale, seguono una dettagliata presentazione dei test di laboratorio effettuati e un'analisi dei dati ricavati, con l'obiettivo di trovare la metodologia di trattamento migliore per raggiungere i risultati desiderati.

Hypothesis test for changes in variance using a statistic based in P-values in a time series of normal independent observations.

The present work proposes a Hypothesis Test to detect a shift in the variance of a series of independent normal observations using a statistic based on the p-values of the F distribution. Since the probability distribution function of this statistic is intractable, critical values were we estimated numerically through extensive simulation. A regression approach was used to simplify the quantile evaluation and extrapolation. The power of the test was simulated using Monte Carlo simulation, and the results were compared with the Chen test (1997) to prove its efficiency. Time series analysts might find the test useful to address homoscedasticity studies were at most one change might be involved.

Ottimizzazione mediante codici di calcolo open source di componenti per il settore aerospaziale

Lo scopo della presente tesi è sviluppare un ambiente per l'ottimizzazione strutturale di componenti per applicazione aerospaziale utilizzando codici open-source. In particolare, il codice Salome viene utilizzato per il disegno automatico delle strutture, il programma Code Aster permette di effettuare l'analisi agli elementi finiti del componente, mentre Octave viene utilizzato per svolgere l'ottimizzazione basata su un algoritmo euristico e per integrare fra di loro i differenti codici. Le tecniche di ottimizzazione dei componenti stanno rivestendo sempre più importanza visto che le moderne tecniche di Additive Manufacturing permettono di realizzare strutture molto complesse che un tempo non era conveniente (o possibile) realizzare con asportazione di materiale. Nella prima parte della tesi si descrivono gli strumenti software utilizzati e la loro integrazione al fine di parametrizzare la generazione di geometrie ed effettuare in modo automatico analisi strutturali. Successivamente si descrivono tre casi di studio in cui la metodologia è stata sperimentata: un primo caso di validazione in cui si è applicato il metodo alla definizione della geometria di minimo peso per una trave a sbalzo con carico concentrato, un secondo test di ottimizzazione di un longherone per aeromobile, un terzo caso applicativo legato alla ottimizzazione di un serbatoio per fluidi in pressione da utilizzare su un satellite.

Soil type does not affect seed ageing when soil water potential and temperature are controlled

To investigate the effects of soil type on seed persistence in a manner that controlled for location and climate variables, three weed species—Gomphocarpus physocarpus (swan plant), Avena sterilis ssp. ludoviciana (wild oat) and Ligustrum lucidum (broadleaf privet)—were buried for 21 months in three contrasting soils at a single location. Soil type had a significant effect on seed persistence and seedling vigour, but soil water content and temperature varied between soils due to differences in physical and chemical properties. Warmer, wetter conditions favoured shorter persistence. A laboratory-based test was developed to accelerate the rate of seed ageing within soils, using controlled superoptimal temperature and moisture conditions (the soil-specific accelerated ageing test, SSAAT). The SSAAT demonstrated that soil type per se did not influence seed longevity. Moreover, the order in which seeds aged was the same whether aged in the field or SSAAT, with L. lucidum being shortest-lived and A. sterilis being longest-lived of the three species.

Returning to Play after Concussion: A Phenomenological Study

This study examines and describes athletes’ felt sense of readiness returning to play following a concussion. Analyses of the interviews yielded a description of each participant’s experiences with concussions. Descriptions of this phenomenon generated by informants provide a detailed account of the unique issues athletes face when returning to play following a concussion. Participants’ descriptions highlight that in order to play, an athlete knows that he/she ought to be emotionally and physically ready to play. However, the athletes in this study believe that there is not an actual test that can “prove” this and that they can choose to lie and/or cheat the tests to return to play while they are still symptomatic. Athletes, parents, coaches, and trainers will benefit from learning to be better educated on the severity of concussions, concussion detection, assessment and the serious health consequences that can result from playing with a concussion.