Bionanoconjugados de Citocromo Tri- hémico e nanopartículas de Ouro para biorremediação de Cr(VI)

Dissertação para a obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

Estudo do efeito de radiação ionizante em metaloproteínas que ligam DNA

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Estratégias de alimentação para a optimização do processo de produção de PHAs por via bacteriana

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

O operão da proteína laranja: novas proteínas envolvidas na divisão celular em bactérias redutoras de sulfato

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Localização de mRNA em Drosophila melanogaster: estudo da proteína Ypsilon Schachtel

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Alergia a Perceves no Contexto da Síndrome Ácaros-Crustáceos-Moluscos-Baratas

Introdução: A tropomiosina dos invertebrados é o pan-alergénio que une crustáceos, moluscos, aracnídeos, insectos e parasitas, encontrando-se significativa homologia de sequência entre as proteínas dos vários grupos. Os perceves são um tipo de crustáceo particularmente apreciado e consumido no nosso país; no entanto, a alergia a este crustáceo é uma situação bastante rara da qual só existe um trabalho publicado na literatura. Caso clínico: Apresentamos o caso de uma criança do sexo masculino, de 9 anos de idade, com asma brônquica, rinoconjuntivite alérgica e eczema atópico, sensibilizada a ácaros e baratas. Aos 7 anos, 10 minutos após a primeira ingestão de perceves, refere síndrome de alergia oral, angioedema periorbitário e rinoconjuntivite. Aos 8 anos, ocorreram 4 episódios semelhantes após ingestão de caracol, camarão, lula e choco (referindo ingestão prévia destes alimentos sem queixas). Aos 9 anos, refere episódio de urticária da face e angioedema periorbitário com inalação de vapores de cozedura de camarão. Foram realizados testes cutâneos por prick que se revelaram positivos para perceves, camarão, caracol, lula, choco, polvo e amêijoa em natureza, e para gamba, caranguejo e mexilhão com extractos comerciais. Os doseamentos de IgE específica sérica revelaram-se positivos para camarão, caracol, lula, polvo e amêijoa, bem como para perceves e tropomiosina recombinante. Foi efectuado SDS-PAGE immunoblotting com extracto de perceves que revelou várias fracções alergénicas com grande variação de pesos moleculares (19-88 kDa); foi ainda efectuado estudo de inibição com D. pteronyssinus, que inibiu várias fracções fixadoras de IgE no extracto de perceves. Discussão: Apresenta-se um caso raro de uma criança, com quadro de alergia respiratória associada a sensibilização a ácaros e baratas, com alergia alimentar a crustáceos –incluindo a perceves – e moluscos gastrópodes, bivalves e cefalópodes. Foram caracterizados os alergénios implicados na alergia a perceves e demonstrada a presença da tropomiosina como alergénio implicado, bem como a reactividade cruzada entre estes crustáceos e os ácaros.

Expressão em Escherichia coli de antigénios do Cell fusing agent virus (Flaviviridae: Flavivirus) como proteína de fusão

RESUMO: O Cell Fusing Agent Vírus (CFAV), considerado como o primeiro “flavivírus específicos de insectos” (ISF), parece estar exclusivamente adaptado aos seus hospedeiros, não replicando em células de vertebrados. Apesar de ter sido identificado há mais de três décadas (1975), a verdade é que muito pouco se conhece sobre a sua biologia. Dado o seu parentesco filogenético com alguns outros flavivírus encontrados naturalmente em mosquitos de diferentes géneros colhidos em diferentes regiões do globo, este vírus poderá ser usado como modelo para o estudo de ISF. No entanto, necessitam do desenvolvimento de ferramentas básicas, tais como clones moleculares ou baterias de soros contendo anticorpos que reconheçam uma ou mais proteínas codificadas pelo genoma viral, produzidas, por exemplo, a partir de antigénios virais produzidos de forma recombinante. Com este trabalho pretendeu-se a optimização de protocolos que permitiram a expressão e purificação parcial de quatro proteínas [duas proteínas estruturais (C e E) e duas não estruturais (NS3hel e NS5B)] do CFAV em E. coli, todas elas produzidas como proteínas de fusão com “caudas” (tags) de hexahistidina nos seus extremos carboxilo. Para a expansão do CFAV foram utilizadas células Aedes albopictus (C6/36). Após a realização da extracção do RNA viral e a obtenção de cDNA, procedeu-se amplificação, por RT-PCR, das regiões codificantes das proteínas C, E, NS3hel e NS5B, utilizando primers específicos. Os quatro fragmentos de DNA foram independentemente inseridos no vector pJTE1.2/blunt usando E. coli NovaBlue como hospedeira de clonagem e, posteriormente, inseridos em vectores de expressão pET-28b e pET-29b usando E. coli BL21(DE3)pLysS e Rosetta(DE3)pLysS como hospedeiras de expressão. Após da indução, expressão e purificação das proteínas recombinantes C, E, NS3hel e NS5B, foi confirmada a autenticidade destas proteínas produzidas através do método Western Blot com um anticorpo anti-histidina. --------- ABSTRACT: The Cell Fusing Agent virus (CFAV) considered as the first "insect- specific flavivirus" (ISF) and seems to be uniquely adapted to their hosts, not replicating in vertebrate cells. Although it has been known for more than three decades (1975), the truth is very little is known about its biology. Given its close phylogenetic relationship with other flavivirus naturally circulating in various genera of mosquitoes collected from different regions of the globe, this virus could be used as a model for the study of ISF. However, such studies require the development of experimental basic tools, such as molecular clones or serum batteries containing antibodies that recognize one or more proteins encoded by the viral genome, produced, for example, from viral antigens recombinant produced. In this work, we carried out the optimization of protocols that allowed the expression and partial purification of four proteins [two structural proteins (C and E) and two nonstructural proteins (NS3hel and NS5B)] CFAV in E. coli as fusion protein for c-terminal hexahistidine tags. For the expansion of the CFAV we used Aedes albopictus (C6/36) cells. After completion of the viral RNA extraction and cDNA obtained, amplification of the coding regions of the C, E, NS5B and NS3hel proteins was carried out by RT-PCR using specific primers. The four DNA fragments were independently inserted into the vector pJTE1.2/blunt using E. coli NovaBlue as cloning host and then inserted into expression vectors pET-28b and pET-29b using E. coli BL21(DE3)pLysS and Rosetta(DE3)pLysS as expression host. After induction, expression and purification of recombinant C, E, NS3hel and NS5B proteins Western Blot analyses with an anti-histidine antibody confirmed the authenticity of these proteins produced.

Transglutaminases de Anopheles gambiae: caracterização molecular, bioquímica e histológica.

A malária é causada por parasitas protozoários do género Plasmodium spp, a sua transmissão aos humanos deve-se à picada infecciosa de mosquitos fêmea do género Anopheles spp, sendo Anopheles gambiae o vector mais eficiente de malária em todo o mundo. O intestino médio do mosquito representa um dos ambientes mais desafiantes à sobrevivência e desenvolvimento do parasita, e é, portanto, também um dos locais mais atraentes para novas estratégias de controlo da malária, pois é onde se observa uma diminuição acentuada na população de parasitas invasores. A transglutaminase (TGM) desempenha um papel importante e diversificado em mamíferos, tais como a coagulação e a formação da barreira epitelial, catalisando o “crosslinking” entre proteínas. Em invertebrados, como Drosophila sp, a proteína TGM mostrou estar envolvida na defesa imunitária. O mosquito A. gambiae tem codificado no seu genoma três TGMs, o gene AGAP009099, já caracterizado, é expresso exclusivamente nas MAGs (glândulas auxiliares masculinas). Os genes AGAP009098 e AGAP009100, cujas funções não foram ainda clarificadas, são expressos ubiquamente e em baixos níveis. No presente trabalho, propõe-se a caracterização das duas proteínas codificadas por estes genes, de forma a identificar o modo como estas proteínas interagem dentro do mosquito, a esclarecer o seu papel na invasão do intestino médio de A. gambiae por Plasmodium spp., o que permitirá averiguar o seu envolvimento ao nível da imunidade inata do mosquito. Foi produzida e purificada a proteína recombinante AgTGM98-1, que se utilizou para a produção de um anticorpo anti-AgTGM98. A atividade de TGM no mosquito não se mostrou estatisticamente significativa entre os estadios larvares, pupas e adultos. A caracterização bioquímica de AgTGM98 e AgTGM100 revelou a possível existência de proteínas do tipo TGM. Através de western blotting, verificou-se uma diminuição de AgTGM98, comparando mosquitos não infetados com infetados por P. berghei, o que sugere alterações na expressão desta proteína face à invasão pelo parasita, o que pode significar o seu envolvimento direto na infeção. Caracterizou-se, por imunohistoquímica (IHC) a localização de AgTGM98 e AgTGM100 em intestinos médios de mosquitos. A proteína AgTGM98 apresentou uma localização membranar, na parte basal do intestino médio e com distribuição ao longo deste. Contrariamente, a AgTGM100 tem uma localização intracelular e uma distribuição presente apenas no proventrículo e zona mais apical do intestino médio durante uma fase da sua existência, sendo com o passar do tempo detectada em todo o intestino médio.

Seroprevalência e subtipos do vírus da hepatite C circulantes em indivíduos co-infectados com o vírus da imunodeficiência humana

Mundialmente, estima-se que 40 milhões de pessoas estejam infectadas com VIH, 5 milhões das quais cronicamente infectadas com VHC. A co-infecção com VIH aumenta a taxa de persistência do VHC, acelera a velocidade de progressão da doença hepática e reduz significativamente a resposta à terapia do VHC. O VHC possui extensa diversidade genética, sendo classificado em seis genótipos e cerca de 90 subtipos com padrões epidemiológicos e resposta à terapia distintos. Tendo isto presente e devido a serem limitados os dados relativos aos genótipos e subtipos do VHC circulantes em Portugal e ainda ao facto de os utilizadores de drogas injectáveis (UDIs) serem um grupo de risco importante para a co-infecção por VIH e VHC, realizámos um estudo retrospectivo para determinar a prevalência da infecção por VHC e a distribuição de subtipos deste vírus num grupo de UDIs infectados com VIH. Amostras de plasma de 66 indivíduos (1998-2001) foram testadas para anticorpos anti-VHC (ensaio imunoenzimático) e RNA do VHC (amplificação da 5’UTR por RT-PCR). Para identificar os subtipos de VHC e detectar recombinantes, as amostras com RNA viral detectável foram sujeitas a amplificação, sequenciação e análise filogenética de sequências nucleotídicas parciais para C/E1 e NS5B. Encontrámos que 86,4% dos indivíduos possuíam anticorpos anti-VHC, 93,0% dos quais com infecção activa. Todas as amostras, exceptuando duas, com RNA viral detectável originaram amplicões para C/E1 e NS5B. A análise filogenética permitiu incluir as estirpes de VHC nos subtipos 1a (43,8%), 1b (3,6%), 2a (1,8%), 3a (21,1%), 4a (8,8%) e 4d (15,8%), revelando um padrão epidemiológico semelhante ao dos UDIs de outros países do Sul da Europa. Apenas uma amostra apresentou discordância entre os subtipos das duas regiões (4d para C/E1 e 4a para NS5B) sugerindo um potencial recombinante intragenótipo. No total, os subtipos 1a, 4a e 4d do VHC são responsáveis por 68,4% das infecções nos UDIs infectados com VIH analisados. Considerando que apenas 20-30% dos doentes positivos para VIH e co-infectados com os genótipos 1 e 4 respondem à terapia do VHC e que ocorre transmissão do VHC dos UDIs para a população em geral, são prioritários estudos alargados de vigilância epidemiológica e implementação de estratégias de prevenção para controlar ambos os vírus neste grupo de risco.

Níveis séricos de IgG anti-Trypanosoma cruzi na evolução da cardiopatia chagásica crônica, no período de 10 anos

Com o objetivo de investigar a relação entre os níveis de anticorpos (IgG) anti-T. cruzi e a evolução da cardiopatia chagásica crônica, no período de 10 anos, foi realizado um estudo envolvendo soros de 140 pacientes não submetidos ao tratamento específico de Virgem da Lapa, Minas Gerais. Entre os pacientes, 92 são mulheres e 48 homens, com idades ao exame inicial de 10 a 70 anos (média = 38 ±13,7 anos). Os níveis de anticorpos foram estimados pelas médias dos títulos registrados através dos testes de imunofluorescência indireta e hemaglutinação indireta, e pelo índice de reatividade (D.O. da amostra /cut-off) indicado nos testes ELISA convencional e recombinante CRA+FRA. No período, 49 pacientes se mantiveram sem cardiopatia, 29 desenvolveram cardiopatia, 33 mantiveram o grau inicial da cardiopatia, 25 evoluíram com agravamento da cardiopatia inicial e 4 normalizaram o eletrocardiograma. A análise dos resultados de todos os testes sorológicos mostrou aumento estatisticamente significativo dos níveis de IgG anti-T. cruzi no grupo de pacientes com evolução progressiva da cardiopatia principalmente na faixa etária de 20 a 59 anos, independentemente do sexo. Estes resultados indicaram uma associação direta entre os níveis séricos desses anticorpos e a evolução progressiva da cardiopatia chagásica crônica.

Clonagem e expressão da glicoproteína transmembrana do retrovírus HTLV-1 em células de mamíferos

O retrovírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 é o agente etiológico da leucemia das células T do adulto e da paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1. O genoma proviral é composto por 9.032 pares de bases, contendo genes estruturais e regulatórios. A glicoproteína transmembrana gp 21 é codificada pelo gene estrutural env. O desenvolvimento de metodologias para a expressão heteróloga de proteínas, assim como a obtenção de uma linhagem celular que expresse a gp 21 recombinante constitutivamente são os principais objetivos do trabalho. O fragmento codificante da gp 21 foi amplificado por Nested-PCR e clonado no vetor pCR2.1-TOPO. Posteriormente, foi realizada a subclonagem no vetor de expressão pcDNA3.1+. A transfecção da linhagem celular de mamíferos HEK 293 foi realizada de maneira transitória e permanente. A produção da gp 21 recombinante foi confirmada por citometria de fluxo e a linhagem celular produtora será utilizada em ensaios de imunogenicidade.

Contribuição para o diagnóstico de peste

Apesar de sua fundamentação clínico-epidemiológica, numerosos casos suspeitos de peste nos focos brasileiros têm sido descartados por serem negativos pelo teste de hemaglutinação para detecção de anticorpos contra o antígeno F1 da Yersinia pestis. A transcendência da peste justifica estudar se tais resultados decorrem da falta de resposta ao F1, e se outras proteínas da Yersinia pestis poderiam ser reconhecidas nos soros suspeitos, sendo desta forma candidatas como alvo diagnóstico alternativo ao F1. Assim sendo, cepas de Yersinia pestis e de Yersinia pseudotuberculosis, uma proteína YopH recombinante e a F1 foram utilizadas para analisar soros de pacientes e soros imunes de coelhos. A F1 e a YopH não foram reconhecidas pelos soros humanos HA- e nenhuma proteína majoritária, comum a todos os soros humanos e coelhos, foi identificada, o que permite concluir que os casos suspeitos devem ser submetidos a uma avaliação clínico-laboratorial mais rigorosa, aprofundando a investigação epidemiológica em busca de outras etiologias.

Morbidade da doença de Chagas em pacientes autóctones da microrregião do Rio Negro, Estado do Amazonas

INTRODUÇÃO: Foi realizado um estudo soroepidemiológico e clínico em 152 indivíduos residentes no município de Barcelos, Estado do Amazonas. Avaliou-se a soroprevalência da infecção chagásica e a morbidade da doença de Chagas. MÉTODOS: Os testes sorológicos foram a imunofluorescência indireta, ELISA convencional e recombinante e o Tesa-blot. Foram considerados soropositivos 38 pacientes, duvidosos 31 e soronegativos negativos 83. Os 38 casos soropositivos foram pareados com 38 controles soronegativos da mesma idade, sexo e submetidos à avaliação epidemiológica, clínica, eletro e ecocardiográfica, sendo que, 29 pares fizeram exame radiológico do esôfago. RESULTADOS: A soropositividade foi 19,9 vezes mais frequente nos trabalhadores do extrativismo em geral e 10,4 vezes mais frequente no extrativismo da piaçaba. Aplicou-se o teste de reconhecimento com o vetor local do gênero Rhodnius e 86,7% dos pacientes soropositivos o reconheceram, enquanto somente 34,2% dos soronegativos o fizeram. O ECG mostrou-se alterado em 36,8% nos soropositivos e em 21,5% nos soronegativos, enquanto o ecocardiograma mostrou alterações em 31,6% nos soropositivos e 18,4% nos soronegativos. Precordialgia e palpitações foram mais frequentes nos soropositivos. O estudo clínico do aparelho digestivo e radiológico do esôfago não mostrou alterações significativas. CONCLUSÕES. A doença de Chagas na região estudada pode ser considerada uma doença ocupacional.

Segurança do transplante autólogo, intra-arterial, de células mononucleares da medula óssea na fase aguda do acidente vascular cerebral isquêmico

O acidente vascular cerebral (AVC) é a terceira causa de óbito e a principal causa de incapacidade em indivíduos adultos. Embora a mortalidade do AVC esteja diminuindo em alguns países, a morbidade tem aumentado em razão do envelhecimento da população e do aumento da sobrevida dos pacientes¹. O tratamento com ativador do plasminogênio tissular recombinante (rt-PA) é eficaz quando instituído em até 3 horas após o início dos sintomas², porém seu uso está limitado a cerca de 5% dos pacientes na fase aguda do AVC isquêmico. Além disso, nenhum agente para neuroproteção teve sua eficácia comprovada em estudos clínicos em humanos. Portanto, outras estratégias terapêuticas precisam ser desenvolvidas. Em modelos animais, o uso de células-tronco correlacionou-se com melhora funcional após o AVC³. Publicações recentes têm demonstrado a segurança do tratamento com células mononucleares da medula óssea (CMMO) injetadas via intracoronária em pacientes portadores de cardiopatia isquêmica aguda ou crônica4,5. Baseado nesses dados iniciais, há crescente interesse no estudo do transplante com CMMO na fase aguda do AVC. Relatamos o primeiro caso de transplante autólogo de CMMO via intra-arterial na fase aguda do AVC isquêmico.

Uso de rTPA e aspirina no tratamento de trombose intracardíaca em recém-nascido

Descreve-se o caso de um recém-nascido prematuro de peso muito baixo, gemelar, com trombose intracardíaca. O recém-nascido apresentou quadro compatível com sepse neonatal, sendo submetido a suporte avançado de vida, terapia com antibióticos, nutrição parenteral, uso de hemoderivados e cateterismo venoso profundo. Evoluiu com suspeita de endocardite infecciosa, sendo realizada ecocardiografia bidimensional com Doppler, quando foi evidenciado volumoso trombo intracavitário. Pela alta letalidade e pela dificuldade técnica da cirurgia, que, em alguns casos, é contra-indicada, optou-se pelo uso do trombolítico ativador de plasminogênio tecidual recombinante humano (rTPA) associado a aspirina, obtendo-se dissolução total do trombo sem efeitos adversos.