Das RNA-bindende Protein Orb2 und seine regulatorische Funktion in der Spermatogenese von Drosophila melanogaster

Das Protein Orb2, welches zum Xenopus CPEB homolog ist, erfüllt während der Spermatogenese von Drosophila melanogaster eine wesentliche Funktion. Das teilweise Ausschalten von orb2 führt zu Störungen in der Individualisierung der Spermatiden, Veränderung in der Morphologie und Lokalisation der Spermatidenkerne und damit verbunden zu männlicher Sterilität. Der weit gestreute Phänotyp spricht für eine regulatorische Funktion des Proteins, wie es aufgrund der Homologie zu CPEB zu erwarten ist. Orb2 mutante Weibchen zeigen dagegen keinen Phänotyp. Die Sterilität konnte mit spezifischen Rettungskonstrukten rückgängig gemacht werden, wobei die beiden Proteinformen in ihrer Funktion höchstwahrscheinlich äquivalent sind, da eine größere Menge an kleinem Protein das Fehlen des größeren ausgleichen kann. Beide Proteinformen lokalisieren in fast alle Stadien der Spermatogenese, wobei nur das kleinere auch in reifen Spermien persistiert. Zur Untersuchung der regulatorischen Funktion des Proteins Orb2 wurden zunächst drei mögliche Protein-Interaktionskandidaten analysiert. Obwohl ähnliche mutante Phänotypen in Gap und Cup ausgelöst wurden, lässt sich eine Interaktion bis jetzt mit diesen Kandidaten weder ausschließen noch bestätigen. Daneben zeigte das Protein Tob eine ähnliche Lokalisierung und einen deutlich ähnlicheren mutanten Phänotyp, wie er für Orb2 beschrieben wurde. Besonders auffällig ist die Lokalisation der Tob mRNA an die Spermatidenenden und die Verringerung der Transkriptmenge in der orb2-Mutante. Ob dieser Phänotyp durch den Verlust der regulatorischen Funktion von Orb2 hervorgerufen wird oder durch den späten Zeitpunkt der Transkription bedingt ist, muß in späteren Experimenten geklärt werden. Mit Hilfe eines Co-Immunpräzipitations-Experimentes wurde nach weiteren Proteininteraktionspartnern sowie nach Ziel-mRNAs gesucht, die durch Orb2 reguliert werden könnten. Dabei ergaben die massenspektrometrischen Analysen zwar Proteine, die mit der Translation selbst in Zusammenhang stehen, sowie einige regulatorische RNA-bindende Proteine, wiesen aber auch in Gestalt eines häufig nachgewiesenen Anhangsdrüsenproteins auf deutliche systematische Probleme hin. Auf genetischem Wege war bereits der Nachweis gelungen, dass die Protamine und mst77F, die strukturelle Komponenten der kompaktierten Kern-DNA sind, durch Orb2 in ihrer Translation reprimiert werden. Dieses Ergebnis wurde zum Teil bestätigt durch den Nachweis der Protamin mRNAs in den Eluaten aus dem Co-Immunpräzipitationsexperiment. Damit konnte zum ersten Mal in der Drosophila Spermatogenese das regulatorische Protein zu einer translationskontrollierten mRNA identifiziert werden.

Biofilmbildung bei Pflanzen-assoziierten Bakterien der Gattung Methylobacterium und molekulargenetisch-physiologische Charakterisierung eines neuen Marchantia-Isolats (Mtb. sp. JT1)

Bakterien existieren bevorzugt in Biofilmen. Das Zusammenleben in diesen Gemeinschaften bietet den einzelnen Mikroben einen wirksamen Schutz und ermöglicht die Ausbildung langfristiger, synergistischer Wechselwirkungen, die mit multizellulären Systemen verglichen werden können. Biofilme bestehen aus Mikrooganismen-Populationen, die sich an Grenzflächen ansammeln und typischerweise von einer Matrix aus extrazellulären polymeren Substanzen umgeben sind. Auch auf Pflanzen-Oberflächen bilden viele Bakterien Biofilme, um ihre Überlebenswahrscheinlichkeit zu erhöhen. In dieser Arbeit wurde die Biofilmbildung bei Pflanzen-assoziierten Bakterien der Gattung Methylobacterium (Mtb.) untersucht, wobei molekular- und mikrobiologische sowie mikroskopische Techniken eingesetzt wurden. Es zeigte sich, dass alle untersuchten Vertreter der Gattung Methylobacterium in unterschiedlichem Ausmaß Biofilme bilden. Die Ausprägung ist dabei Taxon (bzw. Isolat)-spezifisch und vor allem von der Stickstoff-Verfügbarkeit abhängig. Jedoch spielen auch andere Umweltfaktoren, wie die Versorgung der Zellen mit Phosphat und die Zelldichte, bei der Ausbildung der überzellulären Einheiten eine wichtige Rolle. Die Matrix der Biofilme wird meist durch ein fibrilläres Netzwerk gebildet. Dabei handelt es sich um Heteropolysaccharide, die von den Bakterien synthetisiert und sezerniert werden. Einige Isolate bilden zusätzlich zahlreiche Fimbrien (Auswüchse), durch die sie an andere Zellen oder Oberflächen binden können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden mehrere neue Methylobacterium-Isolate physiologisch und molekulargenetisch charakterisiert (Nährstoffverwertung, DNA-Sequenzen verschiedener Gene, phylogenetische Analysen usw.). Im Vordergrund stand hierbei der von einer urtümlichen Landpflanze, dem Lebermoos (Marchantia polymorpha), isolierte Stamm Mtb. sp. JT1. Dabei zeigten sich deutliche Unterschiede in der Morphologie und Physiologie des Bakterienstamms JT1 und dem nahe verwandten Stamm 5b.2.20 zu den bereits beschriebenen Taxa der Gattung, so dass eine Spezies-Neubeschreibung erforderlich war. Als Artname wurde aufgrund der außergewöhnlichen Oberflächenstrukturen Mtb. fimbriae sp. nov. eingeführt. Auch andere Methylobakterien (unter anderem Isolat Mtb. sp. F3.2, isoliert vom Laubmoos Funaria hygrometrica) stellen wahrscheinlich Vertreter einer neue Spezies dar (Artname Mtb. funariae sp. nov.). Jedoch zeigen Mtb. fimbriae und Mtb. funariae nur geringe physiologische und morphologische Unterschiede und konnten auf Grundlage umfassender DNA-DNA-Hybridisierungs-Studien nicht eindeutig voneinander abgegrenzt werden.

Diagnostische Kompetenzen angehender Biologie-Lehrkräfte im Bereich der naturwissenschaftlichen Erkenntnisgewinnung

Das Beurteilen von Schülerleistungen, das Erfassen ihrer unterschiedlichen Lernvoraussetzungen und das Beobachten und Beurteilen von Schülerlernprozessen stellen wichtige Handlungsroutinen im Alltag von Lehrkräften dar. Dem gegenüber steht die Tatsache, dass sich noch bis vor einigen Jahren nur wenige Arbeiten und Projekte explizit mit der Diagnosekompetenz von angehenden und praktizierenden Lehrkräften beschäftigt haben. Die vorliegende Arbeit, die ein Teilprojekt innerhalb eines größeren interdisziplinären Projektes zur Diagnosekompetenz von Lehramtsstudierenden darstellt, möchte einen Beitrag leisten zur Debatte um die diagnostische Kompetenz. Ihr Hauptaugenmerk richtet sie dabei auf die diagnostische Kompetenz von Biologie-Lehramtsstudierenden im Bereich der naturwissenschaftlichen Erkenntnisgewinnung. Im Zuge der notwenigen theoretischen Konzeptionierung präsentiert die Arbeit einen im Gesamtprojekt erarbeiteten Vorschlag für eine Modellierung der (fachbezogenen) Diagnosekompetenz von Lehramtsstudierenden. Ergänzend dazu findet im Rahmen der Arbeit eine Klärung der in der Forschungsliteratur oftmals uneinheitlich benutzten Begrifflichkeiten zur diagnostischen Kompetenz statt. Weiterhin wird ein Vergleich von verschiedenen in der Literatur verwendeten Konzeptualisierungsansätzen vorgenommen. Da in der Forschungsliteratur keine geeigneten Instrumente zum Erfassen der hier im Speziellen betrachteten diagnostischen Kompetenz vorlagen, mussten diese im Rahmen der Arbeit neu entwickelt werden. Ein wesentlicher Ansatz dabei war eine Unterscheidung von status- und prozessdiagnostischen Kompetenzen und die Entwicklung entsprechend geeigneter Erhebungsinstrumente. Die neu entwickelten Testinstrumente wurden bei zwei Studierenden-Jahrgängen an verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf ihres Studiums eingesetzt. Im Test zur Messung ihrer statusdiagnostischen Kompetenzen hatten die Studierenden Schülerlösungen aus dem Bereich der naturwissenschaftlichen Erkenntnisgewinnung zu analysieren und zu beurteilen. Dabei zeigte sich als ein zentraler Befund, dass die Probanden das Leistungsniveau der Schülerlösungen umso schlechter korrekt beurteilen konnten, je höher es war. Weiterhin wurde deutlich, dass die diagnostische Kompetenz der Lehramtsstudierenden für die typischen Teilschritte im Rahmen der Erkenntnisgewinnung unterschiedlich hoch ausgeprägt ist. So fiel es ihnen am leichtesten, die Schülerlösungen zum Teilschritt „Datenanalyse“ zu beurteilen, wohingegen sie deutlich größere Schwierigkeiten hatten, das Leistungsniveau der Schülerlösungen zum Teilschritt „Planen einer Untersuchung“ korrekt einzuschätzen. Im Test zum Erfassen der prozessdiagnostischen Fähigkeiten der Studierenden wurde ihnen ein Experimentierprozess zweier Schüler vorgelegt. Auffällig in Bezug auf ihre diagnostische Kompetenz waren die massiven Schwierigkeiten beim Beurteilen des Schülerumgangs mit den Variablen. Im Vergleich der status- und prozessdiagnostischen Fähigkeiten erwies sich die Prozessdiagnostik als die für die Studierenden schwierigere Tätigkeit. Ein wesentliches Plus in Bezug auf das Gewinnen von Informationen über die diagnostische Kompetenz brachte der Einsatz von Videoanalysen zusätzlich zu den beschriebenen paper-pencil basierten Testinstrumenten. Über eine Analyse der Testbearbeitungsprozesse der Studierenden wurde untersucht, aus welchen Beweggründen und auf Basis welcher Annahmen diese zu ihren diagnostischen Urteilen gekommen waren. Mit Hilfe der auf diese Weise gewonnenen prozessbezogenen Informationen war es möglich, die spezifischen Schwierigkeiten der Studierenden beim Diagnostizieren genauer herauszuarbeiten. Neben den genannten Untersuchungen zu den Ausprägungen von diagnostischer Kompetenz im Bereich Erkenntnisgewinnung wurden im Rahmen der Arbeit auch ihre postulierten Bedingungsfaktoren untersucht: das fachmethodische Vorwissen der Studierenden und ihr Wissenschaftsverständnis. Nur für ersteres konnte ein wenngleich geringer, aber doch signifikanter Zusammenhang festgestellt werden. Ergänzend zum Blick auf die möglichen Bedingungsfaktoren wurden auch Zusammenhänge zwischen der diagnostischen Kompetenz und verschiedenen ausgewählten Personen- und Kontextvariablen untersucht (z.B. die von den Studierenden gewählte Lehramtsform, ihre Fächerkombination, ihr Geschlecht und ihre Abiturnote). Von allen untersuchten Variablen erwies sich die von den Studierenden gewählte Lehramtsform als derjenige Faktor, der den wenngleich ebenfalls nur schwachen, aber doch durchgängig vorhandensten Zusammenhang aufwies. Zusätzlich zu der (objektiven) Erfassung der diagnostischen Kompetenzen mit Hilfe der Messinstrumente präsentiert die Arbeit Ergebnisse zum Verlauf der subjektiven Selbsteinschätzungen der Studierenden hinsichtlich ihres diagnostischen Wissens. Es zeigte sich, dass die Studierenden das Studium für die Ausbildung ihrer diagnostischen Kompetenz als weniger hilfreich empfinden als für den Aufbau der anderen Bereiche ihres Professionswissens. Die Arbeit endet mit einem Fazit zu den Testinstrument-Entwicklungen und den in den verschiedenen Untersuchungen gewonnenen Befunden, verbunden mit einem Ausblick auf mögliche Implikationen für die Lehrerausbildung und sich anschließende Forschungsvorhaben.

Untersuchungen zur Dynamik des Lipid-Metabolismus von Dictyostelium discoideum

Die soziale Waldamöbe Dictystelium discoideum ist ein etablierter Modellorganismus zur Erforschung grundlegender zellbiologischer Prozesse. Innerhalb der letzten Jahre konnte dabei insbesondere das Wissen zum Lipidmetabolismus umfassend erweitert werden. In diesem Zusammenhang spielt besonders eine Enzymgruppe eine wichtige Rolle: die LC/VLC-Acyl-CoA-Synthetasen. Diese übernehmen dabei die Aufgabe Fettsäuren zu aktivieren, um sie so dem Zellmetabolismus überhaupt erst zugänglich zu machen. D. discoideum verfügt über insgesamt vier dieser Enzyme: FcsA, FcsB, FcsC und das Bubblegum-Enzym Acsbg1. Während die FcsA und FcsB bereits in vorangegangenen Arbeiten untersucht wurden, werden die FcsC und die Acsbg1 in dieser Arbeit erstmals biologisch charakterisiert. Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation der Proteine zeigen, dass die meisten LC/VLC-Acyl-CoA-Synthetase auf Endosomen und im Cytoplasma gefunden werden können (FcsA, FcsC und Acsbg1), während die FcsB als Transmembranprotein über das ER zu den Peroxisomen transportiert wird. Die Acsbg1 akkumuliert dabei zusätzlich an der Plasmamembran. Funktionell konnte gezeigt werden, dass neben der FcsA auch die Acsbg1 an der Bereitstellung von Acyl-CoA für Triacylglyceridsynthese beteiligt ist. Dabei besitzt die FcsA die Hauptenzymaktivität und kompensiert den Verlust der Acsbg1 in acsbg1- Zellen. In fcsA-/acsbg1- Zellen dagegen kommt der Verlust der Acsbg1 durch eine zusätzliche Verringerung des TAG-Gehaltes der Doppel-KOs im Vergleich zu fcsA- Zellen zum tragen. Alle vier Enzyme beeinflussen die Phagozytose. Dabei zeigen fcsA- und fcsC- Zellen eine gesteigerte Phagozytose in Gegenwart von der gesättigten Fettsäure Palmitinsäure im Kulturmedium. Auch der knockout der Acsbg1 wirkt sich positiv auf die Phagozytoserate aus, jedoch kommt auch nur dieser zum tragen, wenn neben der Acsbg1 auch die FcsA ausgeschaltet wird. Die FcsB dagegen zeigt eine dramatische Reduktion der Partikelaufnahme in nicht Fettsäure gefütterten Zellen. Durch die Zugabe einer exogenen Fettsäure kann dieser Effekt nicht kompensiert werden. Auch der zusätzliche Verlust der FcsA-Enzymaktivität verändert dieses Verhalten in Palmitinsäure inkubierten Zellen nicht. In fcsA-/fcsB- konnte zudem ein Defekt beim Abbau von Triacylglyceriden gefunden werden. Dieser Defekt liefert erste Hinweise für ein Modell, das den Abbau von LD gespeicherten Lipiden durch Autophagozytose in D. discoideum beschreibt. Peroxisomen sind wichtige Organellen für die Detoxifikation und die Oxidation von Fettsäuren. Durch das Ausschalten der Acaa1, der Thiolase, die den letzten Schritt der β-Oxidation in Peroxisomen katalysiert, zeigte sich ein verlangsamter Triacylglycerol-Abbau sowie eine verringerte Degradation des Etherlipids UKL und von Sterolestern, was auf eine Beteiligung der Peroxisomen beim Abbau von langkettigen Fettsäuren schließen lässt. Bei dem Versuch durch das Ausschalten des pex19-Gens eine Zelllinie zu generieren, die keine Peroxisomen besitzt, wurde die Organelle überraschender Weise, wenn auch mit einer vom Wildtyp abweichenden Morphologie, weiterhin vorgefunden. Dieser Befund korrelierte mit dem Resultat, dass trotzdem das pex19-Gen erfolgreich unterbrochen wurde, dennoch eine intakte Kopie des Gens nachgewiesen werden konnte. Dementsprechend sollte die erschaffene pex19- Zelllinie als knockdown und nicht als knockout gewertet werden. Der pex19 knockdown zeigte beim Abbau von Triacylglyceriden eine ähnliche Verlangsamung wie acaa1- Zellen. Zusätzlich wurde eine Verringerung der Synthese des Etherlipids UKL beobachtet, was darauf hindeutet, dass dieses Lipid im Peroxisom gebildet wird. Auch die Phagozytose und das Wachstum auf Bakterienrasen waren im pex19 knockdown dramatisch reduziert. Durch die Überexpression von Pex19-GFP im knockdown Hintergrund konnten die physiologischen Defekte in den meisten so generierten Zelllinien ausgeglichen werden. Lipid Droplets sind Organellen, die in Eukaryoten und Prokaryoten als Speicher für Neutralfette dienen und ebenfalls als Ort der Lipidsynthese fungieren. Um diese Aufgaben erfüllen zu können, besitzen sie auf ihrer Oberfläche Proteine, die für die Regulierung dieser Prozesse notwendig sind. Durch die weiterführende Analyse von Kandidatenproteinen, die durch eine proteomische Analyse von aufgereinigten LDs identifiziert wurden, konnte für vier weitere Proteine (Plsc1, Net4, Lip5 und Nsdhl) die LD-Assoziation durch GFP-Fusionsproteine bestätigt werden. Bei der Charakterisierung von plsc1 knockouts zeigte sich eine verminderte Fähigkeit beim Wachstum auf Bakterienrasen sowie eine erhöhte Phagozytoserate in Gegenwart einer exogenen Fettsäure, was auf eine Involvierung des Proteins in die Phospholipidsynthese hindeutet. Die bisher einzige identifizierte LD-assoziierte Lipase Lip5 nimmt nur eine untergeordnete Rolle bei der Hydrolyse von Triacylglycerolen und Sterolestern ein, da in KO-Mutanten nur ein milder Defekt beim Abbau beider Substanzen beobachtet werden konnte. Die LD-Lokalisation von Net4 ist evolutionär konserviert und kann nicht nur in D. discoideum beobachtet werden, sondern auch in humanen Zellen. Welche Funktion das Protein auf der LD-Oberfläche ausübt, konnte nicht geklärt werden. Allerdings kann ein direkter Einfluss auf den TAG- und Sterolaufbau ausgeschlossen werden. LDs stehen in engem Kontakt mit anderen Organellen, die in den Lipidmetabolismus involviert sind, wie mit den Mitochondrien oder dem ER. Durch Perilipin-Hybridproteine können künstliche, stabile Verbindungen zwischen LDs und diesen Organellen hergestellt werden. Dabei zeigte Perilipin ein sehr starkes Targeting-Potenzial, durch welches es notwendig war, als zweite Hybridhälfte ein Transmembranprotein zu wählen. Die Analyse eines Hybrids, das eine dauerhafte Verbindung von LDs und dem ER herstellt, wies dabeieine Reduktion der LD-Größe auf, wobei der Gesamt-TAG-Gehalt der Zellen unbeeinflusst blieb. Durch die starke Affinität von Perilipin für die Assoziation an LDs konnten durch die Generierung von Hybriden andere Proteine an die LD-Oberfläche dirigiert werden. Auf diese Weise konnte erfolgreich die LC-Acyl-CoA-Synthetase FcsA auf das LD transplantiert werden.

Aspects de la syntaxe, de la semantique et de la morphologie des verbes a trait de /complexite/

Cette dissertation porte sur l’analyse syntactico-sémantique des verbes à trait de complexité. Le trait de complexité (Blanche-Benveniste et al. 1984) réunit une classe de verbes connue comme verbes ‘symétriques’, ‘réciproques’ ou ‘collectifs’ sans toutefois se limiter à ces ensembles (cf. grouiller, collectionner, amonceler, scinder, etc.). Ce trait induit une lecture ‘plurielle’ à l’entité formée du lexème verbal et de ses arguments et qui se traduit, sur le plan morphosyntaxique, par deux propriétés: sélection obligatoire d’une position syntaxique (sujet ou objet) au pluriel; en absence de ce pluriel morphologique, le trait de complexité se réalise par la sélection d’un complément prépositionnel correlié à une position syntaxique (sujet ou objet) et l’interprétation de ‘pluriel’ des deux éléments correliés. L’hypothèse générale, et point de départ de cette dissertation, consiste à préciser l’interprétation de ‘pluralité inhérente’ des verbes à trait de complexité comme étant de type ‘collectif’, défini comme désignant du ‘plus d’un en un’ (Jespersen, 1971). La notion de ‘collectif’ est à distinguer de la notion de ‘pluriel’ (Gillon, 1992) et permet d’expliquer le lien entre les deux propriétés morphosyntaxiques présentées. Cette hypothèse générale s’appuie sur la sélection d’un ensemble d’outils d’analyse. Un premier outil vise à rendre compte, du point de vue formel, des réseaux syntactico-sémantiques, par une représentation abstraite de la syntaxe verbale, conçue comme une ‘syntaxe de position’ et où sont délimitées, autour du noyau verbal, deux zones syntaxiques (zone SUJET et zone OBJET) constituées de points d’ancrage du trait de complexité. En tenant compte de la spécificité du ‘collectif’ par rapport à la ‘pluralité’, le recours au concept d’opérateurs de complexité, entendus comme des opérateurs du trait [+discret] (Doetjes, 1999), permet de mieux définir la notion du ‘collectif’ appliquée au domaine verbal. Les différents opérateurs – affixes dérivationnels, constructions prépositionnelles, constructions en SE - se situent à différents niveaux de structuration. L’analyse par ‘opérateurs de complexité’ ([+discret]) présuppose également la prise en compte de la fonction quantitative. Dans cette perspective, ces opérateurs induisent différents degrés de l‘individuation’ des constituants du ‘collectif’ dénoté par la sémantique des verbes à trait de complexité. Les échelles de gradation de [+discret] rendent compte de cette propriété. Les valeurs de ‘plus d’un’ et ‘en un’ dénotées par les expressions verbales à trait de complexité sont interprétées comme faisant partie d’une structure conceptuelle de type ‘tout-intégré’ d’après l’approche lexicale et multidimensionnelle de la sémantique conceptuelle des relations parties/tout de Moltmann (1997).

Synthese, Charakterisierung und Anwendungsbeispiele neuartige poröser Kieselgel-Materialien im Nano- bis Mikrometerbereich mit sphärischer Morphologie

Abstract Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene neue Synthesewege zur Darstellung poröser Kieselgele untersucht. Als porenbildende Template wurden hierzu eine Reihe niedermolekularer und polymerer Verbindungen eingesetzt. Dabei sollten die Teilchenmorphologie und die Parameter der Porenstruktur durch die Bedingungen bei der Reaktion und nicht durch eine Nachbehandlung eingestellt werden. Hauptziel der Arbeit war es, eine Synthese zu entwickeln, bei der durch den Einsatz eines geeigneten Templats sphärische Kieselgelpartikel mit Porengrößen über 10 nm hergestellt werden können. Zusätzlich zur Materialsynthese gelang es Informationen über den Bildungsmechanismus poröser Kieselgele zu erhalten.Weiterhin wurden die Materialien als Säulenmaterial in der Chromatographie, als Adsorbens zur Probensammlung (sample tracking), als Katalysatorträgermaterial und als Marker für Biomoleküle eingesetzt.

Grenzflächenspannung und Morphologie fließender zweiphasiger Polymermischungen

In der vorliegenden Arbeit wurde die Morphologie von zweiphasigen Polymermischungen unter Scherung in situ mit Hilfe einer Kombination aus optischer Scherzelle, Durchlichtmikroskop und computergestützten CCD-Kamera untersucht. Als Modellblends dienten die unverträglichen, bei Raumtemperatur flüssigen Polymersysteme Polyisobutylen (PIB)/Polydimethylsiloxan (PDMS) (I) und Poly(dimethyl-co-methylphenyl)siloxan/PDMS (II). Alle Komponenten verhalten sich bei den verwendeten Scherraten newtonisch.Eine der wichtigsten Einflussgrößen für die Blendmorphologie ist die Grenzflächenspannung gamma 12. Sie wurde für I und II mit Hilfe der Methode der Tropfenrelaxation (dynamisch) als Funktion der Zeit bestimmt. Diese Methode erlaubt die Messung von gamma 12 für Tropfen der Phase A in B sowie von Tropfen B in A. Bei der Methode des hängenden Tropfens (statisch) muss der Tropfen aus der Phase mit der höheren Dichte bestehen. Wo der Vergleich der beiden Methoden möglich ist, stimmen die Ergebnisse für beide Systeme sehr gut überein. Bei II sind die aus der Tropfenrelaxation erhaltenen gamma 12-Werte der beiden komplementären Zusammensetzungen im Rahmen des Fehlers gleich, bei I zeigt ein PIB-Tropfen in PDMS einen um 40 % niedrigeren Wert als ein PDMS-Tropfen in PIB, dies wird auf die Diffusion von kurzkettigen Anteilen des PDMS in die Grenzschicht zurückgeführt. Die Grenzflächenspannung hängt also unter Umständen auch bei binären Systemen deutlich von der Zusammensetzung ab.Für II wurde die Blendmorphologie über den gesamten Zusammensetzungsbereich untersucht. Die häufig beobachteten cokontinuierlichen Strukturen treten bei keiner Zusammensetzung auf. Die Phaseninversion erkennt man in einer sprunghaften Änderung der Tropfengröße zwischen phiPDMS <= 0,400 und 0,500; zudem lässt sich die Zeitabhängigkeit der Radien durch Auftragung gegen das Produkt aus der Deformation und dem Quadrat des Volumenbruchs der Tropfenphase für 0 <= phiPDMS <= 0,400 sowie 0,500 <= phiPDMS <= 1 normieren. Für I und II wurde die Morphologieentwicklung bei 25 °C nach Vorscherung bei 100 bzw. 50 s-1 und anschließendem Sprung der Scherrate auf deutlich niedrigere Werte als Funktion der Zeit verfolgt. Hierbei erhält man bei genügend langer Messdauer (mindestens 200 000-300 000 Schereinheiten) konstante Tropfengrößen. Zum einen handelt es sich dabei um pseudo-stationäre Werte, die nur durch Koaleszenz bestimmt sind, zum anderen um echte stationäre Radien, die durch gleichzeitig ablaufende Koaleszenz und Zerteilung entstehen. Für I liegen die stationären Mittelwerte auf der Zerteilungskurve, für II hingegen auf der Koaleszenzkurve.Der Einfluss eines grenzflächenwirksamen Additivs wurde anhand von I durch Zugabe des Blockcopolymer PIB-b-PDMS zu PIB untersucht. Der Vergleich des zeitlichen Verlaufs von gamma 12 mit der Morphologieentwicklung zeigt, dass das Additiv eine Stabilisierung der feinen Tropfen/Matrix-Struktur des Blends durch Hinderung der Koaleszenz und nicht durch Reduktion der Grenzflächenspannung bewirkt.

Isolierung und Charakterisierung von Spirochaeten aus dem Termitendarm

Termiten beherbergen in ihrem Darm eine einzigartige Flora aus Bakterien, Archaeen, Flagellaten und Hefen. Diese symbiontische mikrobielle Gemeinschaft ist am Abbau von komplexen organischen Verbindungen beteiligt und ermöglicht es den Termiten schwer abbaubares Material wie Holz als Nahrungsquelle zu nutzen. Spirochaeten, eine Gruppe beweglicher Bakterien die sich durch ihre besondere Morphologie und Art der Fortbewegung von allen anderen Mikroorganismen abgrenzen lassen, gehören zu den häufigsten Bakterien im Termitendarm. Ziel der Arbeit war die Isolierung und Charakterisierung bislang unbekannter Spirochaeten aus Termitendärmen. Aus drei niederen Termitenarten konnten sechs spirochaetale Stämme gewonnen und identifiziert werden. Die Isolate ließen sich anhand der 16S rRNA Gensequenzen den Gattungen Treponema und Spirochaeta zuordnen. Im Gegensatz zu allen bislang charakterisierten Spirochaeten zeigte der Stamm SPN1 aus der Termite Neotermes castaneus eine kokkoide Zellform und war unbeweglich. Der Organismus wurde daher als neue Art, Spirochaeta coccoides sp. nov., beschrieben. Bei allen gewonnenen Isolaten handelt es sich um strikt anaerobe Organismen die verschiedene Mono-, Di- und Oligosaccharide fermentieren. Als wesentliche Stoffwechselprodukte konnten Acetat und Ethanol (sowie Formiat bei einem Stamm) identifiziert werden. Weiterhin konnten bei den untersuchten Stämmen eine Reihe von enzymatischen Aktivitäten nachgewiesen werden, die für den Abbau von Lignocellulose im Termitendarm von Bedeutung sind. Die Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Spirochaeten eine wichtige Rolle bei der Fermentation von Abbauprodukten der Lignocellulose im Termitendarm spielen.

Phonologie et morphologie du Soninke

L’objet de ce travail est la description des interactions phonologiques et morphologiques en soninké à l’exemple du dialecte parlé à Bakel (Sénégal). La description a donné lieu à des adaptations de la théorie substantive utilisée, celle de la rection. La définition des éléments a été revue et l’inventaire augmenté de telle manière à refléter le système du soninké. En plus d’un inventaire d’éléments soniques, un inventaire d’éléments tonals aégalement été proposé. L’étude morphologique repose sur une conception détaillée de la structure sémantique et des schèmes d’énonciation pertinents pour l’identification des classes syntaxiques de lexèmes. Les différents types de sémèmes et leur association avec les deux catégorèmes disponibles ont été le préalable à l’identification des morphèmes et à l’établissement de séquences licites sémantiques et morphémiques.

10 Å cryo-EM structure of Drosophila melanogaster hexamerin and Limulus polyphemus hemocyanin

In the present study, the quaternary structures of Drosophila melanogaster hexamerin LSP-2 and Limulus polyphemus hemocyanin, both proteins from the hemocyanin superfamily, were elucidated to a 10 Å resolution with the technique of cryo-EM 3D-reconstruction. Furthermore, molecular modelling and rigid-body fitting allowed a detailed insight into the cryo-EM structures at atomic level. The results are summarised as follows: Hexamerin 1. The cryo-EM structure of Drosophila melanogaster hexamerin LSP-2 is the first quaternary structure of a protein from the group of the insect storage proteins. 2. The hexamerin LSP-2 is a hexamer of six bean-shaped subunits that occupy the corners of a trigonal antiprism, yielding a D3 (32) point-group symmetry. 3. Molecular modelling and rigid-body fitting of the hexamerin LSP-2 sequence showed a significant correlation between amino acid inserts in the primary structure and additional masses of the cryo-EM structure that are not present in the published quaternary structures of chelicerate and crustacean hemocyanins. 4. The cryo-EM structure of Drosophila melanogaster hexamerin LSP-2 confirms that the arthropod hexameric structure is applicable to insect storage proteins. Hemocyanin 1. The cryo-EM structure of the 8×6mer Limulus polyphemus hemocyanin is the highest resolved quaternary structure of an oligo-hexameric arthropod hemocyanin so far. 2. The hemocyanin is build of 48 bean-shaped subunits which are arranged in eight hexamers, yielding an 8×6mer with a D2 (222) point-group symmetry. The 'basic building blocks' are four 2×6mers that form two 4×6mers in an anti-parallel manner, latter aggregate 'face-to-face' to the 8×6mer. 3. The morphology of the 8×6mer was gauged and described very precisely on the basis of the cryo-EM structure. 4. Based on earlier topology studies of the eight different subunit types of Limulus polyphemus hemocyanin, eleven types of interhexamer interfaces have been identified that in the native 8×6mer sum up to 46 inter-hexamer bridges - 24 within the four 2×6mers, 10 to establish the two 4×6mers, and 12 to assemble the two 4×6mers into an 8×6mer. 5. Molecular modelling and rigid-body fitting of Limulus polyphemus and orthologous Erypelma californicum sequences allowed to assign very few amino acids to each of these interfaces. These amino acids now serve as candidates for the chemical bonds between the eight hexamers. 6. Most of the inter-hexamer contacts are conspicuously histidine-rich and evince constellations of amino acids that could constitute the basis for the allosteric interactions between the hexamers. 7. The cryo-EM structure of Limulus polyphemus hemocyanin opens the door to a fundamental understanding of the function of this highly cooperative protein.

Die organotypische Gewebekultur der adulten Retina als Analysesystem für funktionell intakte Photorezeptorzellen

Photorezeptorzellen der Vertebraten sind hoch spezialisierte, visuell sensorische Neurone in der Retina, die die Lichtinformation in ein neuronales Signal umwandeln. Durch ihre Einbindung in die Retina im Gesamtorgan Auge, sind Photorezeptorzellen im Organismus für zellbiologische Analysen, wie beispielsweise unter Einsatz pharmakologischer Substanzen, nur schwer zugänglich. Demgegenüber ist bei der Nutzung von Zellkulturtechniken eine Beeinflussung oder externe Manipulation von Zellen mit geringem Aufwand möglich. Bei Etablierungsversuchen von Primärkulturen von Photorezeptorzellen zeigte sich jedoch, dass diese rasch ihre spezifische Kompartimentierung und das damit verbundene (lichtsensitive) Funktionsvermögen verlieren. Eine Alternative zur Einzelzellkultur bietet die Kultivierung der Retina als organotypisches Gewebe, in der, durch den überlebenswichtigen Kontakt der retinalen Zellen zu einander, deren Morphologie und Funktionsvermögen erhalten bleibt. In der vorliegenden Arbeit konnte durch Optimierung der Kultivierungstechnik erstmals die adulte Retina für mehrere Tage intakt kultiviert und deren Vitalität und physiologische Aktivität nachgewiesen werden. Nach dem Nachweis der Eignung der organotypischen Retinakultur, stand diese nun für zellbiologische Analysen von Photorezeptorzellen zur Verfügung. Die Langzeitadaptation von Photorezeptorzellen geht einher mit der Translokation der Proteine Arrestin und Transducin. Doch sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen dieser lichtabhängigen molekularen Bewegungen bislang noch nicht verstanden. Im Kontext der Diskussion um Diffusion oder aktivem Transport der genannten Translokationen, wurden in der vorliegenden Arbeit Experimente zur Abhängigkeit vom Cytoskelett durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die gegensätzlichen Translokationen von Arrestin und Transducin während der Dunkeladaptation vom Aktin-, als auch Mikrotubulicytoskelett abhängig sind. Demgegenüber sind es die während der Helladaptation stattfindenden Translokationen nicht. Diese Befunde verweisen damit auf unterschiedliche Mechanismen für die untersuchten molekularen Bewegungen während der Dunkel- und Helladaptation, und das im Falle des Arrestins auch verschieden Mechanismen zusammen oder in einer Abfolge für die Bewegung durch verschiedene Zellkompartimente notwendig sind. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit die Eignung der Retinakulturtechnik für Gentransfers in retinale Zellen mittels verschiedener Methoden gezeigt werden. Die organotypische Gewebekultur der adulten Retina erweist sich als ein Analysesystem mit dem zellbiologische Untersuchungen an ausdifferenzierten Photorezeptorzellen durchgeführt werden können, die im lebenden Tier, bzw. der Zellkultur nicht möglich sind. Erfolgreiche Pharmakologische Beeinflussung, sowie Gentransfer in Zellen der Retinakultur prädestinieren die Retinakultur für zellbiologische und Proteinfunktionsanalysen. Dabei kann sie ferner als Modellsystem zur Evaluation von Therapiestrategien zu Retinadystrophien dienen und das ohne, oder zumindest in einer Reduktion von Tierversuchen.

Ornithophily in the genus Salvia L. (Lamiaceae)

This dissertation presents for the first time a survey of bird pollinated (ornithophilous) Salvia species. Within the approximately 1000 species of the worldwide distributed genus roughly 20% (186 spp.) are bird pollinated. Excepting four species in the Old World (South Africa and Madagascar), ornithophilous species are restricted to the New World where they represent about one third of the species. They occur mainly in higher altitudes (1500-3000m) and usually grow as shrubs or perennial herbs (97%). The bilabiate to tubular flowers are often red (at least 49%), averaging 35mm (7-130mm) in length and produce a large to medium volume of nectar with rather low sugar concentration. Pollination by sunbirds and white-eyes is documented in a South African species, and that by hummingbirds in 16 species of the New World (USA, Mexico, Guatemala and Bolivia). Beside pollinator observations, the functionality of the staminal levers, the process of pollen transfer and the fitting between flowers and birds are tested by inserting museum skins and metal rods into fresh flowers. The most surprising result is the finding of two different main pollen transfer mechanisms. In at least 54% of the species an active staminal lever mechanism enables pollen deposition on the birds body. This is illustrated in detail in the South African S. lanceolata at which birds were observed to release the lever mechanism and became dusted with pollen. In contrast, the lever mechanism in about 35% of the New World species is reduced in different ways. Pollen transfer by inactive ‘levers’ is demonstrated in detail in S. haenkei in Bolivia, at which four pollinating hummingbird species could be observed. The tubular corolla forced the birds in a specific position, thereby causing pollen transfer from the exserted pollen-sacs to the birds body. With respect to the floral diversity and systematic affiliation of the species, parallel evolution of ornithophily and lever reduction is likely. Considering that bird pollinated species might have derived from bee pollinated species and that the staminal levers have become secondarily inactive, it is concluded that the shift in pollinators induced phenotypic changes even disabling such a sophisticated structure as the staminal lever mechanism.

Molecular characterization of the immune modulatory function of matrix metalloproteinase-7, a factor in the tumour micromilieu

Matrix metalloproteinases are the components of the tumour microenvironment which play a crucial role in tumour progression. Matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) is expressed in a variety of tumours and the expression is associated with an aggressive malignant phenotype and poor prognosis. A role for MMP-7 in the immune escape of tumours has been postulated, but the mechanisms are not clearly understood. The present study was focused on identifying physiological inactivators of MMP-7 and also to unravel the mechanisms involved in MMP-7 mediated immune escape. This study shows that human leukocyte elastase (HLE), secreted by polymorphonuclear leukocytes cleaves MMP-7 in the catalytic domain as revealed by N-terminal sequencing. Further analysis demonstrates that the activity of MMP-7 was drastically decreased after HLE treatment in a time and dose dependent manner. MMP-7 induces apoptosis resistance in tumour cells by cleaving CD95 and CD95L. The effect of HLE on MMP-7 mediated apoptosis resistance was analysed. In vitro stimulation of apoptosis by anti-Apo-1 (anti-CD95 antibody) and the chemotherapeutic drug doxorubicin is reduced by MMP-7. Also tumour specific cytotoxic T cells do not effectively kill tumour cells in the presence of MMP-7. This study revealed that HLE abrogates the negative effect of MMP-7 on apoptosis induced by CD95 stimulation, doxorubicin or cytotoxic T cells and restores apoptosis sensitivity of tumour cells. To gain insight into the possible immune modulatory functions of MMP-7, experiments were performed to identify new immune relevant substrates. The human T cell line, Jurkat, was selected for these studies. Hsc70 which is involved in uncoating of clathrin vesicles was found in the supernatants of the MMP-7 treated cells indicating a modulatory role of MMP-7 on endocytosis. Further studies demonstrated that MMP-7 leads to decreased clathrin staining in HEK293, HepG2, Jurkat, CD4+ T cells and dendritic cells. Results also show MMP-7 treatment increased surface expression of cytotoxic T lymphocyte associated protein-4 (CTLA-4) which accumulated due to inhibition of the clathrin mediated internalization in CD4+CD25+ cells.

Konditionale Mutagenese von Desmoglein 2 in der Maus

Desmosomen sind hoch organisierte interzelluläre Verbindungen, die Zellverbänden eine mechanische Stabilität verleihen. Die Intermediärfilamentnetzwerke benachbarter Zellen werden mit Hilfe der desmosomalen Cadherine vom Desmoglein- und Desmocollin-Typ miteinander verknüpft. Diese Glykoproteine interagieren miteinander im Interzellularspalt zwischen benachbarten Zellen und stellen mit ihren zytoplasmatischen Domänen einen Ankerpunkt für desmosomale Brückenproteine dar, an welche wiederum die Proteine des Intermediärfilament-Zytoskeletts binden. Bei der Maus spielt das desmosomale Cadherin Desmoglein 2 (DSG2) bereits in frühen Stadien der Embryogenese eine entscheidende Rolle. Homozygote DSG2-Knockout-Mäuse sterben bereits vor der Implantation des Embryos ab. Im adulten Tier ist Dsg2 die am weitesten verbreitete Isoform, in Darm, Leber und Herzmuskel wird es zudem exklusiv exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung von Dsg2 in differenzierten Gewebeverbänden adulter Tiere zu untersuchen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden mehrere transgene Mauslinien hergestellt, in denen mit Hilfe des Cre/loxP-Systems eine Deletion im DSG2-Gen konditional und gewebsspezifisch induziert werden konnte. Dazu wurden zuerst zwei loxP-Sequenzen und eine mit zwei FRT-Stellen flankierte Neomyzinresistenzgen-Kassette in das DSG2-Gen von embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination eines Targeting-Konstrukts inseriert. Diese Zellen wurden in Blastozysten injiziert und Mauslinien hergestellt. Mit Hilfe der Flpe-Rekombinase wurde anschließend die Resistenzenzgen-Kassette entfernt. Diese Stämme wurden mit Mäusen verpaart, die eine induzierbare und gewebsspezifische Synthese der Cre-Rekombinase ermöglichen. Im Darmepithel und der Leber konnte eine gewebsspezifische Rekombination des DSG2-Gens induziert werden. Untersuchungen der DSG2-mRNA zeigten, dass die DSG2-Rekombination in der Darmschleimhaut nahezu vollständig erfolgte. Immunfluoreszenz-Analysen an Gewebsfragmenten induzierter Tiere mit Isotyp-spezifischen Antikörpern, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellt worden waren, zeigten jedoch keine signifikanten Unterschiede der Desmosomenzahl und -verteilung. Daher wurden eGFP-Hybride des zu erwartenden mutierten Dsg2-Proteins in Zellen exprimiert und mit wildtypischem Dsg2 verglichen. Es konnte hinsichtlich der Verteilung und Morphologie der Desmosomen keine Unterschiede zwischen beiden Dsg2-Proteinen festgestellt werden. Der Dsg2-Mutante fehlen wichtige Proteinbereiche, die für die trans-Interaktion der extrazellulären Domäne verantwortlich sind, die Haupt-N-Glykosylierungsstelle, sowie eine der insgesamt vier Kalzium-Bindestellen. Dies sind Eigenschaften, von denen man bisher annahm, dass sie eine zentrale Bedeutung für die desmosomale Adhäsion besitzen. Weitere Experimente werden zeigen, inwieweit die hergestellte Dsg2-Mutante in „Stresssituationen“, wie sie z.B. bei Regenerationsvorgängen oder der Tumorgenese auftreten, zu veränderten adhäsiven Eigenschaften führt.

Systematics, phylogeny and biogeography of Cousinia (Asteraceae)

Die Systematik, Phylogenie und Biogeographie der Gattung Cousinia (Asteraceae, Cardueae) als größter Gattung der Tribus Cardueae mit mehr als 600 Arten wurde untersucht. Diese Dissertation umfasst drei Hauptteile: Im ersten Teil wurde die Phylogenie und Evolution des Arctium-Cousinia-Komplexes Untersucht. Dieser Gattungskomplex enthält Arctium, Cousinia, Hypacanthium und Schmalhausenia und zeigt die höchste Diversität in der Irano-Turanischen Region und in den Gebirgen Zentralasiens. Es wurden ITS und rpS4-trnT-trnL-Sequenzen für insgesamt 138 Arten generiert, darunter von 129 (von ca. 600) Arten von Cousinia. Wie in früheren Analysen bereits gefunden, ist Cousinia nicht monophyletisch. Stattdessen sind Cousinia subg. Cynaroides und subg. Hypacanthodes mit insgesamt ca. 30 Arten enger mit Arctium, Hypacanthium und Schmalhausenia (Arctioid Clade) als mit subg. Cousinia (Cousinioid Clade) verwandt. Die Arctioid und Cousiniod clades werden auch durch Pollenmorphologie und Chromosomenzahl unterstützt, wie bereits früher bekannt war. In dem Arctioid Clade entsprechen morphologische Gattungsgrenzen, basierend auf Blattform, Blattbedornung und Morphologie der Involukralblätter, nicht den in der molekularen analyse gefundenen clades. Es kann keine taxonomische Lösung für diesen Konflikt gefunden werden, und die gennanten Merkmale wurden als homoplastisch betrachtet. Obwohl die phylogenetische Auflösung in dem Cousinioid Clade schlecht ist, enthalten die ITS und rpS4-trnT-trnL-Sequenzen phylogenetische Information. So gruppierten z.B. die sechs annuellen Arten in zwei Gruppen. Schlechte phylogenetische Auflösung resultiert wahrscheinlich aus dem Mangel an Merkmalen und der großen Artenzahl in dieser artenreichen und vergleichsweise jungen (ca. 8,7 mya) Linie. Artbildung in dem Cousinioid Clade scheint hauptsächlich allopatrisch zu sein. Der zweite Teil der Dissertation untersucht die Rolle der Hybridisierung in der Evolution von Cousinia s.s. Die in der Vergangenheit publizierteten 28 Hybrid-Kombinationen und 11 Zwischenformen wurden kritisch geprüft, und zwei Hybridindividuen wurden morphologisch und molekular untersucht. Die vermutlichen oder nachgewiesenen Eltern der Hybriden und Zwischenformen wurden auf die aus einer Bayesischen Analyse der ITS-Sequenzen von 216 Arten von Cousinia und verwandten Gattungen resultierenden Phylogenie aufgetragen. Weder Hybriden zwischen dem Cousinioid Clade und anderen Haupt-Claden des Arctium-Cousinia-Komplexes noch zwischen annuellen und perennirenden Arten von Cousinia s.s. wurden beobachtet. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass Hybridisierung in Cousinia möglich is, und dass ca. 10,7% der Arten an interspezifischer Hybridisierung beteiligt sind. Obwohl Hybridisierung in Cousinia s.s. stattfindet und zu den Schwierigkeiten bei der Rekonstruktion ihrer phylogenetischen Geschichte beitragen könnte, war ihre Rolle für die Entwicklung und Diversität der Gruppe offenbar gering. Im dritten Teil wird eine taxonomische Revision der C. sect. Cynaroideae präsentiert. Cousinia sect. Cynaroideae, die größte Sektion der Gattung mit 110 veröffentlichten Arten, zeichnet sich durch eine Chromosomenzahl von 2n = 24 und durch ± herablaufende Blätter und Hüllblätter mit Anhängseln aus. Sie kommt im Iran, Irak, dem Kaukasus, der Türkei, Turkmenistan, Afghanistan, Pakistan, dem Libanon und Anti-Libanon vor und hat ihre Hauptzentren der Artdiversität im westlichen und nordwestlichen Iran, im Irak und in der südöstlichen Türkei. Die Revision dieser Gruppe, hauptsächlich basierend auf der Untersuchung von ca. 2250 Herbarbögen, führte zu einer Verringerung der Artenzahl auf 31 Arten mit acht Unterarten. Alle Arten werden typifiziert und ausgeschlüsselt, und Beschreibungen, Abbildungen und Verbreitungskarten werden für jede Art angegeben.