Prokaryotic growth and presence of metabolic products and contamination tracers in rocks samples from ODP Leg 187 sites

The microbial population in samples of basalt drilled from the north of the Australian Antarctic Discordance (AAD) during Ocean Drilling Program Leg 187 were studied using deoxyribonucleic acid (DNA)-based methods and culturing techniques. The results showed the presence of a microbial population characteristic for the basalt environment. DNA sequence analysis revealed that microbes grouping within the Actinobacteria, green nonsulfur bacteria, the Cytophaga/Flavobacterium/Bacteroides (CFB) group, the Bacillus/Clostridium group, and the beta and gamma subclasses of the Proteobacteria were present in the basalt samples collected. The most dominant phylogenetic group, both in terms of the number of sequences retrieved and the intensities of the DNA bands obtained with the denaturing gradient gel electrophoresis analysis, was the gamma Proteobacteria. Enrichment cultures showed phylogenetic affiliation with the Actinobacteria, the CFB group, the Bacillus/Clostridium group, and the alpha, beta, gamma, and epsilon subclasses of the Proteobacteria. Comparison of native and enriched samples showed that few of the microbes found in native basalt samples grew in the enrichment cultures. Only seven clusters, two clusters within each of the CFB and Bacillus/Clostridium groups and five clusters within the gamma Proteobacteria, contained sequences from both native and enriched basalt samples with significant similarity. Results from cultivation experiments showed the presence of the physiological groups of iron reducers and methane producers. The presence of the iron/manganese-reducing bacterium Shewanella was confirmed with DNA analysis. The results indicate that iron reducers and lithotrophic methanogenic Archaea are indigenous to the ocean crust basalt and that the methanogenic Archaea may be important primary producers in this basaltic environment.

Estratégias para conservação de carne armazenada sob refrigeração: embalagem em atmosfera modificada e processamento em alta pressão

A busca por produtos mais saudáveis e minimamente processados tem levado indústrias e pesquisadores a estudarem novas formas de preservação de alimentos. Os objetivos deste trabalho foram: 1) avaliar o efeito da embalagem com atmosfera modificada (ATM) na preservação de lombo ovino armazenado sob refrigeração e 2) Avaliar o efeito do processamento em alta pressão na conservação de carne bovina marinada e com teor de sódio reduzido. Em ambas as pesquisas, músculos Longissimus lumborum foram submetidos à contagem microbiana, avaliação de cor, pH, oxidação lipídica (TBARS), perdas por cocção (PPC) e força de cisalhamento. Para o estudo do efeito da embalagem em atmosfera modificada, as amostras foram acondicionadas em cinco sistemas de ATM, 15% O2 + 85% CO2; 30% de O2 + 70% de CO2; 45% de O2 + 55% de CO2; 60% de O2 + 40% de CO2 e Vácuo (controle) e armazenadas a 1°C durante 21 dias. As análises de cor, pH, TBARS, PPC e força de cisalhamento foram realizadas a cada sete dias e as microbiológicas duas vezes por semana. Diferentes concentrações de oxigênio dentro da embalagem trouxeram diferença significativa na intensidade de cor vermelha das carnes armazenadas em ATM. Até o sétimo dia de estocagem tratamentos com maior quantidade de O2 apresentaram melhor coloração, após esse período embalagens a vácuo conseguiram preservar melhor a mioglobina. Diferentes concentrações gasosas não trouxeram causaram diferença (p> 0,05) no pH da carne entre tratamentos. Nenhuma diferença significativa entre tratamentos foi encontrada para amostras embaladas em ATM nos parâmetros perda de peso por cocção e força de cisalhamento. A embalagem em atmosfera modificada foi capaz de retardar o crescimento da microbiota presente na carne. Isso levou á preservação da amostra por até 18 dias sob refrigeração, enquanto amostras a vácuo tiveram uma vida útil de 11 dias. Para o estudo do efeito da alta pressão em carne marinada com baixo teor de sódio, as carnes foram inoculadas com 106 UFC/g de carne com E. faecium e Listeria innocua e em seguida marinadas durante 18 horas, a 4°C, em diferentes soluções: 1% NaCl + 1% ácido cítrico, 1% NaCl + 2% ácido cítrico, 2% NaCl + 2% ácido cítrico e 2% NaCl + 2% ácido cítrico. Após a marinação as amostras foram submetidas ao tratamento nas seguintes pressões: Zero (controle), 300MPa, 450Mpa, 600MPa. As análises físico-químicas e microbiológicas foram realizadas logo após o tratamento. O tratamento em alta pressão foi capaz de reduzir a população microbiana em até seis ciclos logarítmicos quando 600Mpa foram aplicados em todas as soluções estudadas. A não aplicação de alta pressão proporcionou a redução de apenas um ciclo log na população de E. faecium quando as carnes foram marinadas com 2% NaCl + 2% ácido cítrico. A alta pressão e as diferentes concentrações de sal e ácido, não trouxeram diferença significativa na coloração das amostras. Já o maior teor de ácido cítrico na marinada causou maior (p<0,05) redução do pH da carne em comparação com as amostras em baixa concentração de ácido. Os experimentos demonstraram que a tanto embalagem a vácuo quanto a aplicação de ácido cítrico foram eficientes em retardar a oxidação lipídica. Pressões de 600Mpa tornaram a carne significativamente mais dura que as demais pressões aplicadas. Os resultados demonstraram a possibilidade de extensão da vida útil da carne refrigerada através da aplicação de diferentes tecnologias: a embalagem com atmosfera modificada para carne fresca e processamento em alta pressão de carnes marinadas com reduzido teor de sal.

Utilização de metanol, etanol e metano como doadores de elétrons para a desnitrificação

Esta tese apresenta e discute os dados obtidos a partir de trabalho experimental projetado para avaliar comparativamente o desempenho de reatores desnitrificantes em batelada, tendo etanol, metanol e gás metano como doadores de elétrons. Os experimentos foram realizados em reatores em escala de bancada. Os ensaios com gás metano objetivaram verificar a efetividade deste sub-produto de reatores anaeróbios em substituir os doadores exógenos de elétrons comumente utilizados, tais como metanol e etanol. Para alcançar o objetivo principal deste trabalho, os parâmetros cinéticos de desnitrificação, para os doadores de elétrons ensaiados, foram determinados nas diferentes condições operacionais. Além disso, as alterações ocorridas na população microbiana, ao longo do período experimental, foram avaliadas em relação à diversidade microbiana, por meio de análises microscópicas (óptica, de fluorescência e eletrônica de varredura) e da técnica de Biologia Molecular de PCR/DGGE. A completa desnitrificação foi alcançada para todos os compostos testados, e o etanol foi o doador de elétrons mais eficiente para a desnitrificação. A melhor razão carbono-nitrogênio para a desnitrificação foi igual a 1,0. Contudo, este parâmetro foi encontrado ser inadequado para utilização no processo de desnitrificação, uma vez que não expressa a capacidade real do composto usado em doar elétrons. A desnitrificação com metano ocorreu tanto na presença como na ausência de oxigênio, embora a baixas velocidades quando comparado com os outros compostos. No entanto, a configuração do reator utilizado neste estudo não foi adequada para promover a efetiva dissolução do gás metano na fase líquida. Por essa razão, sugere-se o desenvolvimento de configurações de reatores apropriadas para minimizar as resistências à transferência de massa da fase gasosa para a líquida e também desta para a biomassa.

Nitrato na dieta de ruminantes como estratégia nutricional para mitigação de metano entérico

A produção de metano entérico está entre as principais fontes de emissão de gases de efeito estufa dentre as atividades agropecuárias, além de gerar perda energética ao animal de até 12% da energia bruta consumida. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o uso de nitrato de cálcio encapsulado na alimentação de ruminantes como estratégia nutricional a mitigação de metano entérico. O experimento consistiu de duas fases. Fase I: Foram testadas dietas suplementadas com produto comercial de nitrato de cálcio encapsulado utilizando a técnica semiautomática de produção de gases in vitro. Meio grama de substrato com 50 mL de meio de incubação e 25 mL de inóculo ruminal foram incubados em frascos de vidro (160 mL) à 39 ºC por 24 horas para determinação da melhor dieta a ser testada in vivo. O primeiro ensaio testou a associação entre a monensina (dietas com e sem adição de monensina) e doses de nitrato encapsulado (0; 1,5 e 3% da matéria seca (MS)) para mitigação de metano in vitro. Não foi observada interação entre monensina e nitrato para as variáveis testadas. O segundo ensaio in vitro testou a interação do tipo de dieta com duas relações concentrado:volumoso, 20:80 e 80:20, e a inclusão de doses de nitrato encapsulado (0; 1,5; 3 e 4,5% MS). Embora não foi observado efeito associativo entre dieta e nitrato para redução de metano, foi observada mudança nos produtos da fermentação ruminal, com redução de propionato, em decorrência da concorrência de nitrato e propianogênicas por hidrogênio mais escasso em dietas com menor fermentação. Fase II: Conforme os resultados obtidos na Fase I, na segunda fase foi avaliado o efeito associativo da relação de concentrado:volumoso da dieta e a dose de nitrato sobre a emissão de metano, constituintes ruminais e toxicidade do nitrato in vivo. Utilizou-se seis borregos canulados no rúmen, distribuídos em delineamento experimental quadrado latino 6 x 6, em fatorial 2 x 3. Os fatores foram tipo de dieta (relação concentrado:volumoso 20:80 e 80:20) e inclusão de doses de nitrato encapsulado na dieta (0; 1,5 e 3% MS) em substituição gradual ao farelo de soja, totalizando seis tratamentos. Os teores de substituição do farelo de soja pelo nitrato foram em equivalente proteico de maneira a deixar as dietas isonitrogenadas. Os animais foram adaptados gradualmente a oferta de nitrato dietético para evitar problemas com toxidez. A análise de toxicidade foi avaliada pela taxa de metahemoglobina no sangue dos ovinos 3 horas após a alimentação. Nitrato reduziu a produção de metano em ambas as dietas. Os níveis de metahemoglobina no sangue dos animais não foram alterados pela adição de nitrato. Foi observado efeito associativo entre o tipo de dieta e nitrato para os produtos da fermentação ruminal, como acetato, que aumentou linearmente nas dietas com 80% de concentrado quando nitrato foi adicionado. Concluí-se que nitrato, utilizado de forma segura, é uma promissora estratégia para redução de metano entérico independentemente do tipo de dieta com que está sendo suplementado

Degradação anaeróbia de fenol sob diferentes condições nutricionais

A tecnologia anaeróbia tem sido utilizada com sucesso no tratamento de água residuária contendo compostos fenólicos. Recentes pesquisas incluem tais compostos entre aqueles que podem ser degradados através desse processo. O objetivo desse trabalho foi avaliar a degradação do fenol em diferentes condições nutricionais, com ênfase na redução do sulfato. Os experimentos foram realizados com meio de cultura específico para esses microrganismos anaeróbios. Foram realizados ensaios de degradação em reatores em batelada alimentados nas seguintes condições: (1) fenol e sulfato, a diferentes concentrações, com inóculo previamente enriquecido; (2) fenol, sulfato e co-substratos e; (3) fenol, sulfato e extrato de levedura. Todos os ensaios foram realizados em temperatura de 30 graus Celsius, sob agitação de 150 rpm. Foi avaliado o consumo de fenol e sulfato e, produção de metano, em função do tempo, para diferentes concentrações iniciais de fenol e sulfato. Nos ensaios com reatores alimentados com fenol (329,3 mg/l); fenol (307,3 mg/l) e sulfato (160 mg/l); fenol (322.3 mg/l), sulfato (160 mg/l) e lactato (478,16 mg/l); fenol (332,1 mg/l), sulfato (150 mg/l) e etanol (129,76 mg/l), a remoção foi de, respectivamente, 99,8%, 98,2%, 98,8% e 98,8%. Os reatores alimentados com fenol (239,7 mg/l) obtiveram 100% de eficiência na degradação em apenas 11 dias e, os reatores alimentados com fenol (234,3 mg/l) e sulfato (162,5 mg/l) e fenol (256,0 mg/l) e sulfato (500 mg/l) tiveram eficiências de degradação de, respectivamente, 98,8% e 99,3% com 17 dias de operação. Tais eficiências foram obtidas pelo acréscimo de extrato de levedura nos reatores, no início dos ensaios. A caracterização morfológica foi realizada através de microscopia óptica. A diversidade microbiana referente aos Domínios Bacteria e Archaea, além do grupo de bactérias redutoras de sulfato foi avaliada através da técnica de PCR DGGE, onde foram observadas alterações nas populações microbianas, em função das condições nutricionais. Para o Domínio Archaea não foram observadas diferenças nos ensaios realizados. Para o Domínio Bacteria e Grupo das BRS essas diferenças foram, mais facilmente, percebidas com relação ao inóculo e entre os diversos reatores. A alteração na diversidade microbiana pode ter sido decorrente da composição do meio que, nesse caso, foi específico para BRS e a composição do inóculo que continha parte previamente adaptada às BRS. Essas condições adequadas puderam propiciar surgimento e desenvolvimento de populações microbianas capazes de degradar fenol, utilizando sulfato.

Tratamiento de lixiviados de residuos de origen urbano mediante MBR

Se ha utilizado una planta de tratamiento a escala laboratorio consiste en un biorreactor de membrana (MBR). Esta planta está compuesta por un reactor biológico de 25 L de capacidad. Se utilizó una membrana plana de micro filtración marca Kubota de polietileno clorado, tamaño de poro 0,1 μm y área de filtración 0.116 m2. Se utilizaron como condiciones de operación: tiempo de residencia hidráulico 3 días, caudal de permeado 0.35 L/h y LMH 3 L/m2h. Se ha podido comprobar que es posible adaptar una población microbiológica a las particulares características químicas del lixiviado procedente de la planta y tratar estos lixiviados en un reactor biológico de membrana sumergida operando en condiciones habituales de sólidos en suspensión en el reactor entre 8-12 g/L durante un periodo de 6 meses. El proceso utilizado permite reducir la materia orgánica (97% DBO5 y 40% DQO) presente en estas corrientes residuales, agotando prácticamente toda la materia biodegradable. Respecto a los contenidos de nutrientes, el tratamiento MBR ensayado permite reducir de 35-40% el nitrógeno total, 45-50% el nitrógeno amoniacal y un 65-70% el fósforo total. Los sólidos en suspensión se han reducido en el efluente tratado en más de un 99%.

Risk assessment for public health from human interaction with ornamental waters

Water is essential to life; nevertheless ingestion of contaminated water could result in death caused by waterborne diseases such as cholera. Pathogens present in the water can cause diseases, other than those resulting from water ingestion, being registered an increase in the number of case reports in recent years. It is not clear if this increase is due either to a better case reporting system or to an increase in microorganism’s virulence. The generalized use of antibiotics in agriculture and animal farming contributed to their dissemination in the environment which promotes microorganism selection and emergence of resistant strains. This phenomenon can be enhanced by the ability of microorganism to persist within complex communities known as biofilms. In the present work we aim to characterize the microbial population present in ornamental waters and perform a risk assessment for public health resulting from human interaction with it.

Design, development, and use of molecular primers and probes for the detection of Gluconacetobacter species in the pink sugarcane mealybug

Molecular tools for the species-specific detection of Gluconacetobacter sacchari, Gluconacetobacter diazotrophicus, and Gluconacetobacter liquefaciens from the pink sugarcane mealybug (PSMB) Saccharicoccus sacchari Cockerell (Homiptera: Pseudococcidae) were developed and used in polymerase chain reactions (PCR) and in fluorescence in situ hybridizations (FISH) to better understand the microbial diversity and the numerical significance of the acetic acid bacteria in the PSMB microenvironment. The presence of these species in the PSMB occurred over a wide range of sites, but not in all sites in sugarcane-growing areas of Queensland, Australia, and was variable over time. Molecular probes for use in FISH were also designed for the three acetic acid bacterial species, and shown to be specific only for the target species. Use of these probes in FISH of squashed whole mealybugs indicated that these acetic acid bacteria species represent only a small proportion of the microbial population of the PSMB. Despite the detection of Glac. sacchari, Glac. diazotrophicus, and Glac. liquefaciens by PCR from different mealybugs isolated at various times and from various sugarcane-growing areas in Queensland, Australia, these bacteria do not appear to be significant commensals in the PSMB environment.

Differential distribution of ammonia- and nitrite-oxidising bacteria in flocs and granules from a nitrifying/denitrifying sequencing batch reactor

A lab-scale sequencing batch reactor was operated with alternating anoxic/aerobic conditions for nitrogen removal. Flocs and granules co-existed in the same reactor, with distinct aggregate structure and size, for over 180 days of reactor operation' Process data showed complete nitrogen removal, with temporary nitrite accumulation before full depletion of ammonia in the aerobic phase. Microbial quantification of the biomass by fluorescence in situ hybridisation showed that granules contained most of the nitrite-oxidising bacteria (NOB) whereas the ammonium-oxidising bacteria (AOB) seemed to be more abundant in the flocs. This was supported by microsensor measurements, which showed a higher potential of NO2- uptake than NH4 uptake in the granules. The segregation is possibly linked to the different growth rates of the two types of nitrifiers and the reactor operational conditions, which produced different sludge retention time for flocs and granules. The apparent physical separation of AOB and NOB in two growth forms could potentially affect mass transfer of NO2- from AOB to NOB, but the data presented here shows that it did not impact negatively on the overall nitrogen removal. (c) 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.

Multidimensional modelling to investigate interspecies hydrogen transfer in anaerobic biofilms

Anaerobic digestion is a multistep process, mediated by a functionally and phylogenetically diverse microbial population. One of the crucial steps is oxidation of organic acids, with electron transfer via hydrogen or formate from acetogenic bacteria to methanogens. This syntrophic microbiological process is strongly restricted by a thermodynamic limitation on the allowable hydrogen or formate concentration. In order to study this process in more detail, we developed an individual-based biofilm model which enables to describe the processes at a microbial resolution. The biochemical model is the ADM1, implemented in a multidimensional domain. With this model, we evaluated three important issues for the syntrophic relationship: (i) is there a fundamental difference in using hydrogen or formate as electron carrier? (ii) Does a thermodynamic-based inhibition function produced substantially different results from an empirical function? and; (iii) Does the physical colocation of acetogens and methanogens follow directly from a general model. Hydrogen or formate as electron carrier had no substantial impact on model results. Standard inhibition functions or thermodynamic inhibition function gave similar results at larger substrate field grid sizes (> 10 mu m), but at smaller grid sizes, the thermodynamic-based function reduced the number of cells with long interspecies distances (> 2.5 mu m). Therefore, a very fine grid resolution is needed to reflect differences between the thermodynamic function, and a more generic inhibition form. The co-location of syntrophic bacteria was well predicted without a need to assume a microbiological based mechanism (e.g., through chemotaxis) of biofilm formation.

Studies on biofilm growth of Pseudomonas aeruginosa PAO1

The development of in vitro techniques to model the surface-associated mode of growth is a prerequisite to understanding more fully the physiological changes involved in such a growth strategy. Key factors believed to influence bacterial persistence in chronic infections are those of the biofilm mode of growth and slow growth rate. Methods for controlling Pseudomonas aeruginosa biofilm population growth rates were investigated in this project. This microorganism was incompatible with the in vitro 47mm diameter membrane filter-based biofilm technique developed for the study of Escherichia coli and Staphylococcus epidermidis by Gilbert et al (Appl. Environ. Microbiol. 1989, 55, 1308-1311). Two alternative methods were designed. The first comprised a 25mm diameter cellulose acetate membrane filter supported in an integral holder. This was found to be limited to the study of low microbial population densities with low flow rates. The second, based on a cylindrical cellulose fibre depth filter, permitted rapid flow rates to be studied and allowed growth rate control of biofilm and eluted cells. Model biofilms released cells to the perfusing medium as they grew and divided. The viability of released cells was reduced during, and shortly after, inclusion of ciprofloxacin in the perfusate. Outer membrane profiles of biofilm populations exhibited at least two bands not apparent in planktonic cells grown in batch and chemostat culture, and LPS profiles of biofilm populations showed variation with growth rate. Cell surface hydrophobicity of resuspended biofilm cells varied little with growth rate, whilst it decreased markedly for cells released from the biofilms as growth rate increased. Cells released from the biofilm were more hydrophilic than their sessile counterparts. Differing growth rates, LPS profiles and hydrophobicity are proposed to have a bearing on the release of cells from the adherent population.

Eliminação/valorização de resíduos de frutas (kiwi) por digestão anaeróbia

Este estudo tem como objetivo a valorização económica de resíduos agroindustriais, nomeadamente resíduos de kiwi, por digestão anaeróbia de forma a otimizar a produção de biogás e a sua qualidade (% CH4). Trata-se de uma pesquisa experimental que consistiu na avaliação da produção de biogás usando diferentes proporções de substrato e inóculo, quatro valores distintos para a razão C:N, inóculo de diferentes digestores e colheita do inóculo em épocas distintas do ano. Os ensaios foram desenvolvidos num reator batch em condições mesofílicas, sendo o processo acompanhado por monitorização dos parâmetros: pH, Alcalinidade, Ácidos Gordos Voláteis (AGV), Sólidos Totais (ST), Sólidos Voláteis (SV), Carência Química de Oxigénio (CQO) e Carbono. Para a totalidade dos ensaios, o valor de pH no reator praticamente não apresentou variação, mantendo-se em torno de 7,0; a alcalinidade do meio, 1500 mg CaCO3/L, revelou-se adequada uma vez que no final do processo de DA a concentração de AGV (400-600 mg/L), nunca excede os valores considerados críticos. Os resultados obtidos apresentam valores interessantes para um número considerável de ensaios. Das 10 experiências realizadas, em duas foram obtidos resultados muito significativos em relação à literatura; o ensaio com 1% de substrato (experiência 2) registou uma produção de biogás de 1628 L/kg SV com uma %CH4 de 57% e o biogás de maior qualidade, 85% de metano, foi obtido no ensaio com 5% de resíduo de kiwi (experiência 10). As experiências em que se avaliou o efeito da razão C:N foram as menos produtivas, possivelmente devido à inibição da atividade da população microbiana pelo KNO3. A qualidade do inóculo revelou-se determinante num conjunto de ensaios, nomeadamente quando a sua colheita foi realizada no inverno, com o digestor a apresentar temperaturas bastante baixas. De acordo com os valores mais favoráveis para a produção de biogás, por tonelada de resíduo de kiwi poderá ser obtido um valor monetário bruto de 102 €, resolvendo-se um problema de eliminação deste resíduo, com valorização energética simultaneamente.

Asymptotic stability of a coupled Advection-Diffusion-Reaction system arising in bioreactor processes.

In this work, we perform an asymptotic analysis of a coupled system of two Advection-Diffusion-Reaction equations with Danckwerts boundary conditions, which models the interaction between a microbial population (e.g., bacterias), called biomass, and a diluted organic contaminant (e.g., nitrates), called substrate, in a continuous flow bioreactor. This system exhibits, under suitable conditions, two stable equilibrium states: one steady state in which the biomass becomes extinct and no reaction is produced, called washout, and another steady state, which corresponds to the partial elimination of the substrate. We use the method of linearization to give sufficient conditions for the asymptotic stability of the two stable equilibrium configurations. Finally, we compare our asymptotic analysis with the usual asymptotic analysis associated to the continuous bioreactor when it is modeled with ordinary differential equations.

Rock paintings and microorganisms: a new insight on Escoural cave

European cave art is of tremendous importance to understand the cultural traditions of the Upper Palaeolithic (35 000 – 10 000 BP) populations. Indeed, Prehistoric communities performed numerous cave paintings all over Western Europe. Understanding these artworks should provide a better knowledge of these early cultural aspects. Although numerous studies have been carried out to analyse the materials used by those communities, nothing has been done on the techniques’ palette of Escoural Cave’s representations. The present work aims at providing the very first data about the techniques and materials used by the Prehistoric to perform the cave paintings of Escoural (Alentejo, Portugal), and the microorganisms possibly endangering this unique parietal art. In situ observations coupled with an extensive micro-sampling and micro-destructive analyses allowed to characterize the coloured material and the way they were applied on the walls of the cave. Both red and black pigments present major composition’s disparities among the different paintings and drawings, supporting a more complex occupations’ chronology than what was earlier thought. The Palaeolithic paintings have suffered deterioration from environmental conditions and include chemical, mechanical and aesthetic alterations, possibly as a result of fungal activity. The standard techniques for biological assessments used in these contexts provided important insights on the diversity of the microbial population, though they have accuracy limitations. To understand the extent and viability of the existing microbiota, DNA quantification and biomarkers analyses, such as desidrogenase activity were performed and correlated with ergosterol amounts; RESUMO: A Arte Rupestre Europeia é de grande importância para compreender as tradições culturais da população do Paleolítico Superior (35 000 - 10 000 BP). De fato, as comunidades Pré-históricas realizaram inúmeras pinturas rupestres em toda a Europa Ocidental, sendo crucial compreender estas obras de forma a proporcionar um melhor conhecimento destes ancestrais aspectos culturais. Embora vários estudos tenham sido realizados para analisar os materiais utilizados por estas comunidades, nada foi efetuado sobre a técnica de execução das representações presentes na Gruta do Escoural. O presente trabalho visa fornecer os primeiros dados sobre as técnicas e materiais utilizados na Pré-História para executar as pinturas rupestres de Escoural (Alentejo, Portugal) bem como caracterização dos microorganismos possivelmente associados aos danos deste bem único. Observações in situ, juntamente com uma extensa micro-amostragem e análises micro-destrutivas permitiu caracterizar os pigmentos utilizados e a forma como eles foram aplicados nas paredes da caverna. Tanto os pigmentos vermelhos como os pretos apresentam composição distinta nas diversas pinturas e desenhos aí representados, apoiando a presença de diferentes ocupações contrariamente ao que se pensava até então. As pinturas Paleolíticas têm sofrido deterioração, devido às condições ambientais, nomeadamente alterações químicas, mecânicas e, possivelmente como resultado da atividade fúngica. As técnicas usualmente utilizadas para a avaliação de contaminação biológica fornecem informação importante sobre a diversidade da população microbiana, embora apresentem algumas limitações. Para entender a extensão e a viabilidade da microbiota existente, a quantificação de DNA e análise de biomarcadores como actividade de desidrogenases foram realizadas e correlacionadas com o conteúdo em ergosterol.