Diversidade de respostas de Corynebacterium diphtheriae frente a agentes oxidantes: resistência, adaptação e envolvimento do determinante de resistência ao telurito (TeR) e do sistema OxyR na virulência bacteriana

Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo.

Estudo da resistência aos antimicrobianos em enterobactérias isoladas de mãos de manipuladores de alimentos em cantinas permissionárias de uma universidade no Município do Rio de Janeiro

A contaminação dos alimentos e transmissão de patógenos via manipuladores pode ocorrer se as condições de higiene, armazenamento e preparo não estiverem satisfatórios. Procedimentos inadequados de manipulação oferecem um perigo potencial à saúde pública devido ao alto risco de ocorrência de doenças de origem alimentar por microrganismos resistentes aos antimicrobianos. Neste estudo foram coletados swabs das mãos de 49 manipuladores de alimentos, isoladas e identificadas por metodologia convencional 244 enterobactérias de 7 cantinas permissionárias em uma Universidade do Município do Rio de Janeiro. Foram utilizados discos contendo os seguintes antimicrobianos: aztreonam, tobramicina, ceftazidima, cloranfenicol, tetraciclina, sulfa, amicacina, ampicilina e sulbactam, ciprofloxacina, gentamicina, cefalotina, cefepime, cefoxitina, imipenem, ampicilina, cefotaxima. A pesquisa de genes que codificam β-lactamases foi realizada pela Reação em Cadeia da Polimerase para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX, blaOXA-1 e blaCMY-2. As espécies mais prevalentes identificadas foram: Enterobacter cloacae (21,3%), Citrobacter braakii (15,2%), Escherichia coli (12,7%), Klebsiella pneumoniae subesp. Pneumoniae (12,2%). O perfil de resistência aos antimicrobianos revelou que 94 (38,5%) cepas identificadas apresentaram resistência a pelo menos dois antibióticos, 55 cepas (22,5%) a pelo menos um antibiótico, 34 cepas (13,9%) a três antibióticos, 14 cepas (5,7%) mostraram-se resistentes a quatro antibióticos. Uma cepa de E. cloacae mostrou resistência múltipla a dez antibióticos e 140 cepas (57,3%) foram resistentes simultaneamente a cefalotina e cefoxitina. Nenhuma cepa foi resistente ao aztreonam e a sulfa e apenas 01 foi resistente ao ciprofloxacina, 01 ao imipenem e 02 a cefotaxima. Foi identificado a presença do gene blaSHV em uma cepa de K. pneumoniae subsp. pneumoniae. Este dado aponta para uma mudança no perfil dessas bactérias isoladas da comunidade que passam a ter características semelhantes com as de origem hospitalar. Os resultados alertam para um perigo à saúde dos consumidores e conseqüentemente à saúde pública, devido a presença de enterobactérias resistentes aos antimicrobianos nas mãos de manipuladores de alimentos.

Identificação de alvos moleculares para o diagnóstico quantitativo da resistência a pesticidas organofosforados em populações do carrapato-dos-bovinos.

Os programas de controle direcionados aos parasitas ainda exigem a utilização de produtos químicos para maior estabilidade operacional das ações de controle e o uso de carrapaticidas químicos é a principal ferramenta de controle para as infestações do carrapato-dos-bovinos. A utilização de técnicas fenotípicas de avaliação in vitro da suscetibilidade de carrapatos às bases pesticidas são ainda o método mais prático e mais utilizados para o diagnóstico e mensuração do fator de resistência às bases carrapaticidas. Na atualidade, o desenvolvimento e o aprimoramento de provas diagnósticas moleculares de resistência aos diferentes grupos pesticidas devem ser consideradas como ações prioritárias de pesquisa e desenvolvimento dada a necessidade de disponibilização ao setor produtivo de ferramentas acuradas e de rápida execução que a médio prazo venham a substituir os bioensaios, os quais necessitam de aproximadamente 45 dias para obtenção dos resultados. A partir de uma população de Rhipicephalus microplus reconhecidamente resistente a pesticidas foram realizados os estudos que demonstram a atividade enzimática das estares no processo de detoxicação de organofosforados. Observou-se que na cepa de R. microplus resistente a organofosforados ocorreu o aumento na transcrição dos genes que codificam enzimas metabolizantes, possibilitando identificar os alvos moleculares aptos para serem utilizadas no desenvolvimento do ensaio diagnóstico molecular quantitativo para a resistência aos pesticidas organofosforados em populações do carrapato-dos-bovinos.

Disseminação horizontal de genes que codificam para β-lactamases de espectro alargado em isolados de enterobacteriaceae de origem hospitalar

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Variabilidade genómica de Citrus tristeza virus e transformação genética de Citrus aurantium L. com vista à obtenção de resistência

Tese de dout., Biologia, Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais, Univ. do Algarve, 2003

Mecanismos de Resistência aos Antibióticos

Este trabalho aborda como principal tema os mecanismos de resistência aos antibióticos. Em primeiro lugar, refere-se às bases genéticas desta resistência, em que os genes que conferem esta resistência estão contidos em plasmídeos R, A transmissão horizontal de genes por conjugação. A resistência pode ser intrínseca, se a bactéria possuir características estruturais ou enzimáticas que levam à resistência a um determinado antibiótico, ou, na maioria das vezes, adquirida. A resistência adquirida refere-se a quatro grandes grupos, a alteração da permeabilidade ou do local de acção do antibiótico, bombas de efluxo e o mecanismo enzimático da degradação ou inactivação do antibiótico. Diversas organizações, tanto nacionais, como o Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, como internacionais como a OMS, têm tido um desempenho essencial no combate à resistência bacteriana, nomeadamente na descrição de estratégias. No entanto é necessário a contribuição dos governantes, dos profissionais de saúde bem como da sociedade em geral.

Genética e mapeamento molecular da resistência parcial à ferrugem da folha da aveia (Avena sativa L.)

A ferrugem da folha é a moléstia de maior importância econômica para a cultura da aveia e a resistência qualitativa, geralmente utilizada para o seu controle, apresenta pouca durabilidade. A utilização de resistência parcial, caracterizada pelo progresso lento da moléstia, tem sido reconhecida como alternativa para obtenção de genótipos com resistência mais durável. Os objetivos deste trabalho foram determinar o progresso da ferrugem, o controle genético da resistência, e identificar marcadores moleculares associados a essa resistência, em várias gerações e anos. Populações F2, F3, F4, F5 e F6 do cruzamento UFRGS7/UFRGS910906 (sucetível/parcialmente resistente) (1998, 1999 e 2000) e F2 do cruzamento UFRGS7/UFRGS922003 (1998), foram avaliadas a campo quanto à porcentagem de área foliar infectada, para determinar a área sob a curva do progresso da doença (ASCPD). Mapeamento molecular, com marcadores AFLP (amplified fragment length polymorphism), foi realizado em F2 e F6, do primeiro cruzamento, identificando marcadores associados à resistência quantitativa (“quantitative resistance loci” ou QRLs). Resultados de três anos evidenciaram alta influência do ambiente na expressão da resistência, apresentando, entretanto, variabilidade genética para resistência parcial nas populações segregantes. A distribuição de freqüências do caráter ASCPD nas linhas recombinantes F5 e F6 foi contínua, indicando a presença de vários genes de pequeno efeito em seu controle. Estimativas de herdabilidade variaram de moderada a alta. O mapa molecular F2 foi construído com 250 marcadores, em 37 grupos de ligação, e o mapa F6 com 86 marcadores em 17 grupos de ligação. Cinco QRLs foram identificados na F2 e três na F6. O QRL identificado na F6, pelo marcador PaaMtt340 apresentou consistência em dois ambientes.

De muros, tempos, artes e pingue-pongue aos genes, anfioxos, mórulas e trissomias : falando do corpo nas práticas escolares

As problematizações que me levaram a realização desse estudo vinculam-se a minha formação como bióloga e professora de Biologia. A partir de aproximações com leituras do campo dos Estudos Culturais, dos Estudos Culturais da Ciência e de estudos com inspiração foucaultiana, passei a questionar tanto a formação acadêmica que me constituiu, quanto o lugar que os objetos, as classificações e as explicações ligados ao corpo no campo da Biologia adquiriam nas práticas escolares. Nesse estudo, tomo o corpo como produção de práticas sociais; inscrito por discursos e práticas de diferentes instâncias culturais que se articulam e se confrontam, constituindo corpos múltiplos, sujeitos particulares. Com esses entendimentos e questionamentos, busquei, nessa dissertação, conhecer e problematizar o corpo nas práticas escolares, ou melhor, como a escola lida com os corpos nas suas práticas cotidianas e naquelas relacionadas ao campo da Biologia, assim como alguns efeitos nos corpos dos estudantes. Realizei esta pesquisa numa escola da rede pública estadual de Porto Alegre. Para tanto, freqüentei o espaço escolar e as aulas de duas turmas do segundo ano do Ensino Médio, por aproximadamente dois meses, e também uma atividade “extra-muros”, um passeio à 4ª Bienal de Arte do Mercosul, com a turma da manhã. Para a realização da pesquisa na escola, utilizei ferramentas de cunho etnográfico e realizei entrevistas com alguns estudantes. Nas análises, fui fazendo relações com autores dos estudos anteriormente citados, conforme as questões que emergiam nessa trajetória. Ao integrar as atividades escolares cotidianas, passei a observar e analisar questões relativas aos efeitos de estratégias disciplinares, direcionadas à fabricação de corpos escolares; ao mesmo tempo, busquei apontar alguns movimentos de resistência e diferentes formas, que estudantes e professores, encontraram para lidar com tais estratégias Procurei mostrar como, nessas relações configuram-se uma pluralidade de sujeitos e práticas que significam o espaço escolar. Da imersão que empreendi na sala de aula, foram criadas questões relativas ao corpo no campo de saberes. Nessa discussão, o corpo associado aos discursos da disciplina biológica foi trazido para a sala de aula vinculado a explicações da área científica, tais como a Embriologia e a Genética, sendo que esse modo de tratar o corpo não articulou-se, muitas vezes, às experiências e problematizações dos estudantes. Por último, analisei uma aula específica, que tratou da temática do aborto numa gestação de um feto com uma patologia grave, sem perspectivas de vida. Essa aula foi uma encenação dos estudantes de um julgamento, em que a mãe pediu autorização na justiça para a interrupção da gravidez. Nesse momento, as problematizações que fiz disseram respeito ao posicionamento de sujeitos — mulher, homem, mãe, pai, filhos, experts, monstros e outros — em nossa sociedade, por diferentes discursos — médicos, biológicos, políticos, religiosos, morais, éticos, etc.

Componentes da resistência quantitativa à ferrugem da folha em linhagens recombinantes de aveia

A ferrugem da folha da aveia, causada pelo fungo Puccinia coronata f. sp. avenae, é responsável por grandes decréscimos na produção, afetando tanto o rendimento como a qualidade de grãos. O controle através do uso de cultivares com resistência qualitativa tem se mostrado pouco efetivo em termos de durabilidade. Neste sentido, a resistência quantitativa pode ser uma alternativa de controle viável, em busca de uma resistência mais durável, já que exerce menor pressão de seleção sobre a população patogênica. A resistência quantitativa reduz a taxa de progresso da doença, pela combinação dos diversos componentes que a condicionam, como: longo período latente, curto período infeccioso, baixa eficiência de infecção e pústulas de comprimento reduzido. Não se sabe ao certo o papel individual de cada um destes componentes sobre o progresso da doença no campo, bem como, o número de genes que determinam estas características. Assim, este trabalho visou caracterizar os componentes da resistência quantitativa (período latente, período infeccioso, comprimento de pústulas e ASCPD) à ferrugem da folha da aveia, em planta adulta e plântulas, tanto em condições controladas como em condições de campo. Para tanto foram utilizadas 83 linhagens recombinantes F6:10 de aveia branca, oriundas do cruzamento de um pai suscetível (UFRGS 7) com um pai com resistência quantitativa (UFRGS 910906). As linhagens apresentaram variabilidade para as características avaliadas, exceto para comprimento de pústulas em planta adulta. Os componentes da resistência apresentaram distribuição normal, exceto o comprimento de pústulas em planta adulta e o período de latência em plântulas. Isto sugere a presença de vários genes de pequeno efeito atuando na expressão dos mesmos, não se enquadrando em nenhum modelo de poucos genes. Os resultados sugerem que a resistência quantitativa à ferrugem da folha da aveia é resultado da ação conjunta de todos os componentes que a condicionam, e não de apenas um deles. Ainda, mecanismos diferenciados parecem estar atuando em cada genótipo na expressão desta característica.

Pesquisa de genes de metalo-beta-lactamases em pseudomonas aeruginosa isoladas em três hospitais universitários de Porto Alegre

Objetivos: Padronizar uma técnica molecular, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detectar os genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 que conferem a Pseudomonas aeruginosa resistência a carbapenêmicos (imipenem e meropenem) através da produção das metalo-β-lactamases (MBL) SPM-1, VIM-2 e IMP-1. Comparar os resultados obtidos com a técnica de PCR com os obtidos através de uma técnica fenotípica para detecção desse mecanismo enzimático de resistência. Descrever a prevalência dos genes de MBL. Metodologia: Utilizando 48 amostras clínicas de P. aeruginosa resistentes a ceftazidima e/ou imipenem sendo 37 caracterizadas como produtoras de MBL através de uma técnica fenotípica (aproximação de disco) e 11 como não produtoras pela mesma técnica. Esses isolados foram testados com três primers específicos para os seguintes genes: blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 Resultados e Discussão: Dos 37 isolados produtores de metalo-β-lactamase, 29 tiveram resultado positivo na PCR sendo 27 positivos para o gene blaSPM-1 e 2 positivos para o gene blaIMP-1 . Em nenhum isolado foi detectado o gene blaVIM-2 .Oito isolados caracterizados como produtores de MBL não tiveram nenhum produto amplificado com os três pares de primers. Os 11 isolados caracterizados como não produtores de MBL não tiveram produto amplificado. Assim, a sensibilidade da técnica molecular foi de 78,40% e a especificidade 100,0% considerando a técnica fenotípica de aproximação de disco como padrão ouro Conclusões: Foi possível a padronização da técnica de PCR para a detecção dos genes blaSPM-1 , blaVIM-2 e blaIMP-1 bem como foi possível a comparação entre a técnica de PCR e a técnica fenotípica, sendo que a metodologia molecular apresentou 100% de especificidade e 78,40% de sensibilidade. O gene de MBL mais prevalente foi blaSPM-1 encontrado em 27/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaIMP-1 foi detectado em apenas 2/29 amostras de P. aeruginosa resistentes ao imipenem. O gene blaVIM-2 e não foi detectado nas amostras de P.aeruginosa analisadas neste estudo.

Associação da frequência alélica dos polimorfismos dos genes do sistema renina angiotensina com a força muscular e pressão arterial de idosas

Physiological changes induced by the aging process is dynamic and progressive, reducing the adaptability and independence of older people and may be influenced by genetic and environmental factors. Thus the aim of this thesis was to investigate the association between polymorphism of the ACE gene ID and the phenotypes of muscular strength and blood pressure of 62 elderly Brazilian (67.35 ± 5.66 years) during a 16-week program of supervised training. The elderly women were stratified by age, with the group 1 (G1, n = 34) <70 years and group 2 (G2 n = 28) ≥ 70 years, and in three groups by ACE, ACE-II (n = 8) ACE- DD (n = 35) and ACE-ID (n = 19). The level of muscle strength was evaluated by the method of maximum repetitions and measures of blood pressure (BP) were measured before and after training (PAPré1 and PAPós1) and before and after each training session (PAPre2 and PAPós2), in place of training. DNA samples were isolated from peripheral blood leukocytes polymorphism and insertion / deletion (ID) of the ACE gene (rs1800795) was genotyped by polymerase chain reaction (PCR) plus PCR-confirmatory. The genotype distribution of the polymorphism ID attended the prerogatives of Hardy-Weitíherg. There was variation in power levels before and after training and the age between groups (t-test) and the ACE polymorphism (ANOVA) (p <0.05). Depending on the results it was concluded that resistance training helps to reduce SBP and increased muscle strength of upper and lower limbs when considering the age and ACE polymorphism. In this study the Elderly carriers of the D allele were more reactive to changes in BP resistance training. This study was multidisciplinary project involving researchers in the areas Medical, Physical Education, Pharmacy, Nutrition, Gerontology and Statistics. This fulfilled the requirements of the multidisciplinary Graduate Program in Health Sciences

Herança da resistência ao enfezamento em milho

Os objetivos deste trabalho foram determinar a herança da resistência ao complexo de enfezamento em milho e determinar as melhores fontes de resistência entre as linhagens estudadas. Foram realizadas as análises dialélica e médias de gerações em linhagens de milho. Para a análise dialélica, foram cruzadas 12 linhagens de milho, em dialélico parcial. Para análises de médias de gerações, foram cruzadas três linhagens resistentes e quatro suscetíveis, para a obtenção das gerações F1, F2, RCP R e RCP S. Os trabalhos foram conduzidos em Jaboticabal, SP. A incidência de enfezamento foi avaliada no estádio fenológico R3. Efeitos significativos quanto à capacidade geral de combinação e capacidade específica de combinação foram obtidos, o que indicou que, no controle do caráter enfezamentos, estão envolvidos tanto os efeitos aditivos quanto os de dominância. Análises de médias de gerações mostraram a presença de poucos genes envolvidos com o controle da resistência, com predominância de efeitos aditivos, o que permite a seleção de genótipos resistentes. As linhagens L02, L03 e L05 poderão ser utilizadas como fontes de resistência, em futuras combinações híbridas.

Avaliação da resistência a tobamovirus em acessos de Capsicum spp.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Prospecção de genes de interesse biotecnológico : uma abordagem metagenômica

The total number of prokaryotic cells on Earth has been estimated at 4 to 6x1030 and only about 1% of microorganisms present in the environment can be cultivated by standard techniques of cultivation and plating. Therefore, it is a huge biological and genetic pool that can be exploited, for the identification and characterization of genes with biotechnological potential. Within this perspective, the metagenomics approach was applied in this work. Functional screening methods were performed aiming to identify new genes related to DNA repair and / or oxidative stress resistance, hydrocarbon degradation and hydrolytic activities (lipase, amylase and protease). Metagenomic libraries were built utilizing DNA extracted from soil samples collected in João Câmara RN. The libraries were analyzed functionally using specific substrate containing solid medium (hydrolytic activity), supplemented with H2O2 (DNA repair and / or resistance to oxidative stress) and liquid medium supplemented with light Arabian oil (activity, degradation of hydrocarbons). After confirmation of activity and exclusion of false-positive results, 49 clones were obtained, being 2 positive for amylase activity, 22 resistant to oxidative stress generated by H2O2 and 25 clones active for hydrocarbons degradation. Analysis of the sequences showed hypothetical proteins, dienelactona hydrolase, DNA polymerase, acetyltransferase, phosphotransferase, methyltransferase, endonucleases, among other proteins. The sequence data obtained matched with the functions tested, highlighting the success of metagenomics approaches combined with functional screening methods, leading to very promising results

Perfil de resistência a antimicrobianos de Staphylococcus aureus isolados de granjas e frigoríficos de suínos

Staphylococcus aureus are involved in a wide range of clinical problems to swine industry as son in humans. Epidemiological researchs prove his potential to acquire resistantence to antibiotics. Nowadays, methicillin-resistant S. aureus (MRSA) are responsabilized for nosocomial infections and many studies are done because MRSA are spread to extra hospitalar enrivonment and frequentely isolated from domestic animals including pigs. The aim of this study was to determine the presence o S. aureus at swine farms and identify the mecA, icaA and icaD genes and the resistant proflife to antibiotics. Overal, 458 swabs were taked from five pigeris and two slautherhouses. All the samples were placed on Braid - Parker and blood agar follow by biochemical analyses. The suspect colonies were submitted to PCR to confirm the S. aureus species, by the detection of the coa gene, mecA to avaible meticillin-resistant as son to the virulence gens icaA and icaD that can determine slime production. Antibiogram were done to evaluate the response to 11 antibiotics. All pigeris and slautherhouse were positive and 81 (79%) samples were S. aureus positive including four isolates from pigs employeers. The mecA gene was not detected. The icaD gene was most frequent and 41% were positive to both genes. The antibiogram show a lot of samples penicillin and tetraciclin resistant. Most of the samples were multirestant.