Avaliação da influência de diferentes óleos extensores com baixo teor de policíclicos aromáticos nas propriedades da borracha à base butadieno e estireno (SBR)

O óleo extensor normalmente empregado em copolímeros à base de butadieno e estireno ( borracha SBR) da série 1712 é o extrato aromático (DAE). Nesta Dissertação, esse óleo foi substituído por óleos com baixos teores de policíclicos aromáticos em formulações de SBR. Esta substituição se deu em atendimento a Regulamentação REACH (EC No1907/2006 do Parlamento Europeu e do Conselho de 18 de Dezembro de 2006, Anexo XVII) que determina que a soma de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos individuais (PAHs) deve ser abaixo de 10 mg/kg e o teor de benzo(a)pireno (BaP) não deve exceder 1 mg/kg. Os óleos empregados foram o extrato aromático residual tratado (TRAE) e dois óleos naftênicos de fornecedores diferentes (HN1 e HN2). As composições de SBR estendidas em DAE, TRAE, HN1 e HN2 tiveram suas propriedades térmicas avaliadas por análise termogravimétrica (TG) e calorimetria diferencial de varredura (DSC). As propriedades físicas foram determinadas por ensaios de tração, dureza, resistência à abrasão e resiliência. Foram ainda avaliadas as propriedades reométricas e reológicas, por viscosidade e relaxação Mooney, respectivamente. Ao final os resultados demonstraram que é possível a substituição do óleo extensor por quaisquer dos óleos testados sem prejuízos nas propriedades estudadas

Cultura de tecidos, análise fitoquímica e avaliação da atividade biológica de Arachis villosulicarpa Hoehne

O amendoim cultivado (Arachis hypogaea) possui várias substâncias com capacidade antioxidante que apresentam efeitos benéficos para a saúde humana. Entretanto, a produção dessas substâncias ainda não foi observada em outras espécies do gênero. O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de sistemas de cultura in vitro para Arachis villosulicarpa, visando o desenvolvimento de alternativas para a produção metabólitos especiais. Segmentos nodais, internodais e foliares foram excisados de plantas in vitro e inoculados em meio MS suplementado com BAP, ANA, PIC ou 2,4-D. Os explantes apresentaram respostas distintas de acordo com o regulador de crescimento utilizado. Na presença de PIC, foi observada a formação de calos friáveis levemente oxidados em todos os explantes. Por outro lado, quando cultivados na presença de BAP ou 2,4-D, os explantes apresentaram a formação de calos compactos, com formação de brotos em diferentes taxas. Na presença de ANA, segmentos nodais e internodais não apresentaram resposta, enquanto que segmentos foliares apresentaram a formação de raízes adventícias em todas as concentrações testadas. Neste trabalho foi realizado uma avaliação comparativa da produção de metabólitos especiais e da atividade biológica em extratos de calos oriundos de folíolos inoculados em BAP 8,8 M, plantas in vitro e plantas ex vitro . Nas análises por meio do HPTLC e do HPLC foi possível demonstrar a diferença na produção de algumas substâncias e indicar a presença de flavonóides e polifenóis nos materiais analisados. Além disso, a partir das atividades biológicas foi possível identificar tanto a atividade antioxidante quanto a não mutagênica dos extratos. Dessa forma, estudos visando à detecção de metabólitos especiais em A. villosulicarpa podem expandir o conhecimento sobre as possibilidades de utilização de espécies do gênero Arachis.

Cultura de tecidos e conservação in vitro de Passiflora foetida L.

O gênero Passiflora ocorre principalmente em regiões de clima tropical, sendo o Brasil um importante centro de diversidade. Passiflora foetida L. é uma espécie silvestre que apresenta características de interesse ornamental e medicinal. O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de sistemas de cultura de tecidos e criopreservação para P. foetida. Explantes caulinares foram excisados de culturas primárias obtidas a partir de plântulas derivadas da germinação in vitro. Para isso foram inoculados em meio MSM, suplementado com diferentes concentrações de ANA, PIC, TDZ e BAP utilizado isoladamente ou em combinação com ANA, e mantidos na presença ou ausência de luz. Foi observada a produção de brotos, calos e raízes adventícias, de acordo com o tipo e a concentração do regulador de crescimento testado e da condição de cultura utilizada. A produção de plantas ocorreu via organogênese direta e indireta em resposta a BAP, enquanto que a formação de calos não morfogênicos foi observada a partir de ambos explantes em resposta a PIC. A produção de raízes adventícias ocorreu em resposta a ANA. Tendo em vista a produção de raízes observada em meio sólido, segmentos internodais foram inoculados em meio líquido suplementado com diferentes auxinas e mantidos em imersão contínua ou sobre pontes de papel de filtro. A maior taxa de multiplicação de raízes foi observada a partir de entrenós mantidos no sistema de ponte de papel de filtro, em resposta a ANA. Segmentos radiculares excisados das culturas primárias também foram utilizados visando à produção de brotos e a multiplicação de raízes. Contudo, apenas foi observada a formação de gemas, sem posterior desenvolvimento de brotos. Além disso, a capacidade proliferativa dos segmentos radiculares inoculados em meio suplementado com ANA foi menor que a obtida a partir dos entrenós cultivados nas mesmas condições. Neste trabalho, foram também testados diferentes protocolos de criopreservação para ápices caulinares de P. foetida por meio de vitrificação e encapsulamento-vitrificação. A recuperação de plantas pós-congelamento foi observada unicamente a partir de ápices encapsulados e expostos à solução de vitrificação PVS2 por 120 minutos. Tendo em vista o potencial medicinal já descrito para P. foetida, através dos diferentes sistemas de cultura desenvolvidos neste trabalho serão obtidos materiais para a avaliação de diferentes atividades biológicas.

Micropropagação e avaliação da potencialidade genotóxica de Petiveria alliacea L.

Petiveria alliacea L. é uma planta pertencente à família Phytolaccaceae, conhecida popularmente no país como guiné, erva-de-alho, erva-tipi ou amansa-senhor. Nativa da Região Amazônica tem sido cultivada em muitas áreas tropicais com propósito medicinal ou ritualístico. O objetivo desse trabalho foi (i) o desenvolvimento e a multiplicação de plantas de P. alliacea L. através de métodos de cultura de tecidos, e monitoramento fitoquímico das culturas, e (ii) avaliação comparativa das potencialidades genotóxica e antigenotóxica entre plantas coletadas no campo e produzidas in vitro. Exemplares de diferentes populações ocorrentes no estado do Rio de Janeiro foram utilizados como matrizes para a cultura. Foi estabelecido um protocolo para multiplicação das plantas em meio MS suplementado com BAP e ANA em diferentes concentrações e combinações, que forneceu como melhor resultado em média 8 plantas por explante na concentração de BAP 4,4 μM + ANA 0,54 μM. A análise fitoquímica foi baseada em métodos cromatográficos de diferentes extratos de plantas de campo e plantas in vitro das populações estudadas resultando em diferentes substâncias identificadas nas amostras analisadas por cromatografia em camada delgada. Os extratos foram também avaliados por cromatografia gasosa acoplada á espectrometria de massas, sendo identificadas diferentes substâncias, entre as quais o dibenzil dissulfeto, um produto de degradação de tiosulfinatos com importantes atividades biológicas na defesa das plantas. Os extratos aquosos das plantas de campo e daquelas estabelecidas in vitro foram submetidos à avaliação da potencialidade genotóxica e antigenotóxica, usando-se como modelo o DNA plasmidial pUC 9.1. Os resultados demonstraram que as concentrações utilizadas do extrato aquoso foram capazes de induzir alterações na conformação estrutural do DNA, indicando a ocorrência de quebras simples e duplas nesta molécula. Observou-se também que as lesões aumentaram, proporcionalmente ao aumento da concentração dos extratos, caracterizando-se, assim, um efeito dose-resposta. Os dados também apontaram para um efeito protetor do extrato aquoso, em relação aos danos oxidativos causados pelo cloreto estanoso, indicando, também, uma potencialidade antigenotóxica do extrato aquoso.

Cultura de tecidos e análise fitoquímica de Arachis repens HANDRO.

Os representantes do gênero Arachis são conhecidos como amendoim, e suas sementes possuem grande quantidade de óleos e proteínas, podendo ser consumidas cruas. A espécie mais cultivada do gênero é Arachis hypogaea, que possui grande importância comercial. Outras espécies são também utilizadas para controle das ervas daninhas e cobertura do solo, assim como ornamentais e na alimentação. Arachis repens, popularmente conhecida como grama amendoim, é utilizada como planta ornamental, na formação de pastagens, como forragem e para cobertura do solo em substituição a várias espécies comuns de grama. Diversas substâncias bioativas têm sido identificadas em A. hypogaea. Contudo, estas substâncias ainda não foram descritas em outras espécies do gênero. O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de sistemas de cultivo in vitro para Arachis repens, visando à micropropagação e à análise comparativa da produção de resveratrol em extratos alcoólicos dos materiais produzidos in vitro, em comparação com as plantas in vivo. Segmentos nodais, internodais e foliares foram excisados de plantas in vitro e inoculados em meio MS suplementado com diferentes concentrações de BAP, TDZ, AIA e KIN, utilizados isoladamente ou em combinação. Os explantes apresentaram respostas distintas de acordo com o regulador de crescimento utilizado. Na presença de BAP foi observada a formação de calos compactos, com formação de brotos em diferentes taxas. Na presença de TDZ, segmentos nodais e internodais formaram calos compactos em todas as concentrações. Segmentos nodais cultivados na presença de diferentes concentrações de AIA em combinação com KIN apresentaram a formação de calogênese. Foi também realizada uma avaliação da atividade antioxidante e a presença de fenóis totais em extratos de diferentes materiais in vivo e produzidos in vitro. Nas análises por meio de CLAE, foi possível detectar a presença de resveratrol tanto nos materiais in vivo, quanto os produzidos in vitro. Dessa forma, o trabalho forneceu resultados preliminares sobre as possibilidades de utilização de A. repens para a produção de metabólitos especiais.

Determinação de atividade antioxidante, compostos fenólicos totais e teor de resveratrol em cinco cultivares brasileiras de Arachis hypogaea L. com a utilização de duas metodologias extrativas

O amendoim A. hypogaea L. é a quarta oleaginosa mais consumida no mundo e suas sementes são altamente energéticas, com grandes quantidades de lipídios, proteínas, vitaminas e carboidratos. Diversas atividades farmacológicas já foram observadas em extratos de raízes, folhas e sementes, sendo a principal delas a atividade antioxidante. Neste trabalho, foi realizada a comparação entre duas metodologias (por maceração e assistida por micro-ondas) para a extração de compostos antioxidantes, incluindo o resveratrol. Também foi realizada a comparação entre extratos de diferentes órgãos de cultivares brasileiras (IAC 886, IAC Caiapó, IAC Tatu ST, IAC 8112 e IAC 99-1) quanto à atividade antioxidante, por DPPH, ao teor de compostos fenólicos, por Folin-Ciocalteu, e ao teor de resveratrol, por HPLC. Por fim, foram estabelecidos protocolos de cultura de tecidos para explantes de sementes, visando à produção de calos e plantas in vitro para posterior dosagem de compostos de interesse, tendo em vista a possibilidade de modulação das condições in vitro. As melhores condições determinadas para a extração por maceração de antioxidantes de A. hypogaea foram 80% de etanol em água como solvente, trituração com almofariz e pistilo, 50 mL solvente por grama de material vegetal seco, 120 minutos de incubação e dois estágios de extração. As melhores condições para a extração de resveratrol assistida por micro-ondas foram o uso de 37 mL de solvente/g material vegetal seco, com agitação de 1200 rpm por 15 minutos, a 37C. De uma maneira geral, os extratos de raízes e oriundos de micro-ondas apresentaram maior atividade antioxidante (até 92,36 2,71%), teor de compostos fenólicos (até 54,15 1,39 mg EAG/g extrato) e teor de resveratrol (até 1,614 0,356 mg/g extrato). Dentre as cultivares estudadas, IAC Tatu e IAC 99-1 foram as que apresentaram os teores mais elevados. Brotos e calos friáveis foram obtidos a partir de cotilédones, eixos embrionários e folíolos embrionários cultivados em meios suplementados com BAP e picloram, respectivamente.

Avaliação do potencial leishmanicida e antibacteriano de Annona mucosa (Jacq.) - Annonaceae cultivada in vitro e in vivo

A biodiversidade brasileira abrange plantas de importância medicinal que podem ser utilizadas na formulação de novos fármacos. Contudo, tem sido reduzida em velocidade alarmante, em função de diferentes ações antrópicas. A cultura de tecidos vegetais propicia a conservação e uso do germoplasma permitindo a obtenção de substâncias de importância medicinal. As leishmanioses são consideradas um problema de saúde pública mundial sendo a espécie Leishmania braziliensis de maior importância epidemiológica no Brasil. Recentemente tem-se registrado aumento da resistência à linha de tratamento usual. Do mesmo modo, o uso indiscriminado de antibióticos levou ao aumento de bactérias multirresistentes, que representam sério risco de infecção. A espécie Annona mucosa (Jacq.) possui substâncias, como acetogeninas e alcaloides, que apresentam atividades antiparasitária e antimicrobiana. Nesse sentido, o objetivo do trabalho foi avaliar o potencial leishmanicida e antibacteriano de extratos de A. mucosa de material produzido in vitro e in vivo. Foi proposto um protocolo de germinação in vitro, ainda não reportada para a espécie, com vistas à obtenção de plântulas axênicas. Em meio WPM foram cultivados explantes hipocotiledonares e foliares em meio MS, suplementados com PIC e diferentes concentrações de KIN, BAP ou TDZ. Os calos obtidos foram cultivados em meio líquido de mesma composição para a produção de suspensões celulares. Os materiais foram submetidos à extração metanólica e posterior fracionamento em hexano e diclorometano. Para a avaliação da atividade dos extratos sobre L. braziliensis foi usado o modelo in vitro, com a forma promastigota, e in vivo na forma amastigota, a partir do tratamento de macrófagos peritoneais de camundongos infectados com o parasito. Ambas as formas foram tratadas com os extratos por 96 e 48h, respectivamente. A atividade antimicrobiana foi avaliada por macrodiluição do extrato em Mueller-Hinton, sendo avaliado o crescimento das cepas após 16h de incubação a 48C. A germinação in vitro da espécie foi alcançada em substrato vermiculita estéril umedecido com solução de sais do meio MS, com taxa média de 85%. A maior produção de calos friáveis foi obtida em meios contendo KIN, com potencial uso para cultivo em suspensões celulares. Os extratos do material in situ e in vitro apresentaram atividade leishmanicida, apesar da toxicidade para macrófagos. Culturas de células em suspensão apresentaram potencial leishmanicida in vitro e redução da infecção em macrófagos. Os extratos do material avaliado apresentaram atividade antimicrobiana seletiva, com inibição do crescimento de Streptococcus pyogenes e Bacillus thurigiensis em diferentes concentrações avaliadas. Os métodos biotecnológicos empregados permitiram a obtenção de materiais com propriedades medicinais para as atividades leishmanicida e antibacteriana, assim como o material in vivo, constituindo este estudo o primeiro relato para as atividades propostas em A. mucosa.

Estabelecimento de culturas de raízes in vitro e avaliação da produção de metabólitos secundários de Cleome spinosa Jacq. (Cleomaceae)

Cleome spinosa é uma espécie herbácea de uso na medicina popular, especialmente no Nordeste do Brasil. A cultura in vitro de raízes adventícias da espécie foi iniciada com segmentos radiculares (0,5 e 1,0 cm) obtidos a partir de duas fontes de explantes: plantas propagadas in vitro e plantas oriundas do processo de germinação in vitro. Os explantes foram inoculados em meio MS líquido suplementado ou não com as auxinas ANA, AIA e AIB em diferentes concentrações (0,5; 1,0; 1,5; 3,0; 5,0 mg.L-1). As culturas foram mantidas em sala de crescimento, sob agitação (100 rpm) e sob fotoperíodo de 16h ou no escuro, com subculturas a cada 45 dias. Explantes oriundos de plantas propagadas in vitro também foram cultivados em meio contendo a citocinina BAP em associação com auxinas, na presença de sorbitol (isoladamente ou em associação com sacarose), em meio MS contendo redução na concentração total de sais minerais (MS1/2 e MS1/4) e em meio sólido. Os resultados mostraram que a adição de auxinas ao meio de cultura foi essencial à multiplicação das raízes, uma vez que em meio MS0 ocorreu significativo desenvolvimento de brotos. A suplementação com ANA não foi eficiente para a produção de raízes e acarretou no calejamento dos explantes, enquanto que a presença de AIA e AIB resultaram na multiplicação das raízes. Ainda assim, independentemente das manipulações realizadas no meio de cultivo, a capacidade de multiplicação mostrou-se reduzida. Uma expressiva multiplicação de raízes foi observada em culturas iniciadas a partir de explantes oriundos de plantas obtidas por germinação in vitro. A maior produção de biomassa foi alcançada em culturas iniciadas com segmentos radiculares de plantas obtidas por germinação in vitro cultivadas em meio contendo com 3,0 mg.L-1 de AIB e mantidas no escuro. Culturas estabelecidas nas melhores condições para acúmulo de biomassa foram acompanhadas por três subculturas, sendo avaliados períodos de cultura de 45 dias e de 60 dias. Culturas mantidas a intervalos de 45 dias apresentaram maior produção de raízes durante a segunda subcultura, enquanto que para o intervalo de 60 dias, embora tenha sido observada a capacidade de multiplicação das raízes, a maior produção de biomassa ocorreu nos primeiros 60 dias de cultivo. A partir de materiais in vivo e in vitro foram realizadas extrações com solventes de polaridade crescente (hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol) e os extratos foram submetidos a avaliações cromatográficas. As análises por cromatografia em camada delgada mostraram a presença de terpenos nos extratos obtidos com hexano e diclorometano, tanto em material obtido a campo como naqueles produzidos in vitro e de compostos fenólicos nos extratos em acetato de etila obtidos a partir de material de campo. Pelas análises por cromatografia líquida associada à espectrometria de massas foi possível observar a presença de flavonoides nas culturas in vitro, não detectados no material de campo. As análises por cromatografia de fase gasosa associada à espectrometria de massas apontaram a presença de esteroides nos extratos em hexano de raízes coletadas a campo e nas culturas in vitro de raízes. Os resultados obtidos mostraram a viabilidade da produção de culturas de raízes in vitro para a espécie C. spinosa e o potencial deste material para a produção de substâncias bioativas, algumas não encontradas em material coletado a campo

Produção in vitro, análise fitoquímica e avaliação da atividade antineoplásica de metabólitos de Hovenia dulcis Thunb. (Rhamnaceae) obtidos por diferentes estratégias biotecnológicas

Hovenia dulcis Thunberg, natural da Ásia Oriental, é cultivada no Brasil onde é conhecida como uva-do-japão. A espécie possui várias indicações na medicina popular e alguns estudos apontam o seu potencial antineoplásico, tripanocida e hepatoprotetor. Metabólitos secundários são substâncias não essenciais para a sobrevivência celular, mas que fornecem vantagens adaptativas aos vegetais, sendo atribuído, para algumas delas, atividades biológicas importantes. Substâncias de interesse medicinal têm sido obtidas por técnicas da cultura de tecidos vegetais, como a calogênese e a cultura de células em suspensão, que permitem a síntese de matéria-prima de forma contínua e homogênea, independentemente de fatores ambientais e sazonais. O presente estudo objetivou o estabelecimento de culturas in vitro de H. dulcis, visando à produção de metabólitos de interesse, com vistas à avaliação do seu potencial antineoplásico sobre células K562. Foram testados protocolos para o estabelecimento de diferentes sistemas, como culturas de calos, de células em suspensão (CCS) e compact callus clusters (CCC) e ainda a avaliação do uso de elicitores na otimização de metabólitos produzidos in vitro. Foi verificado que a adição dos fitorreguladores KIN e TDZ, substituindo o BAP, não foi capaz de induzir a formação de calos friáveis, bem como a manutenção das culturas em ausência de luz. O uso do nitrato de prata promoveu a friabilidade de calos em todas as concentrações testadas, considerando-se 2,0 mg.L-1 a melhor concentração. Foram alcançadas taxas de 100% de formação de CCS tanto na presença, quanto em ausência de AgNO3. O maior acúmulo de biomassa foi verificado na concentração mais baixa de PIC (0,625 mg.L-1). A análise dos espectros de RMN indicou a presença de (+)-dihidromiricetina, (+)-galocatequina, hovenitina II, hovenosideo G, hodulosideo III, hodulosideo IV, hodulosideo I e hovenidulciosideo B1 nas culturas de calos friáveis. No estabelecimento de culturas CCC, observou-se a formação de calos compactos verdes em todas as concentrações de ANA testadas. O aumento da velocidade de rotação para 135 rpm aumentou a dispersão das células com consequente formação dos agregados celulares desejados. A seleção de linhagens celulares demonstrou ser um método eficiente na uniformização do tamanho desses agregados e tal uniformidade se manteve estável por mais de cinco subcultivos em 100% das culturas. Uma fração rica em saponinas foi obtida a partir dos agregados celulares, correspondendo a 1,46% da massa seca. A análise por RMN sugeriu a presença das saponinas Hovenosideo G e dos hovenidulciosideos A2 e B2. O uso de elicitores em cultura de calos mostrou-se adequado à produção de metabólitos secundários, sem alterações morfológicas nos mesmos. A elicitação alterou o perfil cromatográfico analisado por HPLC. Na elicitação com 5,0 mg.L-1 de extrato de levedura foi verificado um aumento de quase três vezes (12,280 3,396 equivalentes de quercetina/mg de extrato) na síntese de flavonoides. Finalmente, os estudos de ação antitumoral in vitro demonstraram citotoxicidade dos extratos de calos não elicitados de H. dulcis sobre linhagem de leucemia mieloide crônica (IC50 de 74,05 μg.mL-1.) e inibição do crescimento de tais células (K562), sugerindo o potencial antineoplásico para um produto biotecnológio (calo) desta espécie.

6-苄基腺嘌呤在植物中的吸收、运转、代谢及其对蒜苔营养物质再分配的调节

本文以黄瓜幼贡和离体蒜苔为材料，研究了细胞分裂素BAP在植物中的吸收、运转、代谢，及其对离体蒜苔营养物质再分配的调节。 黄瓜幼苗功能大速、大量地吸收外源BAP，其吸收的方式为被动吸收。BAP的吸收和其浓度在相当在的范围内（0.00015-10ppm）成严格的线性关系;饲喂BAP后的幼苗转移到无BAP的营养液培养时，幼苗体内的BAP大量外漏，进入营养液，直到细胞内外的BAP浓度大致平衡。 去根黄化黄瓜苗吸收外源BAP后迅速运转。约有6%的BAP能到达子叶。BAP的运转基本上只在初期，即吸收开始后最初的几个小时中进行光照对BAP的运转有促进作用。在离体蒜苔中，苔茎中部注射的BAP能极性地向上运转并在珠蒜中积累，这个过程是随着时间而逐渐进行的，到第20天，约有48%的BAP在珠蒜中积累。 去根黄化黄瓜苗下胚轴茎部吸收BAP后迅速代谢。首先形成大量的BAP—核苷，随后又迅速减少，而BAP—葡萄糖苷逐渐增加，成为主要的代谢物。BAP—核苷含量的这种变化可能是BAP吸收后只在最初的内个小时中运转这一现象的直接原因。在下胚轴上部，初期BAP—核苷含量极高，随后逐渐减少，也说明黄瓜苗中BAP—核苷是BAP的动转形式。BAP浓度极低时，其代谢速度稍有放慢。 BAP处理蒜苔对其内3H—葡萄糖的分布有显著影响，在顶端处理时促进葡萄糖向珠蒜中积累，在茎部处理时刺激葡萄糖向茎部移动。幼嫩和迅速衰老的蒜苔，其对BAP的敏感性差异颇大。BAP调节蒜苔营养物质再分配的作用可能是通过刺激处理部位的生长而产生的。

马铃薯in vitro 块茎发育的研究及其遗传转化受体系统的建立

研究了BAP在SLM→TIM、MA→TIM和切段诱导系统中与in vitro块茎发育的关系。在SLM→TIM系统中BAP没有促进块茎发育的作用;在MA→TIM系统中BAP具有促进块茎发育的作用;切段培养在20 ℃、8小时光照条件下则其块茎发育对BAP有依赖。系统地研究了光周期、蔗糖浓度和外源细胞分裂素在促进切段块茎发育方面的作用及其交互影响。确定了由切段诱导块茎的最佳培养条件以及用于BAP吸收代谢研究的实验条件。讨论了切段诱导系统在理论研究上的价值和生产上应用的前景。研究了无菌苗、长切段及切段BAP吸收运转代谢特点及其与块茎发育关系。马铃薯植物系统对BAP的吸收运转是需能代谢过程。BAP在植物系统运转性差与其在组织的代谢特点有关。在块茎诱导早期有标物质在小块茎或匍匐茎末端积累，这可能促使细胞分裂从而诱发块茎发育;但在成熟块茎中放射性物质浓度很低。外源细胞分裂素在切段或匍匐茎局部积累不是块茎发育的充分条件。在有利于块茎发育的条件下代谢早期BAP活性代谢产物含量明显地高于对照，代谢一定阶段后二种处理的切段BAP代谢谱趋于接近，这一代谢特点与BAP促进块茎发育的生理效应有关。运用同位素示踪技术研究了切段蔗糖吸收特点，外源细胞分裂素促进蔗糖在切段系统积累从而诱导体细胞储藏组织生化分化。短日照（黑暗）、较高浓度蔗糖、合适浓度BAP都有促进离体切段块茎发育作用，这几个因子在提高切段诱导水平方面具有协同效应。诱导早期切段中有块茎专一性糖蛋白Patatin痕量的存在。当切段发育了较大块茎后（诱导约15天）切段中Patatin含量明显增加。诱导3天切段系统中即有Patatin mRNA高水平地转录。诱导7天阶段Patatin mRNA含量迅速下降。块茎发育很可能是通过几种激素（包括块茎诱导因子）协同地对植物系统同化物尤其是蔗糖源库关系的调节而实现的。 建立了向马铃薯植物引入外源基因的受体系统。叶园盘与农杆菌（pGV2260:: pGV941）共培养。转化植株在选择培养基上培养大约3周即可从愈伤组织或直接从叶片边缘产生。在含有高浓度卡那霉素的培养基上转化植株大多表型正常，切段能够发育块茎，叶片能够形成愈伤组织。转化再生植株均含有NPT－II活性而未转化Desiree无菌苗没有NPT－II活性。Southern分析表明NPT－II基因已整合入转化植物基因组中。这一实验系统的建立为向马铃薯植物引进具有重要经济价值的外源基因创造了条件。

诱导风信子（Hyacinthus orientalis L.）同一花被外植体不同部位细胞分化花芽的研究--外源激素的作用及内源激素的变化

诱导风信子（Hyacnthus orientalis L．）同一花被外植体上不同部位细胞分化花芽，从外源激素的作用和内探激素的变化探讨细胞脱分化启动的原因，研究了不同外源激素的组合下同一花被不同部位花芽分化的诱导频率：测定了花被上、中，下三部位切块离体培养前后的内源IAA和Z+ZR的含量;在此之前研究了GC-MS．MIM内标法测定微量植物材料内源IAA含量的可行性． GC-MS．MIM内标法是测定微量（0.5-1g）植物材料内源IAA含量的一种比较理想的方法，所需材料量一般为0.58．这一方法的材料前处理采用粗提液用C18Sep-pak柱初步分离纯化．HPLC进一步纯化，能获得纯度高的样品，且操作简便，省时省力． 风信子同一花被不同部位细胞均能分化花芽．当培养基中附加2.0mg/l Zeatin或2.0mg/16-BAP时，随着外探IAA浓度从0升高到10.0mg/l．捆胞分化花芽的部位从花被下部向上部移动。 离体培养前后同一花被上、中、下三部位内源IAA和Z+ZR含量测定结果表明．风信子同一花被内源IAA含量是上部最高，下部次之，中部最低，而内源Z+ZR含量从上向下依次增加;在附加不同外源激素的MS培养基上培养3天后，同一花被上，中、下三部位内源IAA和Z+ZR含量部有一定的变化。

普通烟草与毛曼陀罗族间体细胞杂交的研究

采用PEG／DMSO融合法，从普通烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Xanthi nc)叶肉和毛曼陀罗(Datura innoxia Mill.)茎或叶愈伤组织原生质体融合获得I5株花盆中健康生长的族间体细胞杂种植株;其中11株是在没有选择压力的条件下获得，4株则是在有IOA和R6G选择系统存在下获得。同时获得一株试管开花且形态异常的植株和一株花盆中生长的嵌合植株。lOmM IOA和I5μ g／ml R6G均能分别有效地抑制烟草叶肉和毛曼陀罗愈伤组织原生质体的分裂;10% DMSO能显著提高原生质体融合率;PEG种类并不重要，但浓度则很重要;BAP较ZT，KT对植株分化有更好的诱导效果。杂种的形态、细胞、同工酶、Southern杂交，花粉育性分析结果如下：1、l5株杂种较双亲普遍株型矮小，生长缓慢，形态接近烟草但不很正常，根据形态特征可分为两种类型：(1)共有8株，其叶片大小、形状、颜色、开花习惯、花类型（单花）等均与毛曼陀罗接近，但子房败育;(2)共有7株，其株型、叶片形状、颜色、光滑度、花形状、类型（圆锥状花序）、颜色更接近烟草，但少数杂种开单花或先单花后圆锥状花序或先单花后两种花并存，且开花时间不一，部分子房败育。2、杂种染色体数目大都在60～90之间，个别者较少(48条)或较多(125条)，没有一株为双二倍体(2n=96)，并全部为混倍体。3、15株杂种植株均有双亲的细胞色素氧化酶同工酶特征谱带;大部分都有双亲的过氧化物酶同工酶特征谱带，少都仅具烟草的谱带。4、Hae Ⅲ／水稻rDNA的Southern杂交分析表明杂种1较双亲多一条谱带，杂种2较双亲也多一条弱带，其它杂种尚待定。5、花粉活力测定表明毛曼陀罗（种子再生而来）的为99%，烟草（原生质体再生而来）为80～90%，而杂种的为24～61%，育性普遍低于双亲。

硬粒小麦（Triticum durum Desf.）单倍体诱导新技术单倍体原生质体植株的再生

硬粒小麦DR147授以超甜玉米(ss7700)的花粉后，83.4%的小麦柱头上的玉米花粉萌发，花粉管经由花柱抵达胚囊，受精率和成胚率分别为44.4%和42.6%。杂种合子核型高度不稳定，在细胞分裂过程中来自父本玉米的染色体逐渐被排除，最后形成硬粒小麦单倍体胚。尽管硬粒小麦×玉米存在较高频率的双受精(32.7%)，同时形成胚和胚乳，但由于胚乳发育异常及败育，最后难以获得有生活力的种子。 硬粒小麦授以玉米的花粉后用100ppm 2，4-D进行处理（浸蘸穗子或向穗茎节间注射），可以延长杂种胚在植株上的存活时间。授粉9-13天后将颖果表面灭菌后在实体显微镜下剥取不同发育时期的幼胚，分别接种于含或不含2.0mg／l2，4-D，3%蔗糖，200mg／l水解酪蛋白，146mgl谷氨酰氨，300mg／l天冬氨酸的MS固体培养基上进行胚拯救或诱导愈伤组织。结果表明，发育程度较高的胚（具盾片的胚，长度大于0.5mm）容易通过胚拯救获得单倍体植株或诱导出愈伤组织，而发育程序较低的胚（琏形胚，梨形胚，鱼雷形胚，长度小于0.3mm）不易获得单倍体植株或诱导愈伤组织而常常变褐，最后死亡。如果将这些胚预先接种子含0.1mg／l BAP，3%蔗糖，200mg/l水解酪蛋白，146mg/l谷氨酰胺，300mg/l天冬氮酸的MS固体培养基上预培养20天，再转移至愈伤组织诱导培养基上则易于产生愈伤组织，通过选择和继代培养可以获得淡黄色，结构致密的胚性愈伤组织。将这种愈伤组织转移至含1.Omg/l BAP和0.1mg/l NAA的MS固体分化培养基上培养20天后即可分化出小植株和绿色芽点，将这些小植株和绿色芽点再在分化培养基上继代培养20天，形成大量根系发达的健壮植株及次生小植株。其中一个胚性愈伤组织系的分化频率高达70. 6%。从获得的100余棵植株中随机取6棵再生植株进行根尖细胞染色体计数发现它们均为单倍体。具发达根系的健壮植株移入实验田后成活率可达80％以上，并生长至成熟。 利用硬粒小麦×玉米建立的单倍性胚性愈伤组织系进行了原生质体培养的研究。胚性愈伤组织经液体悬浮培养4个月后形成了生长迅速的由大小不同(0.5mm至5mm)的愈伤组织块组成的混合悬浮愈伤组织系，酶解试验表明2.0%纤维素酶RS和0.5%离析酶Y-23组合效果最好，而液体悬浮培养物和固体培养的愈伤组织（在酶解时用锋利的解剖刀片切成1mm左右的块）都能释放出大量原生质体，但悬浮培养物释放出的原生质体状态较好，胞质更浓厚，用KM8p培养基以琼脂糖包埋培养方式培养时得到了较高的（5%左右）分裂频率。 原生质体再生的小愈伤组织经增殖、筛选后可获得胚性愈性组织，将其转移至分化培养基Ⅰ（0.2mg/l 2，4-D，1.0mg/l BAP，0.1mg/l NAA，3%蔗糖，200mg/l水解酩蛋白，146mg／l谷氨酸胺，300m8/l天冬氨酸的MS固体培养基）和Ⅱ（不含2，4-D，其它成份同I）上进行分步分化培养可再生出完整植株，分化频率约为20%。从获得的22棵原生质体再生植株中，随机取4株进行根尖细胞染色体计数表明，它们均为单倍体。

猕猴桃属两个种的原生质体培养与体细胞杂交

猕猴桃是重要的栽培果树，但目前栽培品种过于单一，不能满足生产和消费的需求。由于猕猴桃的雌雄异株特性、种间杂交亲合性差、遗传上高度杂合以及育种周期长等特点，常规杂交育种困难很大。现代生物技术，如原生质体培养和体细胞杂交等，为培育新品种提供了新途径。 毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)和软枣猕猴桃(A.arguta)是猕猴桃属中具有重要利用价值的两个种。毛花猕猴桃果实大小在猕猴桃属中次于中华猕猴桃(A.chinensis)和美味猕猴桃(A.deliciosa)列第三位，果实维生素C含量达1014 mg/l00 g FW。软枣猕猴桃极耐寒，在-40℃下可安全越冬，其果实表面光滑无毛。这两个种是品种改良的重要种质资源。 作为生物技术基础的组织培养与植株再生系统，在毛花猕猴桃上尚未见报道。软枣猕猴桃的组织培养仅有一例报道，且芽分化率和分化系数都很低。这两个种的原生质体培养及与美味猕猴桃的原生质体融合也未见报道。针对这种情况，本试验对毛花猕猴桃和软枣猕猴桃的组织培养、原生质体培养及其与美味猕猴桃品种“Hayward”的原生质体融合进行研究，结果建立了较理想的毛花猕猴桃和软枣猕猴桃组织培养系统;首次从毛花猕猴桃原生质体得到再生植株和从软枣猕猴桃原生质体培养再生愈伤组织;通过改进融合方法，建立了毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的原生质体融合体系，并将异核体培养分裂得到细胞团。这些结果有利于今后毛花猕猴桃和软枣猕猴桃资源的开发利用。主要试验结果如下： 以毛花猕猴桃试管实生苗叶片和茎段为外植体，培养在附加一定浓度Zea或CPPU的MS培养基上，产生的愈伤组织不经转代就可分化芽。试管苗茎段在附加0.0025 mg/L CPPU和0.1 mg/LIAA的MS培养基上愈伤组织产生、芽分化和苗生长都较理想;试管苗叶片则以附加0.025 mg/L CPPU和0.l mg/LIAA或0.5 mg/L Zea和0.1 mg/LIAA的MS培养基较好。当苗生长至1.0 cm时经诱导生根形成完整植株。 在软枣猕猴桃组织培养中，外植体种类、诱导培养基的激素种类和诱导分化时细胞分裂素种类都有重要影响。无菌苗茎段容易愈伤组织化，但分化困难;叶片外植体产生愈伤组织较难，但分化容易。在含Zea的MS培养基上，两种外植体产生的愈伤组织不经转代即能分化芽。分化培养基中添加Zea能有效地诱导芽分化，其中以2.0 mg/L Zea芽的分化最好，而Kin和BAP在0.5- 2.0 mg/L浓度范围内愈伤组织不分化。 以毛花猕猴桃或软枣猕猴桃试管苗叶片为分离原生质体的材料。试管苗的培养条件对原生质体分离效果及其培养反应有显著影响。弱光培养条件对两个种试管苗的原生质体分离及其培养都有好处，试管苗培养基也有重要影响。毛花猕猴桃和软枣猕猴桃试管苗合适培养基分别为MS基本培养基（大量元素减半）和MS+0.00025 mg/L CPPU+ 0.1 mg/LIAA。在此条件下培养的两个种的试管苗叶片，经酶解后原生质体产量分别为0.7-1.8×l06和3.0-3.5×l06/1 g FW，其原生质体在合适培养基上能够分裂。 毛花猕猴桃原生质体培养在MS培养基（去除NH4N03）附加l.0mg/L2，4-D液体培养基中，约10天时发生第一次分裂，分裂能持续下去并在培养3个月时形成约2mm大小愈伤组织。直接将其转入固体培养基中使其增殖和分化。在附加Zea 0.5 mg/L+ O.l mg/L IAA的MS培养基上继代2次，愈伤组织开始分化芽。芽伸长后切下诱导生根，形成完整植株。软枣猕猴桃原生质体培养基中，MS培养基附加2，4-D配合Zea或Kin对启动分裂是必须的，其中以MS＋2，4-D 0.5 mg/L+ Zea 0.5 mg/L最好，在此培养基上原生质体第一次分裂发生在4-6天时，培养12-14天时见到第三次分裂，培养三周的分裂频率为23%。培养45天后形成许多小愈伤组织块。软枣猕猴桃原生质体再生的愈伤组织从液体培养基转入固体培养基后未见进一步分裂。 对18株毛花猕猴桃原生质体再生植株的体细胞染色体数目作了观察，其中12株为整倍体，二倍体和四倍体各六株;另外六株为混倍体，其染色体数目变化在59-203之间。还发现原生质体再生植株有丝分裂间期细胞存在多核现象，有多核细胞的共10株，细胞内多核数目以双核和三核较常见，最多的有七个核。原生质体供体植株为2n=2x=58，未发现多核细胞。原生质体再生植株体细胞多核现象未见报道。 利用毛花猕猴桃或软枣猕猴桃叶片原生质体分别与愈伤组织来源的美味猕猴桃原生质体进行融合，融合方法为高Ca++高pH值PEG法。对Kao等(1975)报道的融合步骤作了修改。影响融合效率的因素主要有PEG种类、融合作用时间和融合液中DMSO浓度。最佳的融合条件为40%PEG (Sigma，MW3350)+10%DMSO，作用40 min。毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的融合频率分别可达14.5%和13.6%。异核体经培养可分裂并形成细胞团。