Produção in vitro, análise fitoquímica e avaliação da atividade antineoplásica de metabólitos de Hovenia dulcis Thunb. (Rhamnaceae) obtidos por diferentes estratégias biotecnológicas

Hovenia dulcis Thunberg, natural da Ásia Oriental, é cultivada no Brasil onde é conhecida como uva-do-japão. A espécie possui várias indicações na medicina popular e alguns estudos apontam o seu potencial antineoplásico, tripanocida e hepatoprotetor. Metabólitos secundários são substâncias não essenciais para a sobrevivência celular, mas que fornecem vantagens adaptativas aos vegetais, sendo atribuído, para algumas delas, atividades biológicas importantes. Substâncias de interesse medicinal têm sido obtidas por técnicas da cultura de tecidos vegetais, como a calogênese e a cultura de células em suspensão, que permitem a síntese de matéria-prima de forma contínua e homogênea, independentemente de fatores ambientais e sazonais. O presente estudo objetivou o estabelecimento de culturas in vitro de H. dulcis, visando à produção de metabólitos de interesse, com vistas à avaliação do seu potencial antineoplásico sobre células K562. Foram testados protocolos para o estabelecimento de diferentes sistemas, como culturas de calos, de células em suspensão (CCS) e compact callus clusters (CCC) e ainda a avaliação do uso de elicitores na otimização de metabólitos produzidos in vitro. Foi verificado que a adição dos fitorreguladores KIN e TDZ, substituindo o BAP, não foi capaz de induzir a formação de calos friáveis, bem como a manutenção das culturas em ausência de luz. O uso do nitrato de prata promoveu a friabilidade de calos em todas as concentrações testadas, considerando-se 2,0 mg.L-1 a melhor concentração. Foram alcançadas taxas de 100% de formação de CCS tanto na presença, quanto em ausência de AgNO3. O maior acúmulo de biomassa foi verificado na concentração mais baixa de PIC (0,625 mg.L-1). A análise dos espectros de RMN indicou a presença de (+)-dihidromiricetina, (+)-galocatequina, hovenitina II, hovenosideo G, hodulosideo III, hodulosideo IV, hodulosideo I e hovenidulciosideo B1 nas culturas de calos friáveis. No estabelecimento de culturas CCC, observou-se a formação de calos compactos verdes em todas as concentrações de ANA testadas. O aumento da velocidade de rotação para 135 rpm aumentou a dispersão das células com consequente formação dos agregados celulares desejados. A seleção de linhagens celulares demonstrou ser um método eficiente na uniformização do tamanho desses agregados e tal uniformidade se manteve estável por mais de cinco subcultivos em 100% das culturas. Uma fração rica em saponinas foi obtida a partir dos agregados celulares, correspondendo a 1,46% da massa seca. A análise por RMN sugeriu a presença das saponinas Hovenosideo G e dos hovenidulciosideos A2 e B2. O uso de elicitores em cultura de calos mostrou-se adequado à produção de metabólitos secundários, sem alterações morfológicas nos mesmos. A elicitação alterou o perfil cromatográfico analisado por HPLC. Na elicitação com 5,0 mg.L-1 de extrato de levedura foi verificado um aumento de quase três vezes (12,280 3,396 equivalentes de quercetina/mg de extrato) na síntese de flavonoides. Finalmente, os estudos de ação antitumoral in vitro demonstraram citotoxicidade dos extratos de calos não elicitados de H. dulcis sobre linhagem de leucemia mieloide crônica (IC50 de 74,05 μg.mL-1.) e inibição do crescimento de tais células (K562), sugerindo o potencial antineoplásico para um produto biotecnológio (calo) desta espécie.

Hovenia dulcis Thunberg, naturally occurring in East Asia, is cultivated in Brazil and known as uva-do-japão. In folk medicine, the species is used on the treatment of several diseases and some studies point to its activity as antineoplasic, tripanocidal and hepatoprotective agent. Compounds known as secondary metabolites are not essential to plant cell survival, but provide adaptative advantages and important biological activities are related to these compounds. Natural products have been obtained through tissue culture techniques, such as callus cultures and cell suspension cultures, which provide the continuous and homogenous production of raw materials, regardless of seasonal and environmental factors. The present work aimed the establishment of H. dulcis in vitro cultures on the purpose of secondary metabolites production, intending the evaluation of its antineoplasic potential on K562 cells. Protocols to establish different systems such as callus cultures, cell suspension cultures (CSC) and compact callus clusters (CCC) were tested and the use of elicitors on the improvement of metabolites production was also evaluated. The addition of KIN and TDZ in replacement of BAP was not suitable to produce friable calli, and the same was observed for dark conditions. The addition of silver nitrate promoted callus friability in all tested concentrations and 2.0 mg.L-1 was considered the best condition. Rates of 100% were obtained on CSC formation with or without the AgNO3. Highest biomass production was observed on the lowest PIC concentration tested (0.625 mg.L-1). NMR spectral analysis suggested the presence of (+)-dihydromirycetin, (+)-gallocatechin, hovenitin II, hovenoside G, hoduloside III, hoduloside IV, hoduloside I and hovenidulcioside B1 in friable callus., All NAA tested concentrations induced green compact callus formation on CCC cultures. The elevation of rotation speed to 135 rpm increased cell dispersion with formation of the desired cell clusters. Cell line selection proved to be a suitable method for clusters size homogeneity, which was maintained over five subcultures in 100% of the cultures. A saponin rich fraction was obtained from the cell clusters, corresponding to 1.4% of dry mass. NMR spectral analysis suggested the presence of Hovenoside G and hovenidulciosides A2 and B2 as saponins. Elicitation was considered and efficient approach to secondary metabolites production having no effect on callus morphology. The elicitors were capable of altering chromatographic profiles obtained on HPLC. The use of 5.0 mg.L-1 of yeast extract as elicitor increased the total flavonoid production almost 3 folds (12.280 3.396 quercetin equivalents/mg of extract). Finally, the in vitro antitumoral studies showed cytotoxicity of H. dulcis callus extract on chronic myeloid leukemia cell line (IC50 of 74.05 μg.mL-1) and growth inhibition, suggesting the antineoplasic potential for a biotechnological product (callus) of this specie.