Decomposição de aminoácidos alifáticos por transferência de electrão em colisões átomo-molécula

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Flebotomíneos (Diptera, Psychodidae) de área de transmissão de leishmaniose tegumentar americana, no município de Itupeva, região sudeste do Estado de São Paulo, Brasil

O estudo da fauna flebotomínica em área de transmissão recente de leishmaniose tegumentar americana fornece subsídios para o controle da doença no Estado de São Paulo. Neste estudo, procurou-se caracterizar a distribuição sazonal, espacial e horária das espécies de flebotomíneos encontradas no município de Itupeva. As coletas foram realizadas quinzenalmente entre abril/94 e março/95. Dos 864 indivíduos coletados, 81,4% pertenceram a 4 espécies: Lutzomyia migonei (32,4%), L. whitmani (26,0%), L. intermedia (12,0%) e L. fischeri (10,9%). Estas espécies apresentaram maior densidade no período mais frio e seco do ano (abril a setembro/94) e maior atividade entre a segunda e a quinta hora após o crepúsculo vespertino. L. migonei predominou em praticamente todos os ambientes investigados, seguida por L. whitmani e L. longipalpis no ambiente domiciliar. Conclui-se que, juntamente com L. intermedia, espécie suspeita como provável vetora no Estado de São Paulo, L. migonei e L. whitmani podem estar desempenhando um importante papel na transmissão da leishmaniose tegumentar na área estudada.

Leishmaniose tegumentar americana: flebotomíneos de área de transmissão, no município de Pedro de Toledo, região sul do Estado de São Paulo, Brasil

Considerado como área endêmica de leishmaniose tegumentar americana (LTA), o Vale do Ribeira, na região sul do Estado de São Paulo, teve 929 casos notificados nos últimos 15 anos. Com o objetivo de identificar a fauna flebotomínea, foram realizadas capturas quinzenais em área rural do município de Pedro de Toledo, durante um ano, a partir de maio de 1994. Foram utilizadas armadilhas de Shannon no peridomicílio e armadilhas luminosas, tipo CDC, nos ambientes: domiciliar (intra e peri) e florestal (margem e interior), instaladas a partir do crepúsculo vespertino. Foram coletadas 8 espécies de flebotomíneos, totalizando 11.096 exemplares, sendo Lutzomyia intermedia a espécie dominante (96,4%). Esta espécie mostrou-se mais freqüente na primeira metade da noite, ocorrendo o ano inteiro, preferencialmente no ambiente domiciliar, o que indica sua preferência por ambiente antrópico. Os dados do presente trabalho ratificam L. intermedia como importante espécie vetora de LTA no Vale do Ribeira.

Desenvolvimento de métodos moleculares para a deteção de Trypanosoma spp em glossinas (Diptera: Glossinidae) da República da Guiné Bissau

As moscas do género Glossina são vetores de patologias provocadas por várias espécies de parasita do género Trypanosoma, como a Tripanossomose Humana Africana e as Tripanossomoses Animais. A correta identificação destes tripanossomas é um ponto fulcral quando se procura determinar o risco de doença que determinadas populações de glossinas podem provocar. No presente trabalho foram utilizadas e adaptadas diversas metodologias de diagnóstico molecular, nomeadamente o PCR em tempo real e o PCR-RFLP, que permitiram, através da utilização de primers genéricos, a determinação da carga parasitária e a correta identificação dos tripanossomas presentes no vetor. Os primers denominados Tryp18SF e Tryp18SR foram desenvolvidos especificamente para serem utilizados na identificação das espécies de tripanossoma utilizando PCR em tempo real com metodologia SYBR® Green I e PCR-RFLP. Os primers denominados Tryp18S2F, Tryp18S2R e sonda Tryp18S2P foram desenvolvidos para a quantificação dos parasitas presentes nas amostras utilizando PCR em tempo real com metodologia Taqman®. Foi estudada uma amostra de 762 glossinas provenientes do território da República da Guiné-Bissau, zona atualmente considerada como estando livre de Tripanossomose Humana Africana, mas onde não são realizadas atividades de recenseamento de casos desde o final da ocupação portuguesa. Das 762 glossinas utilizadas, 241 estavam infetadas com tripanossomas, o que representa uma percentagem de infeção geral de 31,6 %. Destas glossinas, 28.63 % encontravam-se infetadas com Trypanosoma grayi, 14.11 % com Trypanosoma congolense, 7.05 % com Trypanosoma vivax e 0.83 % com Trypanosoma brucei brucei, tendo as infeções mistas representado 1.66 %. Não foi possível a identificação conclusiva ao nível da espécie em 48.13 % das amostras positivas, tendo estas ficado consideradas como Trypanosoma spp. Não foram identificados vetores infetados com tripanossomas responsáveis pelas patologias humanas. A utilização de primers genéricos para a identificação permitiu obviar o número de reações necessárias para identificar corretamente o parasita responsável pela infeção, e este trabalho é de resto a primeira descrição da utilização de primers genéricos que permitam a identificação de Trypanosoma grayi. Esta é também a primeira descrição da utilização de PCR em tempo real com metodologia Taqman® para quantificação de tripanossomas, e a sua utilização com primers genéricos aumenta a aplicabilidade em estudos epidemiológicos de grande escala. Palavras-chave: PCR em tempo real; PCR-RFLP; República da Guiné-Bissau; Glossina; Trypanosoma; Tripanossomose.

Contribuição para o conhecimento da Leptospirose humana na região do Lobito (Angola): aplicação de métodos de diagnóstico serológico e molecular

A Leptospirose é um problema emergente na Saúde Pública, devido às suas proporções epidemiológicas e pelo aumento da incidência da doença em países industrializados e em desenvolvimento (Meites et al., 2004). A doença tem uma ampla distribuição geográfica e ocorre com maior frequência nas zonas tropicais, subtropicais e temperadas (Vijayachari et al., 2008). Contudo, em algumas regiões desconhece-se a verdadeira prevalência, sendo reportada através de surtos esporádicos (Pappas et al., 2007). As manifestações clínicas inespecíficas da infecção podem ser subdiagnosticadas nas regiões tropicais, onde as doenças febris são comuns e onde podem ser confundidas com doenças mais conhecidas como a Malária, Hepatite Viral, Dengue e outras. Em Angola, o diagnóstico é realizado apenas através da história do paciente e suspeita clínica, dando origem a diagnósticos pouco precisos. Deste modo, é importante o uso de métodos laboratoriais, especialmente testes serológicos específicos, para a confirmação do diagnóstico clínico (Levett, 2001). O objectivo principal deste estudo foi investigar a ocorrência de Leptospirose humana em Lobito (Província de Benguela) e identificar os serovares circulantes de Leptospira interrogans sensu lato (s.l.), utilizando técnicas serológicas e moleculares. Entre Abril e Junho de 2011, após o necessário consentimento informado, fez-se um inquérito clínico-epidemiológico a 141 pacientes (64 homens e 77 mulheres) assistidos no Hospital Geral do Lobito, por cefaleias e febre com diagnóstico desconhecido, dos quais se colheram 141 amostras séricas e 36 amostras de urina. A avaliação serológica foi inicialmente feita no laboratório local através da Técnica de Aglutinação Macroscópica sobre Lâmina (MACROLepto) – teste de rastreio - e, posteriormente confirmada pela Técnica de Aglutinação Microscópica (TAM) - teste de referência - realizado no Laboratório de Leptospirose (IHMT, em Lisboa). Para a detecção de DNA de Leptospira utilizou-se a Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR) com primers baseados no gene hap 1. Procedeu-se ainda à sequenciação dos produtos da PCR. As principais manifestações clínicas foram: cefaleias (73,8%), febre (65,2%), mialgias (41,1%) e náuseas (33,3%). Dos dados epidemiológicos observou-se que 131 dos pacientes tiveram contacto com os principais reservatórios de leptospiras, os roedores, e 76 ingeriram água não potável. Os resultados serológicos revelaram no teste MACROLepto: 14 (10%) amostras positivas e 18 (13%) não-conclusivas, sendo os serogrupos Icterohaemorrhagiae (Copenhageni), Australis (Bratislava) e Sejroe os mais comuns. Destas amostras, cinco, foram confirmadas pela TAM (presença de aglutininas anti – L. interrogans s.l.). Paralelamente, o DNA de Leptospira foi detectado em 13+/81 (16%) das amostras séricas e numa amostra de urina. A sequenciação identificou os serovares Copenhageni e Lai, ambos pertencentes ao serogrupo Icterohaemorrhagiae da espécie genómica L. interrogans. Os resultados obtidos mostraram que a maioria dos pacientes, mesmo aqueles que praticavam actividades de menor risco epidemiológico, tiveram contacto com roedores e com águas não potáveis. O estudo também provou que a Leptospirose afectou sobretudo as mulheres adultas, admitindo-se que este achado possa ser comum noutras regiões do País. Por último, ficou demonstrada a existência de Leptospirose na região, o que poderá contribuir para a inclusão da doença na lista de doenças febris em Angola e noutros países tropicais.

Flebótomos (Diptera, Phlebotominae) da Ilha de São Luis, zona do Golfão Maranhense, Brasil

Apresenta-se uma lista de flebotomíneos com 32 espécies, sendo 1 Brumptomyia e 31 Lutzomyia, distribuídas nos subgêneros Psychodopygus (6), Nyssomyia (5), Pressatia (3), Evandromyia (2), Psathyromyia (2), Sciopemyia (2), Lutzomyia (1), Micropygomyia (1), Viannamyia (1), e nos grupos Oswaldoi (5) e Migonei (3). Os flebotomíneos foram capturados na mata, peridomicílio (chiqueiro, galinheiro e estábulo) e intradomicílio (dormitório), das 18 às 6 horas, uma vez por mês, durante 4 anos na Ilha de São Luis, Maranhão. Todas as espécies ocorreram na mata, sendo que 16 também foram encontradas no peri e 11 dentro dos domicílios. Foram capturados 22.581 espécimens, sendo que 65,1% ocorreram no peridomicílio, 17,5% na mata e 17,4% no intradomicílio. A espécie mais comum foi Lutzomyia longipalpis com 66,4% dos exemplares capturados, seguida por L. whitmani (24%) e L. evandroi (5,9%). As 29 espécies restantes representaram apenas 3,7% da amostra total.

Mastodonte em depósitos marinhos da Praia do Penedo (Portugal)

O achado de um dente de mastodonte, cf. Tetralophodon longirostris, em depósitos marinhos expostos na praia de Penedo Norte, na Península de Setúbal, permitiu datação rigorosa. Provém da camada 8 do corte, parte basal da sequência deposicional T1; data do início do Tortoniano, ca. de 11.6 Ma, com base em foraminíferos planctónicos (zona N14) e em 87Sr/86Sr e K/Ar. O dente de mastodonte parece pertencer a Tetralophodon longirostris, espécie conhecida em Portugal em depósitos continentais da primeira parte do Miocénico superior.

O papel de determinantes plasmídicos na resistência a compostos antimicrobianos em Staphylococcus aureus

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia médica

Resistência a insecticidas em Anopheles gambiae s.l. na Região de Luanda, Angola

Em Angola, a malária é a principal causa de morbilidade e de mortalidade infantil. O controlo de vectores com recurso aos insecticidas representa uma parte importante da estratégia actual para a prevenção da doença. Em Anopheles gambiae s.s., principal vector de malária em África, estão identificadas duas mutações pontuais no gene que codifica os canais de sódio das membranas das células do sistema nervoso, conferindo resistência knockdown (kdr) aos insecticidas piretróides e ao DDT. Também se encontra descrita para esta espécie uma mutação no gene acetilcolinesterase-1 (ace-1), associada à resistência a carbamatos e organofosfatos. Este trabalho teve como principal objectivo avaliar o nível de resistência aos insecticidas em An. gambiae da província de Luanda, Angola e determinar a frequência destas mutações. Foram realizadas colheitas entomológicas em 2009 e 2010, através da prospeção de criadouros larvares. Os insectos capturados foram criados até a emergência do adulto e sujeitos a ensaios de susceptibilidade a insecticidas, através de testes da OMS. A identificação de espécies e formas moleculares do complexo An. gambiae, bem como a pesquisa de mutações no gene ace-1 foram feitas por PCR-RFLP. A pesquisa de mutações no gene kdr foi realizada por PIRA-PCR. Amostras selecionadas de mosquitos (incluindo uma amostra proveniente de uma colheita de adultos) foram ainda genotipadas para 11 loci microssatélites. Os níveis de resistência para a permetrina, DDT e -cialotrina foram elevados, com taxas de mortalidade inferiores a 70% em ambos os anos. Em contraste, as taxas de mortalidade foram sempre acima de 98% para bendiocarb e fenitrotião, indicadoras de susceptibilidade a estes insecticidas. Todas as amostras processadas foram identificadas como An. gambiae s.s., forma molecular M e não se observou a mutação no gene ace-1 associada à resistência. Em ambos os anos, foi detectada apenas a mutação L1014F no locus kdr e a frequência do alelo mutante (TTT) foi bastante elevada. Em 2009, observou-se uma associação entre genótipos homozigóticos para o alelo 1014F e o fenótipo resistente, para os insecticidas piretróides e para o DDT. O polimorfismo dos loci microssatélites analisados foi elevado, com a riqueza alélica a variar entre 5 (45C1) e 20 (H128) e a heterozigotia esperada entre 0,529 (H577) e 0,862 (H249). A análise genética não revelou um grau de parentesco entre os indivíduos que constituíram as amostras estudadas. Este resultado sugere que os elevados níveis de resistência observados não foram influenciados pelo método de colheita de mosquitos que, em certas condições, poderia contribuir para a amostragem de indivíduos aparentados.

Contribuição para o conhecimento da Leptospirose Humana na Região do Lobito (Angola)

A Leptospirose é um problema emergente na Saúde Pública, devido às suas proporções epidemiológicas e pelo aumento da incidência da doença em países industrializados e em desenvolvimento (Meites et al., 2004). A doença tem uma ampla distribuição geográfica e ocorre com maior frequência nas zonas tropicais, subtropicais e temperadas (Vijayachari et al., 2008). Contudo, em algumas regiões desconhece-se a verdadeira prevalência, sendo reportada através de surtos esporádicos (Pappas et al., 2007). As manifestações clínicas inespecíficas da infecção podem ser subdiagnosticadas nas regiões tropicais, onde as doenças febris são comuns e onde podem ser confundidas com doenças mais conhecidas como a Malária, Hepatite Viral, Dengue e outras. Em Angola, o diagnóstico é realizado apenas através da história do paciente e suspeita clínica, dando origem a diagnósticos pouco precisos. Deste modo, é importante o uso de métodos laboratoriais, especialmente testes serológicos específicos, para a confirmação do diagnóstico clínico (Levett, 2001). O objectivo principal deste estudo foi investigar a ocorrência de Leptospirose humana em Lobito (Província de Benguela) e identificar os serovares circulantes de Leptospira interrogans sensu lato (s.l.), utilizando técnicas serológicas e moleculares. Entre Abril e Junho de 2011, após o necessário consentimento informado, fez-se um inquérito clínico-epidemiológico a 141 pacientes (64 homens e 77 mulheres) assistidos no Hospital Geral do Lobito, por cefaleias e febre com diagnóstico desconhecido, dos quais se colheram 141 amostras séricas e 36 amostras de urina. A avaliação serológica foi inicialmente feita no laboratório local através da Técnica de Aglutinação Macroscópica sobre Lâmina (MACROLepto) – teste de rastreio - e, posteriormente confirmada pela Técnica de Aglutinação Microscópica (TAM) - teste de referência - realizado no Laboratório de Leptospirose (IHMT, em Lisboa). Para a detecção de DNA de Leptospira utilizou-se a Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR) com primers baseados no gene hap 1. Procedeu-se ainda à sequenciação dos produtos da PCR. As principais manifestações clínicas foram: cefaleias (73,8%), febre (65,2%), mialgias (41,1%) e náuseas (33,3%). Dos dados epidemiológicos observou-se que 131 dos pacientes tiveram contacto com os principais reservatórios de leptospiras, os roedores, e 76 ingeriram água não potável. Os resultados serológicos revelaram no teste MACROLepto: 14 (10%) amostras positivas e 18 (13%) não-conclusivas, sendo os serogrupos Icterohaemorrhagiae (Copenhageni), Australis (Bratislava) e Sejroe os mais comuns. Destas amostras, cinco, foram confirmadas pela TAM (presença de aglutininas anti – L. interrogans s.l.). Paralelamente, o DNA de Leptospira foi detectado em 13+/81 (16%) das amostras séricas e numa amostra de urina. A sequenciação identificou os serovares Copenhageni e Lai, ambos pertencentes ao serogrupo Icterohaemorrhagiae da espécie genómica L. interrogans. Os resultados obtidos mostraram que a maioria dos pacientes, mesmo aqueles que praticavam actividades de menor risco epidemiológico, tiveram contacto com roedores e com águas não potáveis. O estudo também provou que a Leptospirose afectou sobretudo as mulheres adultas, admitindo-se que este achado possa ser comum noutras regiões do País. Por último, ficou demonstrada a existência de Leptospirose na região, o que poderá contribuir para a inclusão da doença na lista de doenças febris em Angola e noutros países tropicais.