Biological and physicochemical stability of ceftazidime and aminophylline on glucose parenteral solution

Ceftazidime is a broad spectrum antibiotic administered mainly by the parenteral route, and it is especially effective against Pseudomonas aeruginosa. The period of time in which serum levels exceed the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) is an important pharmacodynamic parameter for its efficacy. One of the forms to extend this period is to administer the antibiotic by continuous infusion, after prior dilution in a Parenteral Solution (PS). The present work assessed the stability of ceftazidime in 5% glucose PS for 24 hours, combined or not with aminophylline, through High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The physicochemical evaluation was accompanied by in vitro antimicrobial activity compared MIC test in the 24-hour period. Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa were the microorganisms chosen for the MIC comparison. The HPLC analysis confirmed ceftazidime and aminophylline individual stability on PS, while the MIC values were slightly higher than the mean described in the literature. When both drugs were associated in the same PS, the ceftazidime concentration by HPLC decreased 25% after 24 hours. Not only did the MIC values show high loss of antibiotic activity within the same period, but also altered MIC values immediately after the preparation, which was not detected by HPLC. Our results indicate that this drug combination is not compatible, even if used right away, and that PS might not be the best vehicle for ceftazidime, emphasizing the importance of the MIC evaluation for drug interactions.

Desarrollo de un sisetma biosensor opto-mecánico basado en cantilevers

Programa de doctorado: Ingeniería de Telecomunicación Avanzada

Assembly and characterization of supramolecular architectures for biosensor applications

The research has included the efforts in designing, assembling and structurally and functionally characterizing supramolecular biofunctional architectures for optical biosensing applications. In the first part of the study, a class of interfaces based on the biotin-NeutrAvidin binding matrix for the quantitative control of enzyme surface coverage and activity was developed. Genetically modified ß-lactamase was chosen as a model enzyme and attached to five different types of NeutrAvidin-functionalized chip surfaces through a biotinylated spacer. All matrices are suitable for achieving a controlled enzyme surface density. Data obtained by SPR are in excellent agreement with those derived from optical waveguide measurements. Among the various protein-binding strategies investigated in this study, it was found that stiffness and order between alkanethiol-based SAMs and PEGylated surfaces are very important. Matrix D based on a Nb2O5 coating showed a satisfactory regeneration possibility. The surface-immobilized enzymes were found to be stable and sufficiently active enough for a catalytic activity assay. Many factors, such as the steric crowding effect of surface-attached enzymes, the electrostatic interaction between the negatively charged substrate (Nitrocefin) and the polycationic PLL-g-PEG/PEG-Biotin polymer, mass transport effect, and enzyme orientation, are shown to influence the kinetic parameters of catalytic analysis. Furthermore, a home-built Surface Plasmon Resonance Spectrometer of SPR and a commercial miniature Fiber Optic Absorbance Spectrometer (FOAS), served as a combination set-up for affinity and catalytic biosensor, respectively. The parallel measurements offer the opportunity of on-line activity detection of surface attached enzymes. The immobilized enzyme does not have to be in contact with the catalytic biosensor. The SPR chip can easily be cleaned and used for recycling. Additionally, with regard to the application of FOAS, the integrated SPR technique allows for the quantitative control of the surface density of the enzyme, which is highly relevant for the enzymatic activity. Finally, the miniaturized portable FOAS devices can easily be combined as an add-on device with many other in situ interfacial detection techniques, such as optical waveguide lightmode spectroscopy (OWLS), the quartz crystal microbalance (QCM) measurements, or impedance spectroscopy (IS). Surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) allows for an absolute determination of intrinsic rate constants describing the true parameters that control interfacial hybridization. Thus it also allows for a study of the difference of the surface coupling influences between OMCVD gold particles and planar metal films presented in the second part. The multilayer growth process was found to proceed similarly to the way it occurs on planar metal substrates. In contrast to planar bulk metal surfaces, metal colloids exhibit a narrow UV-vis absorption band. This absorption band is observed if the incident photon frequency is resonant with the collective oscillation of the conduction electrons and is known as the localized surface plasmon resonance (LSPR). LSPR excitation results in extremely large molar extinction coefficients, which are due to a combination of both absorption and scattering. When considering metal-enhanced fluorescence we expect the absorption to cause quenching and the scattering to cause enhancement. Our further study will focus on the developing of a detection platform with larger gold particles, which will display a dominant scattering component and enhance the fluorescence signal. Furthermore, the results of sequence-specific detection of DNA hybridization based on OMCVD gold particles provide an excellent application potential for this kind of cheap, simple, and mild preparation protocol applied in this gold fabrication method. In the final chapter, SPFS was used for the in-depth characterizations of the conformational changes of commercial carboxymethyl dextran (CMD) substrate induced by pH and ionic strength variations were studied using surface plasmon resonance spectroscopy. The pH response of CMD is due to the changes in the electrostatics of the system between its protonated and deprotonated forms, while the ionic strength response is attributed from the charge screening effect of the cations that shield the charge of the carboxyl groups and prevent an efficient electrostatic repulsion. Additional studies were performed using SPFS with the aim of fluorophore labeling the carboxymethyl groups. CMD matrices showed typical pH and ionic strength responses, such as high pH and low ionic strength swelling. Furthermore, the effects of the surface charge and the crosslink density of the CMD matrix on the extent of stimuli responses were investigated. The swelling/collapse ratio decreased with decreasing surface concentration of the carboxyl groups and increasing crosslink density. The study of the CMD responses to external and internal variables will provide valuable background information for practical applications.

Synthese, Radioiodierung und Evaluierung von neuen MGMT-Inhibitoren und ihren Glucose-Konjugaten

Eine häufige Art der Chemotherapie ist die Behandlung von Tumoren mit alkylierenden oder chloralkylierenden Zytostatika, die eine Alkylierung von Guanin in der DNA verursachen. Daraus resultieren eine Blockierung der DNA-Synthese und ein Rückgang im Tumorwachstum. Das Enzym O6-Methylguanin-DNA-methyltransferase (MGMT) ist in der Lage, solche Schäden zu reparieren. Da MGMT auch in verschiedenen Tumorarten exprimiert wird, eine Tatsache, die therapeutische Effekte verringern könnte, wird zur Zeit die Gabe von Inhibitoren der MGMT, wie O6-Benzylguanin, vor der eigentlichen Chemotherapie untersucht. Um möglicher Weise die Selektivität dieser Verbindungen für Tumor- vs. gesundem Gewebe und auch die in vivo-Eigenschaften zu verbessern, wurden glycosylierte Inhibitoren vorgeschlagen. Für eine Entwicklung neuer MGMT-Inhibitoren wäre es hilfreich, die in vivo Bioverteilung in Tier und Mensch durch eine Markierung mit geeigneten Isotopen verfolgen zu können. Im Moment existiert keine Möglichkeit, den MGMT-Status eines Tumors nicht-invasiv zu visualisieren. Diese Information kann sehr wichtig für die Planung einer Chemotherapie mit alkylierenden oder chloralkylierenden Zytostatika sein. Mit Methoden wie der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder der Einzel-Photonen-Emissions-Tomographie (SPECT) ist eine nicht-invasive Quantifizierung von biochemischen Prozessen prinzipiell möglich. Hierfür wurden verschiedenen MGMT-Inhibitoren bereits mit Isotopen wie Fluor-18, Kohlenstoff-11 un Iod-131 markiert, aber sie waren aus unterschiedlichen Gründen nicht geeignet. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von neuen O6-derivatisierten Guaninen, die über einen C8-Spacer an der N9-Position des Guanins mit einer Glucose-Einheit konjugiert werden sollten, geeigneten Markierungsvorläufern und Radioiodierungs-Methoden. Durch Wahl eines geeigneten Radioiodisotops für die Markierung des Restes an der O6-Position des Guanins kann die ex vivo-Bioverteilung dieser Verbindungen in tumortragenden Nacktmäusen (Iod-131) und die Untersuchung der in vivo-Verteilung (Iod-123) durchgeführt werden. Daher wurden O6-(5-Iodothenyl)- (ITG) und O6-(3-Iodbenzyl)guanin-Derivate (IBG) sowie ihre Glucose-Konjugate ITGG und IBGG synthetisiert. Von diesen inaktiven Standard-Verbindungen wurden die IC50-Werte zur MGMT bestimmt. Da sie alle im nM-Bereich lagen, schienen die Verbindungen für weitere Untersuchungen geeignet zu sein. Die Radiomarkierung der Inhibitoren mit Iod-131 bzw. Iod-123 wurde durch Umsetzung der Trialkyl-stannylierten Markierungsvorläufer mit der Chloramin T-Methode in mittleren (Iod-123) bis hohen (Iod-131) radiochemischen Ausbeuten und mit hohen radiochemischen Reinheiten durchgeführt. Mit den 131I-iodierten Verbindungen wurde die spezifische Bindung zur MGMT nachgewiesen, eine Eigenschaft, die essentiell für eine weitere Verwendung dieser Derivate ist. Sie wurden auch zur Bestimmung der ex vivo-Tumor- und Organverteilung in tumortragenden Nacktmäusen (MEX(+), MEX(-), Glioblastom) verwendet. In allen Fällen war die Tumoraufnahme der nicht-konjugierten Guanin-Derivate höher als die der entsprechenden Glucose-Konjugate. Das Tumor-Blut-Verhältnis, das sehr wichtig für einen potentiellen Einsatz der Verbindungen als Tracer des MGMT-Status eines Tumors ist, variierte abhängig von der Kinetik. Zu allen Zeitpunkten war die in vivo-Deiodierung der Glucose-Konjugate deutlich geringer als die von ITG oder IBG. Unter Verwendung von [131I]IBG und [131I]IBGG wurde die Biodistribution nach Inhibition der Natrium-abhängigen Glucose-Transporter, die zumindests teilweise für die Aufnahme der MGMT-Inhibitoren in Zellen verantwortlich sind, durch Phloretin untersucht. Einen Unterschied in der Tumoraufnahme zwischen den mit Phloretin behandelten und den unbehandelten Mäusen konnte nicht beobachtet werden, wahrscheinlich weil die Akkumulation im Tumor generell niedrig war. Mit den 123I-iodierten Verbindungen [123I]IBG und [123I]IBGG wurden in vivo-Scans an tumortragenden Nacktmäusen (MEX(+), MEX(-)) mit einer Kleintier-SPECT-Kamera durchgeführt. In beiden Fällen wurde eine geringe Akkumulation in den Tumoren im Vergleich zu anderen Organen beobachtet, was die ex vivo-Biodistributionsdaten bestätigte.

Selektiv deblockierbare 2,6-Diamino-2,6-didesoxy-D-glucose-Scaffolds für die kombinatorische Synthese potentieller RNA-Liganden

Aminoglydosid-Antibiotika wie Neomycin B oder Cyclopeptid-Antibiotike wie Viaomycin sind dafür bekannt, daß sie selektiv an RNA binden können. Diese Interaktionen beruhen sowohl auf elektrostatischen Wechselwirkungen als auch auf H-Brücken-Bindungen. Des weiteren ist die definierte räumliche Anordnung von Donor- und Akzeptor-Resten in den Strukturen der RNA-Liganden wichtig für die Affinität. Eine Möglichkeit natürliche RNA-Liganden zu imitieren ist der Einsatz polyfunktioneller Template wie zum Beispiel das 2,6-Diamino-2,6-didesoxy-D-glucose-Scaffold. Mit Hilfe dieser Scaffolds können dann verschiedene positv geladene Reste und Donatoren sowie Akzeptoren für H-Brücken-Bindungen oder auch Interkalatoren räumlich definiert präsentiert werden. Für die unabhängige Funktionalisierung einer jeden Position ist ein Satz orthogonal stabiler Schutzgruppen nötig, wobei eine Hydroxylguppe durch einen Anker ersetzt wird, der eine Anbindung des Scaffolds an einen polymeren Träger ermöglicht. Das neu entwickelte 2,6-Diamino-2,6-didesoxy-D-glucose-Scaffold ist das erste Monosaccharid-Templat, das in allen fünf Positionen mit orthogonal stabilen Schutzgruppen blockiert ist. Alle Positionen könne in beliebiger Reihenfolge selektiv deblockiert und anschließend derivatisiert werden. Das Scaffold kann mit Aminosäuren, Guanidinen oder Interkalatoren umgesetzt werden, um so natürlich vorkommende RNA-bindende Aminoglycoside oder Peptide zu imitieren. Aufbauend auf diesem Monosaccharid-Templat wurde eine Bibliothek von über 100 potentiellen RNA-Liganden synthetisiert, die im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 579 (RNA-Liganden-Wechselwirkungen) in Zellassays auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Tat/TAR-Wechselwirkung untersucht wurden, wobei bis jetzt 9 Verbindungen mit einer hemmenden Wirkung im micromolaren Bereich gefunden wurden.

Neurons derived from P19 embryonic carcinoma cells as a platform for biosensor applications - optimisation and characterisation

P19 is a mouse-derived embryonal carcinoma cell line capable of differentiation toward ectodermal, mesodermal and endodermal lineages and could thus be differentiated into neurons. Different culture conditions were tested to optimise and increase the efficiency of neuronal differentiation since the population of P19-derived neurons was reported to be heterogeneous with respect to the morphology and neurotransmitters they synthesise. P19-derived neurons were cultured on microelectrode arrays as cell aggregates and as dissociated cells. Improved neuronal maturation was shown by the presence of microtubule associated protein 2, neurofilament and synaptophysin formation when initiation of neuronal differentiation was prolonged. High initial cell density cultures and coating of surfaces with polyethylenimine-laminin further improved neuronal maturation of differentiated P19 cells. Increased spontaneous activities of the P19-derived neurons were correspondingly recorded. Two to three hours recordings were performed between 17 and 25 days when extracellular signals were stabilised. It was found that P19-derived neurons developed network properties as partially synchronised network activities. P19-derived neurons appeared to give inhomogenous response to the 2 major neurotransmitters, -aminobutyric acid (GABA) and glutamate. The P19-derived neuronal networks obtained from optimised protocol in this thesis were predominantly GABAergic. The reproducible long term extracellular recordings performed showed that neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells could be applied as a model for cell based biosensor in corporation with microelectrode arrays.