Protein-Disassembly im Verlauf der endosomalen Prozessierung

Die Prozessierung von internalisierten Proteinantigenen und die Beladung von MHC Klasse II – Heterodimeren mit den prozessierten Proteinfragmenten in Antigen präsentierenden Zellen sind Schlüsselprozesse der antigenspezifischen Immunantwort. In dieser Arbeit wurden grundlegende Studien durchgeführt, um die Antigenprozessierung in Makrophagen und dendritischen Zellen auf molekularer Ebene zu untersuchen. Als Sonde für die Antigenprozessierung wurde das Modellprotein Ovalbumin verwendet. Dieses wurde hoch gereinigt und mit einem Fluoreszenzmarker versehen. In Kinetikexperimenten wurde gezeigt, dass unabhängig vom Aktivierungszustand der akzessorischen Zellen ein Großteil des intakten Ovalbumins in den Zellen persistiert. Der Abbau des Proteins beginnt in den späten Endosomen und führt zu einem distinkten 40kD Abbaufragment. Der weitere schrittweise Abbau des Proteins findet in den Lysosomen statt. Die Edmann – Sequenzierung des Fragmentes ergab, dass die initiale Spaltung des Ovalbumin in einem zweistufigen Prozess abläuft. Beide Prozessierungsschritte erfolgen schnell aufeinander. Der erste Abbauschritt generiert das dominante Ovalbumin – Epitop OVA323-339.LPS – Stimulation der KMMÆ hatte zur Folge, dass die gleichen in nicht stimulierten Zellen beobachteten Fragmente gebildet wurden, jedoch zu einem erheblich späteren Zeitpunkt. In Gegenwart der Proteinase – Inhibitoren Leupeptin und Pepstatin A war diese verzögerte Degradierung nicht zu beobachten. LPS induziert vermutlich weitere Enzyme, die an der Prozessierung von Ovalbumin beteiligte Proteinasen beeinträchtigen. Eine vollständige Hemmung des Abbaus konnte jedoch nicht erreicht werden.Mit Molecular Modelling –Studien wurde ein Molekülmodell des Ratten MHC Klasse II – Moleküls RT1.Bl entwickelt und dessen Bindungsspezifität untersucht. Wesentliche Eigenschaften der RT1.Bl – Peptid Interaktionen wurden ermittelt. Auf der Grundlage der berechneten Molekülmodelle wurde ein Wirkmechanismus für die durch DM-Moleküle katalysierte Peptidbeladung von RT1.Bl postuliert. Bei einer Kooperativität der Wasserstoffbrücken – Bindungen genügt die Lösung einer einzigen Wasserstoffbrücke zwischen Peptid und MHC Klasse II – Molekül, um die Dissoziation von schwach gebundenen Peptiden erheblich zu beschleunigen. Hochaffine Binder werden hierdurch jedoch nicht beeinflusst.

Synthesen und Charakterisierungen Arylamin-haltiger Polymere: multifunktionelle hoch-T g-Copolymere für photorefraktive Anwendungen

Zusammenfassung Die vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit den Synthesen und Charakterisierungen multifunktioneller, Arylamin-haltiger Polymere, welche sich als photorefraktive(PR)-Materialien eignen. Die Glastemperaturen (Tg) der angestrebten Materialien liegen deutlich über Raumtemperatur, um so den Pockels-Mechanismus zum Aufbau des PR-Effektes zu favorisieren. Hierzu sind zwei synthetische Konzepte, basierend auf Maleinimid-Methylvinylisocyanat-Reaktiv-Polymeren und Triphenylamin-haltigen Polymeren, entwickelt worden. Im Rahmen des Reaktiv-Polymer-Konzeptes konnten PR-Materialien mit den bisher größten Beugungs-Effizienzen sowie den schnellsten Ansprechzeiten für multifunktionelle hoch-Tg-Polymere dargestellt werden. Hierfür wurden Maleinimid-Methylvinylisocyanat-Reaktiv-Polymere synthetisiert welche an der Imid-Position über Spacer-Gruppen mit Carbazol-Einheiten funktionalisiert sind. Die Tg´s der Polymere konnten zwischen 60°C und 194°C eingestellt werden. Die Isocyanat-Gruppen wurden dann polymeranlog mit hydroxyalkyl-funktionalisierten Chromophoren umgesetzt. Die Kinetik des PR-Effektes dieser Materialien wird durch die Ladungsträger-Beweglichkeiten in den Proben bestimmt. Eine Steigerung der Farbstoff-Konzentrationen erhöht die PR-Leistungen der Materialien, behindert jedoch deren Kinetik.Das Triphenylamin-Polymer-Konzept verwendet Triphenylamine als Lochleiter. Hierfür wurden die radikalischen Polymerisations-Verhalten der Monomere p-Diphenylaminostyrol (DPAS) und erstmals p-Ditoluylaminostyrol (DTAS) untersucht. Die Monomere wurden durch spontane, freie und kontrollierte radikalische Verfahren polymerisiert. Mittels eines TEMPO-Derivates gelang der Aufbau von Block-Copolymeren. Poly-DPAS konnte, im Gegensatz zu Poly-DTAS, polymeranlog tricyanovinyliert werden. Dadurch lassen sich PDPAS-block-PTPAS-Copolymere selektiv im PDPAS-Block tricyanovinylieren. Diese Materialien weisen eine Tendenzen zur Mikro-Phasen-Separation auf.Die Strukturierung von PDPAS konnte durch Photo-Polymerisation mit einer Auflösung von wenigen mm demonstriert werden. Carbazol und Triphenylamin-haltige Materialien wurden mittels Cyclo-Voltametrie untersucht.

Physikalische Eigenschaften kolloidaler Festkörper

In dieser Arbeit wird das Phasenverhalten fluid-kristallin und kristallin-amorph, die elastischen Eigenschaften, das Nukleationsverhalten und das diffusive Verhalten ladungsstabilisierter Kolloide aus sphärischen Polystyrol- und Polytetrafluorethylenpartikeln in wässerigen Dispersionsmitteln bei sehr geringem Fremdionengehalt systematisch untersucht. Die dazugehörigen Messungen werden an einer neuartigen selbstkonstruierten Kombinationslichtstreuapparatur durchgeführt, die die Meßmethoden der dynamischen Lichtstreuung, statischen Lichtstreuung und Torsionsresonanzspektroskopie in sich vereint. Die drei Meßmethoden sind optimal auf die Untersuchung kolloidaler Festkörper abgestimmt. Das elastische Verhalten der Festkörper kann sehr gut durch die Elastizitätstheorie atomarer Kristallsysteme beschrieben werden, wenn ein Debye-Hückel-Potential im Sinne des Poisson-Boltzmann-Cell Modells als Wechselwirkungspotential verwendet wird. Die ermittelten Phasengrenzen fluid-kristallin stehen erstmalig in guter Übereinstimmung mit Ergebnissen aus molekulardynamischen Simulationen, wenn die in der Torsionsresonanzspektroskopie bestimmte Wechselwirkungsenergie zu Grunde gelegt wird. Neben der Gleichgewichtsstruktur sind Aussagen zur Verfestigungskinetik möglich. Das gefundene Nukleationserhalten kann gut durch die klassische Nukleationstheorie beschrieben werden, wenn bei niedriger Unterkühlung der Schmelze ein Untergrund heterogener Keimung berücksichtigt wird. PTFE-Partikel zeigen auch bei hohen Konzentrationen nur geringfügige Mehrfachstreuung. Durch ihren Einsatz ist erstmals eine systematische Untersuchung des Glasübergangs in hochgeladenen ladungsstabilisierten Systemen möglich. Ladungsstabilisierte Kolloide unterscheiden sich vor allem durch ihre extreme Kristallisationstendenz von früher untersuchten Hartkugelsystemen. Bei hohen Partikelkonzentrationen (Volumenbrüche größer 10 Prozent) kann ein glasartiger Festkörper identifiziert werden, dessen physikalisches Verhalten die Existenz eines Bernalglases nahe legt. Der Glasübergang ist im Vergleich mit den in anderen kolloidalen Systemen und atomaren Systemen beobachteten Übergängen von sehr unterschiedlichem Charakter. Im verwendeten PTFE-System ist auf Grund der langreichweitigen stark repulsiven Wechselwirkung kein direkter Zugang des Glaszustandes aus der übersättigten Schmelze möglich. Der amorphe Festkörper entsteht hier aus einer nanokristallinen Phase. Die Keimrate steigt im zugänglichen Meßbereich annähernd exponentiell mit der Partikelanzahldichte, so daß man feststellen kann, daß der Glaszustand nicht durch Unterdrückung der Nukleation, sondern durch eine Forcierung derselben erreicht wird.

Identifikation und Charakterisierung molekularer Komponenten des Verbindungsciliums der Photorezeptoren von Vertebraten

Photorezeptorzellen sind aus funktionell und morphologisch unterschiedlichen Kompartimenten aufgebaut: Einem lichtsensitiven Außensegment, das über ein nichtmotiles modifiziertes Cilium mit dem metabolisch aktiven Innensegment verbunden ist. Die Membranen des Außensegments werden kontinuierlich erneuert. Diese Prozesse erfordern die Translokation von Proteinen der Signaltransduktionskaskade vom Syntheseort im Innensegment in das Außensegment. Der intrazelluläre Transport der Proteine erfolgt durch das Verbindungscilium als einzige direkte cytoplasmatische Brücke zwischen den beiden Kompartimenten. Die Cytoskelettproteine des Verbindungsciliums sind maßgeblich an diesen Transportprozessen, sowie an der Ausbildung der Disk-Membranen und Funktion des Ciliums als Diffusionsbarriere beteiligt. Trotz dieser, für die Aufrechterhaltung der Photorezeptorzelle wichtigen Funktionen, sind bislang nur wenige molekulare Strukturkomponenten des Verbindungsciliums bekannt und funktionell charakterisiert. Um weitere Proteinkomponenten des Ciliums zu identifizieren, wurde eine biochemisch-molekularbiologische Strategie angewandt. Detergenzextrahierte Cilienapparate von Rinderphotorezeptorzellen wurden zur Immunisierung eines Kaninchens eingesetzt. Das affinitätsgereinigte Antiserum, mit Antikörpern gegen Epitope der unterschiedlichen Proteine des Verbindungsciliums, wurde anschließend zur Durchmusterung einer Rattenretina cDNA-Expressionsbank verwendet. Positive Klone wurden isoliert, sequenziert, und deren 3´- und 5´-terminale cDNA-Sequenzen in Datenbankrecherchen analysiert. Neben Klonen, die für Fragmente von bereits bekannten photorezeptorspezifischen Proteinen kodieren, Klonen mit Homologien zu EST´s, und Klonen ohne Homologien zu in Datenbanken enthaltenen Einträgen, wurden 8 cDNA-Klone isoliert, die für bisher unbekannte Cytoskelettproteine des Verbindungsciliums kodieren. Zwei dieser Proteine wurden näher charakterisiert: Das Mikrotubuli-Bindungsprotein EB2p und das Aktin-Bindungsprotein Flightless (Flip). Indirekte Immunofluoreszenzmarkierungen mit Antikörpern gegen EB1p, die mit EB2p kreuzreagieren, wurden EB-Proteine im Verbindungscilium und Basalkörper der Rezeptorzellen lokalisiert. Funktionell trägt Rn EB2p vermutlich zur Stabilisierung der axonemalen Mikrotubuli bei, und dürfte durch Interaktion mit cytoplasmatischem Dynein an retrograden Transportprozessen im Verbindungscilium beteiligt sein. Das Aktin-Bindungsprotein Flightless ist ein cytoplasmatisches Protein mit einer N-terminalen LRR-Domäne, die Protein-Protein- und Protein-Lipid-Interaktionen vermittelt. C-terminal weist Flip zwei Segmente mit Homologien zu Gelsolin auf. Indirekte Immunofluoreszenzmarkierungen und immuno-elektronenmikroskopische Analysen zeigen, daß Flip im Verbindungscilium in der subzellulären Domäne zwischen den axonemalen Mikrotubulipaarringen und der Plasmamembran lokalisiert ist. Im Außensegment der Photorezeptorzellen liegt Flip an den Disk-Membranen assoziiert vor. Flip verfügt vermutlich über zwei Funktion: Membran-assoziiert dürfte es Aktinfilamente an den Membranen der Außensegmente verankern. Im Verbindungscilium hingegen könnte es die ciliären Aktinfilamente modifizieren, die Transportwege für aktin-assoziierte Motorproteine sind. Flip und EB2p sind möglicherweise an den intrazellulären Transportprozessen durch das Verbindungscilium beteiligt.Die in der vorliegenden Arbeit angewandte Methode konnte erfolgreich zur Isolierung bislang unbekannter Proteine des Verbindungsciliums eingesetzt werden. Darüberhinaus wurde Flip auch in den ciliären Sinneszellen des Riechepithels und den mechanorezeptiven Haarzellen des Innenohrs identifiziert. Erkenntnisse über die molekulare Zusammensetzung des ciliären Cytoskeletts von Photorezeptorzellen können daher auch auf andere ciliäre Sinneszellen angewandt werden. Dies ermöglicht einen besseren Einblick in die allgemeine Funktion cilärer Cytoskelettstrukturen sensorischer Zellen.

Wilmstumor- und Metanephrogenese: differenzielle Genexpressionsanalysen und weitere Charakterisierung identifizierter Kandidatengene

In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Kandidatengene für den Wilmstumor (WT), eine Tumorerkrankung der Niere, identifiziert und charakterisiert. Da dieses frühkindliche Malignom aus einer inkorrekt ablaufenden Metanephrogenese resultiert, wurden die Genexpressionsmuster verschiedener humaner Wilmstumor- und Normalnierengewebe (adulte sowie fetale Niere) mit Hilfe der Technik des differential display verglichen und die als differenziell exprimiert identifizierten Gene kloniert und charakterisiert. Bei TM7SF1 handelt es sich um ein neues Gen, dessen Transkription im Zuge der Metanephrogenese angeschaltet wird. Das von ihm codierte putative Protein kann aufgrund von Strukturvorhersagen vermutlich zur Familie G Protein-gekoppelter Rezeptoren gezählt werden. Die ableitbare Funktion als Signalmolekül der Nierenentwicklung, sowie seine Lokalisation in einem WT-Lokus (1q42-q43) machen TM7SF1 zu einem aussichtsreichen Kandidatengen für den WT. Darüber hinaus konnten die Voraussetzungen für funktionelle Tests, die eine weitere Charakterisierung von TM7SF1 erlauben, geschaffen werden (Identifikation und Klonierung des murinen Homologen, stabil überexprimierende WT-Zelllinien, Antikörper gegen den Aminoterminus des putativen Proteins). Mit TCF2 wurde ein weiteres Gen identifiziert, dessen Produkt in Prozessen der Metanephrogenese eine Rolle spielt. Die signifikante Herunterregulation der TCF2-Expression in der großen Mehrzahl der untersuchten WTs, die innerhalb der vorliegenden Arbeit gezeigte Regulation durch das WT1-Genprodukt, sowie seine genomische Lokalisation in einem Intervall für die familiäre Form des WT (FWT1 in 17q12-q21) zeigen das Potenzial von TCF2, als Kandidatengen für den FWT zu gelten. Darüber hinaus wurde mit GLI3 ein in verschiedenen WTs stark exprimiertes Gen identifiziert. Sein Produkt ist eine Komponente des entwicklungsbiologisch relevanten und in verschiedene Tumorerkrankungen involvierten sonic hedgehog-Signaltransduktionsweges. Mit FE7A3 und CDT151 konnten zwei differenziell exprimierte cDNAs identifiziert werden, die Teile neuer Gene darstellen und die in WT-Loci kartiert werden konnten. Aufgrund von Homologievergleichen im Bereich der identifizierten offenen Leserahmen konnte eine mögliche Bedeutung der putativen Genprodukte für die WT-Pathogenese als Zelladhäsionsmolekül (FE7A3) bzw. als mit der Proliferation assoziiertem Transkriptionsfaktor (CDT151) herausgearbeitet werden. Neben den komparativen Genexpressionsuntersuchungen wurde in einem zweiten Ansatz die transkriptionelle Regulation des einzigen bisher klonierten Wilmstumorgens (WT1) analysiert. Mit Hilfe vergleichender Reportergenanalysen in WT1-exprimierenden und nicht-exprimierenden Zelllinien konnten neue für die transkriptionelle Regulation von WT1 relevante Bereiche identifiziert werden. Darüber hinaus wurde der für die Transkriptionsfaktoren SP1 und SP3 an anderen Promotoren beschriebene funktionelle Antagonismus für die WT1-Expression untersucht und in Gelretardationsanalysen mit dem WT1-Expressionsstatus oben genannter Zelllinien korreliert.

Synthese und Struktur-Eigenschafts-Beziehungen von Oligo- und Poly(2,5-dipropoxy-1,4-phenylenethinylen)en

Oligomere mit konjugierten pi-Elektronensystemen sind für die Materialwissenschaften von großer Bedeutung. Die vielfältigen und umfangreichen Forschungen auf diesem Gebiet gründen im Potenzial dieser Substanzklassen, das im Bereich der Laserfarbstoffe, Leuchtdioden, Photoleiter, optische Schalter oder auch der molekularen Elektronik angesiedelt ist. Zu diesen gehören auch die in dieser Arbeit synthetisierten und untersuchten Phenylenethinylene. Die Herstellung der Oligomere erfolgt nach der Methode von Sonogashira und Hagihara. Dabei wird ein Halogenaren mit einer Alkinkomponente zur Reaktion gebracht. Als Katalysator dient dabei ein Gemisch aus Bis(triphenylphosphin-palladiumdichlorid), Kupfer-(I)-iodid und Triphenylphosphin. Verwendung fanden bei der Synthese zwei Arten von Schutzgruppen. Es handelt sich dabei einerseits um die Trimethylsilyl- und die Triisopropylsilyl-Funktion, die unabhängig voneinander in ein System eingeführt werden und selektiv wieder entfernt werden können. Die zweite Art sind die Halogene Brom und Iod, die aufgrund ihrer Eigenschaft vielmehr als 'dormant group' bezeichnet werden müssen. Eine Ethinylierung führt zunächst zur Substitution des Iod- und anschließend des Bromatoms. Die so erhaltenen Oligomere werden mit verschiedenen spektroskopischen Methoden untersucht. Besonderes Interesse liegt dabei auf der Bestimmung der effektiven Konjugationslänge (EKL). Damit ist es möglich, die Länge des konjugierten Systems zu bestimmen, das für die betreffenden Eigenschaften des entsprechenden Polymers maßgeblich ist. Das nichtlineare optische Verhalten der Oligomere wird mittels der Third-Harmonic-Generation-Methode (THG) gemessen. Die resultierende Größe, die Suszeptibilität 3. Ordnung, gibt Aufschluß über mögliche industrielle Anwendungen.