Genes involved in the metabolism of fatty acids and risk for Crohn's disease in children: a candidate gene study

Contexte - La prévalence de la maladie de Crohn (MC), une maladie inflammatoire chronique du tube digestif, chez les enfants canadiens se situe parmi les plus élevées au monde. Les interactions entre les réponses immunes innées et acquises aux microbes de l'hôte pourraient être à la base de la transition de l’inflammation physiologique à une inflammation pathologique. Le leucotriène B4 (LTB4) est un modulateur clé de l'inflammation et a été associé à la MC. Nous avons postulé que les principaux gènes impliqués dans la voie métabolique du LTB4 pourrait conférer une susceptibilité accrue à l'apparition précoce de la MC. Dans cette étude, nous avons exploré les associations potentielles entre les variantes de l'ADN des gènes ALOX5 et CYP4F2 et la survenue précoce de la MC. Nous avons également examiné si les gènes sélectionnés montraient des effets parent-d'origine, influençaient les phénotypes cliniques de la MC et s'il existait des interactions gène-gène qui modifieraient la susceptibilité à développer la MC chez l’enfant. Méthodes – Dans le cadre d’une étude de cas-parents et de cas-témoins, des cas confirmés, leurs parents et des contrôles ont été recrutés à partir de trois cliniques de gastro-entérologie à travers le Canada. Les associations entre les polymorphismes de remplacement d'un nucléotide simple (SNP) dans les gènes CYP4F2 et ALOX5 ont été examinées. Les associations allélique et génotypiques ont été examinées à partir d’une analyse du génotype conditionnel à la parenté (CPG) pour le résultats cas-parents et à l’aide de table de contingence et de régression logistique pour les données de cas-contrôles. Les interactions gène-gène ont été explorées à l'aide de méthodes de réduction multi-factorielles de dimensionnalité (MDR). Résultats – L’étude de cas-parents a été menée sur 160 trios. L’analyse CPG pour 14 tag-SNP (10 dans la CYP4F2 et 4 dans le gène ALOX5) a révélé la présence d’associations alléliques ou génotypique significatives entre 3 tag-SNP dans le gène CYP4F2 (rs1272, p = 0,04, rs3093158, p = 0.00003, et rs3093145, p = 0,02). Aucune association avec les SNPs de ALOX5 n’a pu être démontrée. L’analyse de l’haplotype de CYP4F2 a montré d'importantes associations avec la MC (test omnibus p = 0,035). Deux haplotypes (GAGTTCGTAA, p = 0,05; GGCCTCGTCG, p = 0,001) montraient des signes d'association avec la MC. Aucun effet parent-d'origine n’a été observé. Les tentatives de réplication pour trois SNPs du gene CYP4F2 dans l'étude cas-témoins comportant 225 cas de MC et 330 contrôles suggèrent l’association dans un de ceux-ci (rs3093158, valeur non-corrigée de p du test unilatéral = 0,03 ; valeur corrigée de p = 0.09). La combinaison des ces deux études a révélé des interactions significatives entre les gènes CYP4F2, ALOX et NOD2. Nous n’avons pu mettre en évidence aucune interaction gène-sexe, de même qu’aucun gène associé aux phénotypes cliniques de la MC n’a pu être identifié. Conclusions - Notre étude suggère que la CYP4F2, un membre clé de la voie métabolique LTB4 est un gène candidat potentiel pour MC. Nous avons également pu mettre en évidence que les interactions entre les gènes de l'immunité adaptative (CYP4F2 et ALOX5) et les gènes de l'immunité innée (NOD2) modifient les risques de MC chez les enfants. D'autres études sur des cohortes plus importantes sont nécessaires pour confirmer ces conclusions.

Rôle de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans la régulation du programme angiogénique induit par le VEGF

Depuis la découverte de la première protéine possédant une activité tyrosine kinase (protein tyrosine kinase [PTK]) dans les années 1980, l’importance des PTKs et de la phosphorylation sur résidu tyrosine dans la régulation des événements de signalisation intracellulaire est bien établie. Quant aux protéines qui possèdent une activité tyrosine phosphatase (protein tyrosine phosphatase [PTP]), dont l’existence n’a été dévoilée qu’une dixaine d’années plus tard, elles ont longtemps été perçues comme des enzymes dont le rôle ne se résumait qu'à contrecarrer passivement les activités des PTKs. Il est maintenant clair que les activités des PTPs sont spécifiques, hautement régulées, et qu’elles doivent être coordonnées avec celles des PTKs pour une régulation adéquate des événements de signalisation intracellulaire. En dépit de cette évidence, la contribution des PTPs à la régulation des différents processus physiologiques fondamentaux demeure encore peu caractérisée. C’est le cas, notamment, de l’angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir de ceux préexistants. Le VEGF (Vascular endothelial growth factor), un des facteurs angiogéniques les plus importants, est connu pour induire majoritairement ses effets biologiques via l’activation du récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). Puisque l’angiogenèse est impliquée dans le développement d’une multitude de pathologies, dont la progression tumorale, une meilleure caractérisation des PTPs qui assurent la qualité de la réponse angiogénique en agissant de pair avec le VEGFR2 s’avère cruciale et ce, afin de raffiner les outils thérapeutiques actuels. L’expression de la PTP DEP-1 corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2 localisé au niveau des jonctions cellules-cellules et contribue à l’inhibition de la prolifération des cellules endothéliales en réponse au VEGF lorsque les cellules sont à confluence. Par contre, la contribution spécifique de DEP-1 à la régulation des voies de signalisation et des réponses biologiques induites par le VEGF demeurait toujours inconnue. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent tout d’abord que DEP-1 régule négativement l’activité tyrosine kinase de VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement les résidus tyrosine Y1054/Y1059 de sa boucle d’activation. Cette déphosphorylation mène par conséquent à une diminution générale de la phosphorylation du récepteur et à une atténuation de la plupart des voies de signalisation induites par le VEGF, incluant la voie mitogénique PLCγ-ERK1/2. Par ailleurs, malgré ce rôle négatif global, nos travaux révèlent étonnement, et pour la première fois, que DEP-1 contribue d’une manière positive à la promotion de la survie des cellules endothéliales via l’activation de la voie Src-Gab1-Akt en aval du récepteur VEGFR2. Ce pouvoir pro-survie de DEP-1 dans les cellules endothéliales réside avant tout dans sa capactié à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529). Au cours de notre étude, nous avons pu identifier deux résidus tyrosine au niveau de l’extrémité carboxy-terminale de DEP-1, Y1311 et Y1320, dont la phosphorylation est dépendante de Src. Nos travaux révèlent par ailleurs que ces deux résidus tyrosine phosphorylés lient le domaine SH2 de Src et que la Y1320 est principalement requise pour l’activation de Src et d’Akt en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces résultats constituent donc une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels DEP-1 peut réguler le programme angiogénique dépendant du VEGF. De plus, cette découverte d’un rôle positif pour DEP-1 dans la survie des cellules endothéliales pourrait mener à l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques visant à inhiber cette fonction spécifique de DEP-1 pour bloquer l'angiogenèse pathologique.

Étude de la fonction vasculaire et du remodelage cardiaque avant l’établissement de l’obésité et de la dyslipidémie chez les rats femelles Sprague-Dawley recevant une diète riche en gras

Des lacunes existent au niveau des connaissances concernant les modifications cardiovasculaires manifestées avant l’établissement d’obésité et en absence d’hyperlipidémie. Dans cette optique, la présente étude a testé l'hypothèse générale qui stipule que l’administration d’une diète riche en gras pour une période de 8 semaines chez les rats femelles influence négativement la fonction et le remodelage cardiaque, avant le développement de l’obésité et en absence d’hyperlipidémie et d’hyperglycémie. Afin de répondre à cette problématique, des rats femelles Sprague-Dawley ont été assignés à une diète standard (SD; 12,5% lipides, kcal) ou riche en gras (HF; 42% lipides, kcal) pour une période de 8 semaines. Cette durée était insuffisante pour induire le développement d’une dyslipidémie ou une augmentation significative de la masse corporelle chez les animaux HF(329±14g) comparativement aux rates SD (300±10g). Toutefois, une hypertension artérielle s’est développée chez les rates HF (130±4 vs 108±6 mmHg, p<0,05), accompagnée d’une altération des relaxations aortiques dépendantes de l’endothélium (relaxation maximale : 22±5% versus 53±8%, pour les animaux HF et SD respectivement, p<0,05). L’administration orale chronique de l’antioxydant resvératrol (RES; 20 mg·kg-1·jr-1) a prévenu le développement de ces altérations pathologiques, attestant d’une implication du stress oxydant. Au niveau cardiaque, le RES n’a toutefois pas inhibé le développement de fibrose périvasculaire secondaire à l’administration de la diète riche en gras. Suite à une insulte d’ischémie-reperfusion, la taille (SD : 0,29±0,09 versus HF : 0,32±0,13 cm), l’épaisseur (SD : 0,05±0,02 versus HF : 0,06±0,01 cm) et le contenu en collagène α1 type 1 (SD : 0,21±0,04 versus HF : 0,20±0,04 unités arbitraires/mm2) de la cicatrice du coeur infarci des rats HF étaient comparables au coeur infarci des rats SD. Malgré ces similitudes, le taux de décès était significativement (p<0,05) plus élevé chez les rats HF (56%) comparativement aux rats SD (5%). L’approche par électrophysiologie a démontré que l’administration de la diète riche en gras était associée à une augmentation (p<0,05) du nombre d’extrasystoles ventriculaires induites. Cette élévation de l’incidence était associé à une hyperinnervation sympathique fonctionnelle, tel que démontré par une élévation (p<0,05) de la densité des fibres neurofilament-M (HF : 2830±250 versus SD : 2020±260 μm2/mm2) et de la protéine de l’hydroxylase de la tyrosine. La fonctionnalité des jonctions intercellulaires était également atteinte, caractérisée par une latéralisation et internalisation de connexine 43 ainsi qu’une diminution de l’expression de connexine 40 au niveau des disques intercalaires. Ainsi, avant l’établissement de l’obésité et d’une dyslipidémie, les rats femelles modestement hypertendus présentent un phénotype arythmogénique cardiaque en partie dû à une hyperinnervation sympathique et une expression altérée concomitante de la distribution et de l’expression des jonctions intercellulaires. L’absence de symptômes cliniques d’obésité dans la présente étude ne fournit aucun indice au clinicien quant à la susceptibilité accrue aux arythmies ventriculaires. Ainsi, en présence d’une hypertension artérielle modérée chez un patient non-obèse, une mesure de l’activité sympathique par la quantification des niveaux circulants de catécholamines pourrait être bénéfique afin de détecter les patients à risque de mort subite.

Évaluation des désordres cardiovasculaires chez des souris bêta-thalassémiques

L’hémoglobine est une protéine contenue dans les globules rouges dont la principale fonction est le transport de l’oxygène. Chaque molécule d’hémoglobine est un tétramère constitué de deux paires de globines identiques de type α et β. La β-thalassémie est une maladie génétique hématopoïétique provenant de mutations du gène encodant l'hémoglobine. Ce désordre se caractérise par une diminution ou une absence totale de la synthèse de la chaîne β-globine résultant principalement en une anémie hémolytique sévère ainsi que des complications multisystémiques, telles que la splénomégalie, des déformations osseuses et une dysfonction hépatique et rénale. Actuellement, les transfusions sanguines chroniques représentent le traitement standard des patients β-thalassémiques. Cette thérapie nécessite l’administration conjointe d’un traitement chélateur de fer puisqu’elle entraîne une accumulation pathologique du fer, considéré à ce jour comme la source principale des complications cardiovasculaires de la β-thalassémie. Néanmoins, malgré le traitement efficace de la surcharge de fer transfusionnelle, l’insuffisance cardiaque demeure encore la principale cause de mortalité chez les patients atteints de β-thalassémie. Cette observation indique possiblement la présence d’un mécanisme complémentaire dans le développement de la physiopathologie cardiaque β-thalassémique. L’objectif du présent projet consistait donc à étudier les altérations cardiovasculaires de la β-thalassémie indépendamment de la surcharge de fer transfusionnelle. En utilisant un modèle murin non-transfusé de la β-thalassémie majeure, nous avons d’abord évalué in vivo, par méthode d’imagerie novatrice échographique à haute fréquence, les propriétés hémodynamiques vasculaires. Nos résultats d’index de Pourcelot ainsi que de résistance vasculaire périphérique totale ont démontré une perturbation de l’écoulement microcirculatoire chez les souris β-thalassémiques non-transfusées. Subséquemment, nous avons étudié la fonction endothéliale de régulation du tonus vasculaire de vaisseaux mésentériques isolés. Nos résultats ont révélé un dysfonctionnement de la réponse vasodilatatrice dépendante de l’endothélium chez les souris β-thalassémiques malgré une augmentation de l’expression de l’enzyme de synthèse du monoxyde d’azote ainsi qu’un remodelage de la carotide commune caractérisé par un épaississement de la paroi vasculaire. Finalement, notre étude échocardiographique de la fonction et la morphologie cardiaque a montré, chez les souris β-thalassémiques, le développement d’une hypertrophie et une dysfonction ventriculaire gauche en l’absence de transfusions sanguines chroniques ou de dépôts directs de fer dans le myocarde. L’ensemble des résultats présentés dans le cadre de cette thèse indique la présence d’une pathologie cardiovasculaire chez les souris β-thalassémiques non-transfusés. Nos travaux permettent de proposer un mécanisme de la pathophysiologie cardiovasculaire β-thalassémique, indépendant de la charge de fer transfusionnelle, impliquant les effets compensatoires d’une anémie chronique combinés à une vasculopathie complexe initiée par les érythrocytes endommagés et l’hémolyse intravasculaire.

Vieillissement et réorganisation neurofonctionnelle pour le traitement du sens métaphorique des mots

Compte tenu de l ’importante augmentation de l ’espérance de vie de la population générale observée dans les dernières décennies, les études portant sur les modifications des fonctions cognitives lors du vieillissement normal et pathologique se révèlent d'un grand intérêt. Les résultats rapportés dans cette thèse contribuent à une meilleure compréhension de la nature des modifications avec l ’âge du traitement du sens métaphorique des mots et du phénomène de réorganisation fonctionnelle sous-tendant ces processus. Après une revue de littérature (chapitre 1), un premier article définissant la problématique générale du traitement du langage lors du vieillissement normal inaugure la série de travaux présentés dans cette thèse. Cet article, présenté dans le chapitre 2, confirme l ’importance du développement d ’études spécifiques permettant de faire le lien entre les différentes hypothèses portant sur les changements cognitifs propres au vieillissement normal et celles portant sur les changements propres au substrat neurobiologique du langage. Le chapitre 3 présente une étude comportementale ayant pour objectif d ’évaluer la disponibilité des ressources attentionnelles pour le traitement phonologique et sémantique des mots ainsi que son évolution possible avec l ’âge. Les conclusions tirées de cette étude vont dans le sens d ’une restriction des ressources attentionnelles particulièrement pour le traitement du sens métaphorique des mots lors du vieillissement normal. Le chapitre 4 présente une étude en neuroimagerie fonctionnelle. Cette étude a été réalisée afin de comparer les profils d'activation cérébrale des participants jeunes et âgés lors du traitement du sens métaphorique des mots. Les résultats obtenus soulignent qu ’autant pour les participants jeunes que pour les participants âgés, le traitement du sens métaphorique des mots pourrait imposer au cerveau le partage des ressources attentionnelles. Néanmoins, ils montrent une réorganisation fonctionnelle chez les participants âgés. L ’ensemble des travaux présentés appuie l ’hypothèse d ’une attribution différentielle des ressources attentionnelles ainsi que celle d ’une réorganisation fonctionnelle chez les participants âgés pour le traitement du sens métaphorique des mots. Les résultats viennent enrichir la compréhension des modèles neurocognitifs du vieillissement en ce qui concerne l ’évolution des bases neurobiologiques du langage.

Régulation dynamique de l’activité du récepteur des estrogènes beta (ERβ) par la phosphorylation,l’ubiquitination et la sumoylation

Les estrogènes jouent un rôle primordial dans le développement et le fonctionnement des tissus reproducteurs par leurs interactions avec les récepteurs des estrogènes ERα et ERβ. Ces récepteurs nucléaires agissent comme facteurs de transcription et contrôlent l’expression des gènes de façon hormono-dépendante et indépendante grâce à leurs deux domaines d’activation (AF-1 et AF-2). Une dérégulation de leur activité transcriptionnelle est souvent à l’origine de pathologies telles que le cancer du sein, de l’endomètre et des ovaires. Alors que ERα est utilisé comme facteur pronostic pour l’utilisation d’agents thérapeutiques, l’importance de la valeur clinique de ERβ est encore controversée. Toutefois, des évidences récentes lui associent un pouvoir anti-tumorigénique en démontrant que sa présence favorise l’inhibition de la progression de ces cancers ainsi que l’efficacité des traitements. En combinaisons avec d’autres études, ces observations démontrent que bien que les deux isoformes partagent une certaine similitude d’action, les ERs sont en mesure d’exercer des fonctions distinctes. Ces différences sont fortement attribuables au faible degré d’homologie observé entre certains domaines structuraux des ERs, comme le domaine AF-1, ce qui fait en sorte que les différents sites de modifications post-traductionnelles (MPTs) présents sur les ERs sont très peu conservés entre les isoformes. Or, l’activité transcriptionnelle ligand-dépendante et indépendante des ERs est hautement régulée par les MPTs. Elles sont impliquées à tous les niveaux de l’activation des ERs incluant la liaison et la sensibilité au ligand, la localisation cellulaire, la dimérisation, l’interaction avec l’ADN, le recrutement de corégulateurs transcriptionnels, la stabilité et l’arrêt de la transcription. Ainsi, de par leur dissimilitude, les ERs seront différemment régulés par la signalisation cellulaire. Comme un débalancement de plusieurs voies de signalisation ont été associées à la progression de tumeurs ER-positives ainsi qu’au développement d’une résistance, une meilleure compréhension de l’impact des MPTs sur la régulation spécifique des ERs s’avère essentielle en vue de proposer et/ou développer des traitements adéquats pour les cancers gynécologiques. Les résultats présentés dans cette thèse ont pour objectif de mieux comprendre les rôles des MPTs sur l’activité transcriptionnelle de ERβ qui sont, contrairement à ERα, très peu connus. Nous démontrons une régulation dynamique de ERβ par la phosphorylation, l’ubiquitination et la sumoylation. De plus, toutes les MPTs nouvellement découvertes par mes recherches se situent dans l’AF-1 de ERβ et permettent de mieux comprendre le rôle capital joué par ce domaine dans la régulation de l’activité ligand-dépendante et indépendante du récepteur. Dans la première étude, nous observons qu’en réponse aux MAPK, l’AF-1 de ERβ est phosphorylé au niveau de sérines spécifiques et qu’elles jouent un rôle important dans la régulation de l’activité ligand-indépendante de ERβ par la voie ubiquitine-protéasome. En effet, la phosphorylation de ces sérines régule le cycle d’activation-dégradation de ERβ en modulant son ubiquitination, sa mobilité nucléaire et sa stabilité en favorisant le recrutement de l’ubiquitine ligase E6-AP. De plus, ce mécanisme d’action semble être derrière la régulation différentielle de l’activité de ERα et ERβ observée lors de l’inhibition du protéasome. Dans le second papier, nous démontrons que l’activité et la stabilité de ERβ en présence d’estrogène sont étroitement régulées par la sumoylation phosphorylation-dépendante de l’AF-1, processus hautement favorisé par l’action de la kinase GSK-3. La sumoylation de ERβ par SUMO-1 prévient la dégradation du récepteur en entrant en compétition avec l’ubiquitination au niveau du même site accepteur. De plus, contrairement à ERα, SUMO-1 réprime l’activité de ERβ en altérant son interaction avec l’ADN et l’expression de ses gènes cibles dans les cellules de cancers du sein. Également, ces recherches ont permis d’identifier un motif de sumoylation dépendant de la phosphorylation (pSuM) jusqu’à lors inconnu de la communauté scientifique, offrant ainsi un outil supplémentaire à la prédiction de nouveau substrat de la sumoylation. En plus de permettre une meilleure compréhension du rôle des signaux intracellulaires dans la régulation de l’activité transcriptionnelle de ERβ, nos résultats soulignent l’importance des MPTs dans l’induction des différences fonctionnelles observées entre ERα et ERβ et apportent des pistes supplémentaires à la compréhension de leurs rôles physiopathologiques respectifs.

La structure du sommeil et l’activité cardiaque nocturne chez les adolescents ayant un trouble anxieux

L’objectif de la présente thèse était de caractériser le sommeil d’un groupe clinique d’enfants et d’adolescents ayant un trouble d’anxiété comme diagnostic primaire et le comparer à un groupe témoin. Dans un premier temps, nous avons vérifié si le profil de la fréquence cardiaque nocturne des enfants et des adolescents pouvait être regroupé selon le diagnostic. Pour ce faire, la fréquence cardiaque nocturne de 67 adolescents anxieux et 19 sujets non anxieux a été enregistrée à l’aide d’un équipement ambulatoire. Les résultats de cette étude montrent que le profil de la fréquence cardiaque nocturne chez les enfants anxieux varie selon le diagnostic. Alors que les adolescents non anxieux montrent un profil de la fréquence cardiaque nocturne plat, on retrouve les associations suivantes chez les adolescents ayant un trouble anxieux : a) un profil croissant de la fréquence cardiaque chez les adolescents ayant un trouble d’anxiété de séparation; b) un profil décroissant de la fréquence cardiaque chez les adolescents ayant un trouble d’anxiété généralisé; c) un profil en forme de U chez les adolescents ayant un trouble d’anxiété sociale. De plus, une association significative a été observée entre le diagnostic et la présence de fatigue matinale. L’association d’un profil de la fréquence cardiaque nocturne avec un diagnostic d’anxiété suggère la présence d’une dysrégulation de la modulation chronobiologique du système nerveux autonome. Étant donné que le profil de la fréquence cardiaque nocturne s’exprime différemment selon le diagnostic, qu’en est-il de l’architecture du sommeil? Dans un deuxième temps, nous avons enregistré le sommeil en laboratoire d’un groupe clinique de 19 jeunes ayant un trouble d’anxiété comme diagnostic primaire, avec comorbidités et médication et comparé à 19 jeunes non anxieux. Les résultats de cette étude ont montré que les participants du groupe anxieux ont une latence au sommeil plus longue, une latence au sommeil paradoxal plus longue et une durée d’éveil plus longue lorsque comparé au groupe témoin. L’évaluation subjective de la qualité du sommeil chez le groupe d’adolescents anxieux montre que leur auto-évaluation reflète les valeurs enregistrées en laboratoire. Nous avons également observé chez le groupe anxieux une fréquence cardiaque moyenne plus élevée et un index plus élevé d’apnée-hypopnée, bien que non pathologique. Nous avons également observé une association positive entre l’anxiété de trait et l’indice d’apnée-hypopnée et la latence au sommeil, ainsi qu’une association positive entre l’anxiété manifeste et la latence au sommeil paradoxal. Ces résultats suggèrent que le sommeil chez cette population est altéré, que des signes d’hypervigilance physiologique sont présents et qu'une association existe entre ces deux paramètres. Finalement, dans la troisième étude de cette thèse, nous avons analysé l’activité cardiaque pendant le sommeil en utilisant les paramètres temporels et fréquentiels de la variabilité cardiaque chez un groupe clinique de dix-sept enfants et adolescents ayant un trouble d’anxiété comme diagnostic primaire avec comorbidité et médication, et comparé à un groupe non anxieux. Les résultats ont montré que les participants du groupe anxieux, lorsque comparés au groupe non anxieux, présentent des intervalles interbattements plus courts, un indice temporel de la variabilité cardiaque représentant la branche parasympathique moindre, une activité des hautes fréquences normalisées moindre et un ratio basse fréquence sur haute fréquence augmenté. Plusieurs corrélations ont été observées entre les mesures cliniques de l’anxiété et les mesures de la variabilité cardiaque. Ces résultats viennent ajouter à la littérature actuelle un volet descriptif clinique à ce jour non documenté, soit l’impact de l’anxiété pathologique chez un groupe clinique d’enfants et d’adolescents sur le processus normal du sommeil et sur la régulation de la fréquence cardiaque. En résumé, les résultats de ces trois études ont permis de documenter chez un groupe clinique d’enfants et d’adolescents ayant de l’anxiété pathologique, la présence d’une altération circadienne du profil de la fréquence cardiaque, d’une architecture altérée du sommeil ainsi qu’une dysrégulation du système nerveux contrôlant l’activité cardiaque.

El Tropel, un sitio arqueológico del Clásico en el Occidente Mesoamericano.

Cette recherche doctorale a été réalisée dans le cadre d’un projet de sauvetage archéologique à Villa de Álvarez, dans l’état de Colima (Mexique). Dans la zone géographique à l’étude, plusieurs traces indiquant la présence de contextes funéraires ont été relevées par le passé, mais aucun de ces sites n’a fait l’objet d’un rapport archéologique. L’état de Colima est connu pour ses tombes à puits (tumbas de tiro), ses céramiques de manufacture typique, ainsi que pour les fameux « chiens de Colima ». Malgré la relation entre ces objets et les contextes funéraires, peu d’études se sont attardées à comprendre la composante biologique de ces contextes, c’est-à-dire les êtres humains. Ainsi, la richesse du projet de sauvetage archéologique nous a donné l’opportunité de structurer un projet de recherche de thèse doctorale beaucoup plus profond en ce qui concerne un des sujets les plus importants de cette région mésoaméricaine : les traditions funéraires. C’est de cette façon, à la lumière des résultats particuliers obtenus sur le site du Tropel, que nous avons décidé de travailler les liens culturels existants entre ce dernier, la région de Colima, l’Ouest mésoaméricain et l’aire culturelle dans son ensemble. La campagne de fouille ainsi menée a permis la récupération de vingt-six individus de différents sexes et âges. Au moins quatre périodes d’occupation ont été enregistrées sur le site. La présence humaine sur le site s’étend donc de 339AD à 682 AD (datations au radiocarbone sur trois individus du site El Tropel), ce qui correspond à la phase archéologique Comala à Colima. L’abondance d’artefacts de cette phase dans les quatre strates culturelles du site a permis de réaliser une datation relative en relation avec l’apparition et la fréquence de céramiques d’autres phases culturelles connues : Ortices, Colima, Armería y Chanal. Concernant les pratiques funéraires, la fouille a permis de constater le traitement des cadavres avant, pendant et après l’enterrement des défunts. Bien que des contextes funéraires similaires aient déjà été mentionnés dans la région, aucun d’entre eux n’a pu être identifié clairement. Ces traitements funéraires démontrent l’existence chez les anciens habitants de Colima d’une transmission des connaissances concernant l’anatomie, les processus de décomposition des cadavres, et même possiblement d’un culte des os humains. Une étude ostéologique a été menée sur les squelettes afin de documenter les aspects démographiques, pathologiques, sociaux et économiques de la population du site. Parmi les éléments les plus significatifs de l’étude, il est possible de mentionner la présence de certaines pathologies peu connues dans cette région de la Mésoamérique telles que la syphilis et la tuberculose. Des déformations crâniennes ont aussi été observées, ainsi que la présence d’un déformateur crânien en céramique. De plus, de nombreuses données ont été relevées concernant la présence d’os wormiens sur les crânes déformés artificiellement. Finalement, des analyses d’isotopes stables ont été pratiquées sur des os des individus, ainsi que sur des os de chiens et de cerfs retrouvés sur le site, afin de mieux connaître l’alimentation et la vie des communautés anciennes de la région.

Données nouvelles sur l’innervation à dopamine du striatum et son co-phénotype glutamatergique

Une sous-population des neurones à dopamine (DA) du mésencéphale ventral du rat et de la souris étant connue pour exprimer l'ARN messager du transporteur vésiculaire 2 du glutamate (VGLUT2), nous avons eu recours à l'immunocytochimie en microscopie électronique, après simple ou double marquage de l'enzyme de synthèse tyrosine hydroxylase (TH) et de VGLUT2, pour déterminer la présence de l'une et/ou l'autre protéine dans les terminaisons (varicosités) axonales de ces neurones et caractériser leur morphologie ultrastructurale dans diverses conditions expérimentales. Dans un premier temps, des rats jeunes (P15) ou adultes (P90), ainsi que des rats des deux âges soumis à l'administration intraventriculaire cérébrale de la cytotoxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans les jours suivant la naissance, ont été examinés, afin d'étayer l'hypothèse d'un rôle de VGLUT2 au sein des neurones DA, au cours du développement normal ou pathologique de ces neurones. Chez le jeune rat, ces études ont montré: i) la présence de VGLUT2 dans une fraction importante des varicosités axonales TH immunoréactives du coeur du noyau accumbens ainsi que du néostriatum; ii) une augmentation de la proportion de ces terminaisons doublement marquées dans le noyau accumbens par suite de la lésion 6-OHDA néonatale; iii) le double marquage fréquent des varicosités axonales appartenant à l'innervation DA aberrante (néoinnervation), qui se développe dans la substance noire, par suite de la lésion 6-OHDA néonatale. Des différences significatives ont aussi été notées quant à la dimension des terminaisons axonales marquées pour la TH seulement, VGLUT2 seulement ou TH et VGLUT2. Enfin, à cet âge (P15), toutes les terminaisons doublement marquées sont apparues dotées d'une spécialisation membranaire synaptique, contrairement aux terminaisons marquées pour la TH ou pour VGLUT2 seulement. Dans un deuxième temps, nous avons voulu déterminer le devenir du double phénotype chez le rat adulte (P90) soumis ou non à la lésion 6-OHDA néonatale. Contrairement aux observations recueillies chez le jeune rat, nous avons alors constaté: i) l'absence complète de terminaisons doublement marquées dans le coeur du noyau accumbens et le néostriatum d'animaux intacts, de même que dans les restes de la substance noire des animaux 6-OHDA lésés; ii) une très forte baisse de leurnombre dans le coeur du noyau accumbens des animaux 6-OHDA lésés. Ces observations, suggérant une régression du double phénotype TH/VGLUT2 avec l'âge, sont venues renforcer l'hypothèse d'un rôle particulier d'une co-libération de glutamate par les neurones mésencéphaliques DA au cours du développement. Dans ces conditions, il est apparu des plus intéressants d'examiner l'innervation DA méso-striatale chez deux lignées de souris dont le gène Vglut2 avait été sélectivement invalidé dans les neurones DA du cerveau, ainsi que leurs témoins et des souris sauvages. D'autant que malgré l'utilisation croissante de la souris en neurobiologie, cette innervation DA n'avait jamais fait l'objet d’une caractérisation systématique en microscopie électronique. En raison de possibles différences entre le coeur et la coque du noyau accumbens, l'étude a donc porté sur les deux parties de ce noyau ainsi que le néostriatum et des souris jeunes (P15) et adultes (P70-90) de chaque lignée, préparées pour l'immunocytochimie de la TH, mais aussi pour le double marquage TH et VGLUT2, selon le protocole précédemment utilisé chez le rat. Les résultats ont surpris. Aux deux âges et quel que soit le génotype, les terminaisons axonales TH immunoréactives des trois régions sont apparues comparables quant à leur taille, leur contenu vésiculaire, le pourcentage contenant une mitochondrie et une très faible incidence synaptique (5% des varicosités, en moyenne). Ainsi, chez la souris, la régression du double phénotype pourrait être encore plus précoce que chez le rat, à moins que les deux protéines ne soient très tôt ségréguées dans des varicosités axonales distinctes des mêmes neurones DA. Ces données renforcent aussi l’hypothèse d’une transmission diffuse (volumique) et d’un niveau ambiant de DA comme élément déterminant du fonctionnement du système mésostriatal DA chez la souris comme chez le rat.

Novel molecular mechanisms of neuronal and vascular protection in experimental glaucoma

Le glaucome est la deuxième cause de cécité irréversible dans le monde. La perte de vision qui se produit lors du glaucome s’explique par une dégénérescence du nerf optique et une mort progressive et sélective des cellules ganglionnaires de la rétine (CRG). L'hypertension oculaire est un facteur de risque majeur dans le glaucome, mais des défauts du champ visuel continuent à se développer chez un contingent de patients malgré l'administration de médicaments qui abaissent la pression intraoculaire (PIO). Par conséquent, bien que la PIO représente le seul facteur de risque modifiable dans le développement du glaucome, son contrôle ne suffit pas à protéger les CRGs et préserver la fonction visuelle chez de nombreux patients. Dans ce contexte, j'ai avancé l'hypothèse centrale voulant que les stratégies de traitement du glaucome visant à promouvoir la protection structurale et fonctionnelle des CRGs doivent agir sur les mécanismes moléculaires qui conduisent à la mort des ces neurones. Dans la première partie de ma thèse, j'ai caractérisé l'effet neuroprotecteur de la galantamine, un inhibiteur de l'acétylcholinestérase qui est utilisé cliniquement dans le traitement de la maladie d'Alzheimer. Cette étude s’est basée sur l'hypothèse que la galantamine, en modulant l'activité du récepteur de l'acétylcholine, puisse améliorer la survie des CRGs lors du glaucome. Nous avons utilisé un modèle expérimental bien caractérisé d'hypertension oculaire induite par l’administration d'une solution saline hypertonique dans une veine épisclérale de rats Brown Norway. Les résultats de cette étude (Almasieh et al. Cell Death and Disease, 2010) ont démontré que l'administration quotidienne de galantamine améliore de manière significative la survie des corps cellulaires et des axones CRGs. La protection structurelle des CRGs s’accompagne d’une préservation remarquable de la fonction visuelle, évaluée par l'enregistrement des potentiels évoqués visuels (PEV) dans le collicule supérieur, la cible principale des CRGs chez le rongeur. Une autre constatation intéressante de cette étude est la perte substantielle de capillaires rétiniens et la réduction du débit sanguin associé à la perte des CRGs dans le glaucome expérimental. Il est très intéressant que la galantamine ait également favorisé la protection de la microvascularisation et amélioré le débit sanguin rétinien des animaux glaucomateux (Almasieh et al. en préparation). J'ai notamment démontré que les neuro-et vasoprotections médiées par la galantamine se produisent par iv l'activation des récepteurs muscariniques de l'acétylcholine. Dans la deuxième partie de ma thèse, j'ai étudié le rôle du stress oxydatif ainsi que l'utilisation de composés réducteurs pour tester l'hypothèse que le blocage d'une augmentation de superoxyde puisse retarder la mort des CRG lors du glaucome expérimental. J'ai profité d'un composé novateur, un antioxydant à base de phosphineborane (PB1), pour tester sur son effet neuroprotecteur et examiner son mécanisme d'action dans le glaucome expérimental. Les données démontrent que l'administration intraoculaire de PB1 entraîne une protection significative des corps cellulaire et axones des CRGs. Les voies moléculaires conduisant à la survie neuronale médiée par PB1 ont été explorées en déterminant la cascade de signalisation apoptotique en cause. Les résultats démontrent que la survie des CRGs médiée par PB1 ne dépend pas d’une inhibition de signalisation de protéines kinases activées par le stress, y compris ASK1, JNK ou p38. Par contre, PB1 induit une augmentation marquée des niveaux rétiniens de BDNF et une activation en aval de la voie de survie des ERK1 / 2 (Almasieh et al. Journal of Neurochemistry, 2011). En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques qui conduisent à la perte de CRGs dans le glaucome et pourraient fournir des pistes pour la conception de nouvelles stratégies neuroprotectrices et vasoprotectrices pour le traitement et la gestion de cette maladie.

Genetics of amyotrophic lateral sclerosis

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la maladie des neurones moteurs la plus fréquente, affectant 4-6 individus par 100,000 habitants à l’échelle mondiale. La maladie se caractérise par une faiblesse et une atrophie musculaire suite à la dégénérescence des neurones du cortex moteur, tronc cérébral et moelle épinière. Les personnes atteintes développent les premiers symptômes à l’âge adulte et la maladie progresse sur une période de trois à cinq ans. Il a été répertorié qu’environ 10% des patients ont une histoire familiale de SLA; 90% des gens affectés le sont donc de façon sporadique. La découverte il y a 19 ans de mutations dans le gène zinc/copper superoxide dismutase (SOD1), présentes dans 15-20% des cas familiaux de SLA et environ 2% du total des individus affectés, a été l’événement déclencheur pour la découverte de variations génétiques responsables de la maladie. La recherche sur la génétique de la SLA a connu une progression rapide ces quatre dernières années avec l’identification de mutations dans de nouveaux gènes. Toutefois, même si certains de ces gènes ont été démontrés comme réellement liés à la maladie, la contribution d’autres gènes demeure incertaine puisque les résultats publiés de ceux-ci n’ont pas, à ce jour, été répliqués. Une portion substantielle de cas reste cependant à être génétiquement expliquée, et aucun traitement à ce jour n’a été démontré comme étant efficace pour remédier, atténuer ou prévenir la maladie. Le but du projet de recherche de doctorat était d’identifier de nouveaux gènes mutés dans la SLA, tout en évaluant la contribution de gènes nouvellement identifiés chez une importante cohorte multiethnique de cas familiaux et sporadiques. Les résultats présentés sont organisés en trois sections différentes. Dans un premier temps, la contribution de mutations présentes dans le gène FUS est évaluée chez les patients familiaux, sporadiques et juvéniles de SLA. Précisément, de nouvelles mutations sont rapportées et la proportion de mutations retrouvées chez les cas familiaux et sporadiques de SLA est évaluée. De plus, une nouvelle mutation est rapportée dans un cas juvénile de SLA; cette étude de cas est discutée. Dans un deuxième temps, de nouvelles avenues génétiques sont explorées concernant le gène SOD1. En effet, une nouvelle mutation complexe est rapportée chez une famille française de SLA. De plus, la possibilité qu’une mutation présente dans un autre gène impliqué dans la SLA ait un impact sur l’épissage du gène SOD1 est évaluée. Finalement, la dernière section explique la contribution de nouveaux gènes candidats chez les patients atteints de SLA. Spécifiquement, le rôle des gènes OPTN, SIGMAR1 et SORT1 dans le phénotype de SLA est évalué. Il est souhaité que nos résultats combinés avec les récents développements en génétique et biologie moléculaire permettent une meilleure compréhension du mécanisme pathologique responsable de cette terrible maladie tout en guidant le déploiement de thérapies suite à l’identification des cibles appropriées.

Implication de la protéine tyrosine phosphatase DEP-1 dans la perméabilité vasculaire induite par le VEGF

La perméabilité vasculaire est une caractéristique cruciale de l’angiogenèse. Les acteurs principaux sont les cellules endothéliales qui la régulent en réponse à divers facteurs perméabilisant, tels que le « Vascular Endothelial Growth Factor » (VEGF). Dans le contexte pathologique du cancer, les cellules tumorales produisent de grandes quantités de VEGF qui stimulent la perméabilité, ce qui leur permet d’infiltrer le réseau vasculaire. Il est connu que la tyrosine kinase Src contrôle cette modulation de la perméabilité. Puisque notre laboratoire a préalablement démontré que la phosphatase de type récepteur (PTP) DEP-1 est impliquée dans l’activation de Src en réponse au VEGF, nous avons émis l'hypothèse que DEP-1 pourrait aussi jouer un rôle dans la perméabilité des cellules endothéliales. Grâce à des expériences de transfections d’ARN interférant, nous démontrons que DEP-1 est important pour la régulation de la phosphorylation de la VE-Cadhérine, un médiateur critique de la perméabilité. L’impact de DEP-1 sur la dissociation de jonctions intercellulaires est également démontré par microscopie à immunofluorescence de cellules endothéliales. DEP-1 est également nécessaire à l’augmentation de la perméabilité induite par VEGF in vitro. Deux résidus tyrosine retrouvés dans la queue carboxy-terminale de DEP-1 sont essentiels à l’activation de Src en réponse au VEGF. Suite à la transfection d’un plasmide encodant DEP-1 muté pour ces deux résidus, nous démontrons aussi leur implication dans la régulation de la perméabilité in vitro par DEP-1. Ces travaux permettent ainsi d’approfondir nos connaissances sur un nouveau régulateur potentiel de la perméabilité vasculaire.

Stress oxydatif, fonction mitochondriale et maladie inflammatoire de l'intestin

CONTEXTE: Bien que la dysfunction mitochondriale et le stress oxydant jouent des rôles prépondérants dans plusieurs conditions pathologiques, ils n’ont pas été étudiés de façon extensive au niveau du tube digestif qui est constamment exposé aux oxydants (provenant de l’alimentation) et à divers agents pathogènes. L’ingestion simultanée de sels ferreux et d’acide ascorbique peut causer le dommage des macromolécules par oxydation. Le ‘’Nuclear factor erythroid 2 related factor’’ (Nrf2) est un important facteur de transcription sensible au potentiel redox et qui protège contre le stress oxydant en induisant des gènes anti-oxydants et de detoxification par sa liaison à l’élément de réponse antioxydante (ARE). Les fonctions anti-oxydantes et anti-inflammatoires de Nrf2 ont été décrites dans une variété de types cellulaires et de tissus. Cependant son rôle est très peu connu au niveau du tube digestif. OBJECTIFS: Les objectifs sont d’évaluer comment la peroxydation lipidique médiée par le fer/ascorbate (FE/ASC) affecte les fonctions mitochondriales dans les cellules Caco-2/15, et de déterminer l’ampleur de l’implication de Nrf2. MÉTHODES: Le stress oxydant a été induit dans les cellules Caco2/15 en les traitant avec 0.2mm/2mm de FE/ASC. L’augmentation de l’expression de Nrf2 a été obtenue suite au prétraitement des cellules Caco2/15 avec 50 μM d’Olitpraz (OPZ), un puissant activateur. L’invalidation du gène de Nrf2 a été réalisée dans les cellules par transfection avec un vecteur lentiviral contenant un shRNA contre Nrf2. RÉSULTATS: Nos résultats montrent que le traitement des cellules Caco-2/15 avec du FE/ASC (0.2 mm/2 mm) augmente les niveaux du malondialdehyde (MDA), réduit la production d’ATP, entraîne une surcharge mitochondriale de calcium, active l’expression protéique du cytochrome C et de l’AIF (apoptotic inducing factor), réduit l’activité des complexes I, II, 2 III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale, augmente les niveaux de 8-OHdG, un marqueur des dommages à l’ADN mitochondrial, diminue la DNA glycosylase, et altère les expressions génique et protéique des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). De plus, nos observations montrent que l’induction et l’activation de Nrf2 dans les cellules Caco-2/15 résultent en: une augmentation des enzymes anti-oxydantes endogènes (catalase, glutathion peroxydase, et superoxyde dismutase), une réduction du facteur nucléaire NFκβ et de TNF-α, une augmentation de la production d’ ATP et de l’activité des complexes respiratoires (I, II, III, IV) et de PGC-1α, et une régulation des niveaux de la prohibitine mitochondriale, du Bcl-2 anti-apoptotique et de l’occludine. CONCLUSION: Dans l’ensemble, nos résultats montrent que l’exposition aigüe des cellules Caco-2/15 à la peroxydation par le FE/ASC entraîne des effets pathologiques sur les fonctions mitochondriales et l’intégrité de l’ADN, qui sont abolis par l’induction de Nrf2. Il en ressort que Nrf2 joue un rôle majeur dans la protection de l’épithélium intestinal contre le stress oxydant.

Ethical Considerations of Dissemination and Restitution of Findings in Global Health Research

Étude de cas / Case study

Augmenter la vitesse d'administration de la cocaïne facilite le développement d'une motivation exacerbée pour la drogue ne pouvant pas être expliquée uniquement par la quantité de drogue consommée ou l'étendue de l'entraînement opérant.

Les voies d'administration qui provoquent une entrée rapide de la drogue au cerveau sont connues pour faciliter le développement de la toxicomanie. Les études animales modélisant cet effet ont montré que des rats, qui ont un accès prolongé à des injections intraveineuses rapides de cocaïne (injectée en 5 ou 90 secondes), s'autoadministrent plus de drogue, ont un entraînement opérant plus élevé et sont subséquemment plus motivés à obtenir la cocaïne. La question est maintenant de savoir comment l'autoadministration de cocaïne injectée rapidement promeut une augmentation de la motivation à obtenir de la cocaïne. Cette motivation exagérée pourrait être une conséquence de l'exposition prolongée à de larges quantités de cocaïne et/ou de l'effet persistant d'un entraînement opérant extensif. De plus, on sait qu'augmenter la vitesse d'administration de la cocaïne modifie les circuits de la récompense et de la motivation. Ainsi, ceci pourrait promouvoir la motivation excessive pour la drogue. Nous avons cherché à déterminer l'influence de l'exposition à la drogue et de l'entraînement opérant sur le développement d'une motivation exacerbée pour la drogue. Les rats se sont autoadministrés de la cocaïne injectée en 5 ou 90 secondes (s) durant un accès limité (1h/session) ou prolongé (6h/session) avec un ratio fixe. La motivation pour la cocaïne a par la suite été évaluée à l'aide d'un ratio progressif (PR). Les rats ayant reçu la drogue injectée en 5 s durant l'accès prolongé (par rapport au groupe 90 secondes) ont pris plus de drogue et eu un entraînement opérant plus extensif alors qu'il n'y avait pas de différences dans la consommation et le niveau d'entraînement opérant entre les groupes ayant subit un accès limité uniquement. Les rats ayant consommé la drogue injectée en 5s, indépendamment du temps d'accès, ont toujours exprimé une motivation plus grande pour la drogue en PR. La quantité de cocaïne consommée ou l'ampleur de l'entraînement opérant ont été positivement corrélés avec la consommation de cocaïne en PR dans certains groupes. Par contre, le groupe qui a eu un accès prolongé aux injections rapides a montré une augmentation dans sa motivation à s'autoadministrer de la drogue qui n'était prédite ni par la quantité de cocaïne consommée ni par l'étendue de l'entraînement opérant. Ces résultats suggèrent que des injections rapide de cocaïne pourraient faciliter la toxicomanie en favorisant entre autre des modifications neurobiologiques qui mènent à une motivation pathologique pour la drogue.