Bases moléculaires et cellulaires d’un trouble neurodéveloppemental causé par l’haploinsuffisance de SYNGAP1.

La déficience intellectuelle est la cause d’handicap la plus fréquente chez l’enfant. De nombreuses évidences convergent vers l’idée selon laquelle des altérations dans les gènes synaptiques puissent expliquer une fraction significative des affections neurodéveloppementales telles que la déficience intellectuelle ou encore l’autisme. Jusqu’à récemment, la majorité des mutations associées à la déficience intellectuelle a été liée au chromosome X ou à la transmission autosomique récessive. D’un autre côté, plusieurs études récentes suggèrent que des mutations de novo dans des gènes à transmission autosomique dominante, requis dans les processus de la plasticité synaptique peuvent être à la source d’une importante fraction des cas de déficience intellectuelle non syndromique. Par des techniques permettant la capture de l’exome et le séquençage de l’ADN génomique, notre laboratoire a précédemment reporté les premières mutations pathogéniques dans le gène à transmission autosomique dominante SYNGAP1. Ces dernières ont été associées à des troubles comportementaux tels que la déficience intellectuelle, l’inattention, des problèmes d’humeur, d’impulsivité et d’agressions physiques. D’autres patients sont diagnostiqués avec des troubles autistiques et/ou des formes particulières d’épilepsie généralisée. Chez la souris, le knock-out constitutif de Syngap1 (souris Syngap1+/-) résulte en des déficits comme l’hyperactivité locomotrice, une réduction du comportement associée à l’anxiété, une augmentation du réflexe de sursaut, une propension à l’isolation, des problèmes dans le conditionnement à la peur, des troubles dans les mémoires de travail, de référence et social. Ainsi, la souris Syngap1+/- représente un modèle approprié pour l’étude des effets délétères causés par l’haploinsuffisance de SYNGAP1 sur le développement de circuits neuronaux. D’autre part, il est de première importance de statuer si les mutations humaines aboutissent à l’haploinsuffisance de la protéine. SYNGAP1 encode pour une protéine à activité GTPase pour Ras. Son haploinsuffisance entraîne l’augmentation des niveaux d’activité de Ras, de phosphorylation de ERK, cause une morphogenèse anormale des épines dendritiques et un excès dans la concentration des récepteurs AMPA à la membrane postsynaptique des neurones excitateurs. Plusieurs études suggèrent que l’augmentation précoce de l’insertion des récepteurs AMPA au sein des synapses glutamatergiques contribue à certains phénotypes observés chez la souris Syngap1+/-. En revanche, les conséquences de l’haploinsuffisance de SYNGAP1 sur les circuits neuronaux GABAergiques restent inconnues. Les enjeux de mon projet de PhD sont: 1) d’identifier l’impact de mutations humaines dans la fonction de SYNGAP1; 2) de déterminer si SYNGAP1 contribue au développement et à la fonction des circuits GABAergiques; 3) de révéler comment l’haploinsuffisance de Syngap1 restreinte aux circuits GABAergiques affecte le comportement et la cognition. Nous avons publié les premières mutations humaines de type faux-sens dans le gène SYNGAP1 (c.1084T>C [p.W362R]; c.1685C>T [p.P562L]) ainsi que deux nouvelles mutations tronquantes (c.2212_2213del [p.S738X]; c.283dupC [p.H95PfsX5]). Ces dernières sont toutes de novo à l’exception de c.283dupC, héritée d’un père mosaïque pour la même mutation. Dans cette étude, nous avons confirmé que les patients pourvus de mutations dans SYNGAP1 présentent, entre autre, des phénotypes associés à des troubles comportementaux relatifs à la déficience intellectuelle. En culture organotypique, la transfection biolistique de l’ADNc de Syngap1 wild-type dans des cellules pyramidales corticales réduit significativement les niveaux de pERK, en fonction de l’activité neuronale. Au contraire les constructions plasmidiques exprimant les mutations W362R, P562L, ou celle précédemment répertoriée R579X, n’engendre aucun effet significatif sur les niveaux de pERK. Ces résultats suggèrent que ces mutations faux-sens et tronquante résultent en la perte de la fonction de SYNGAP1 ayant fort probablement pour conséquences d’affecter la régulation du développement cérébral. Plusieurs études publiées suggèrent que les déficits cognitifs associés à l’haploinsuffisance de SYNGAP1 peuvent émerger d’altérations dans le développement des neurones excitateurs glutamatergiques. Toutefois, si, et auquel cas, de quelle manière ces mutations affectent le développement des interneurones GABAergiques résultant en un déséquilibre entre l’excitation et l’inhibition et aux déficits cognitifs restent sujet de controverses. Par conséquent, nous avons examiné la contribution de Syngap1 dans le développement des circuits GABAergiques. A cette fin, nous avons généré une souris mutante knockout conditionnelle dans laquelle un allèle de Syngap1 est spécifiquement excisé dans les interneurones GABAergiques issus de l’éminence ganglionnaire médiale (souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+). En culture organotypique, nous avons démontré que la réduction de Syngap1 restreinte aux interneurones inhibiteurs résulte en des altérations au niveau de leur arborisation axonale et dans leur densité synaptique. De plus, réalisés sur des coupes de cerveau de souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+, les enregistrements des courants inhibiteurs postsynaptiques miniatures (mIPSC) ou encore de ceux évoqués au moyen de l’optogénétique (oIPSC) dévoilent une réduction significative de la neurotransmission inhibitrice corticale. Enfin, nous avons comparé les performances de souris jeunes adultes Syngap1+/-, Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+ à celles de leurs congénères contrôles dans une batterie de tests comportementaux. À l’inverse des souris Syngap1+/-, les souris Tg(Nkx2.1-Cre);Syngap1flox/+ ne présentent pas d’hyperactivité locomotrice, ni de comportement associé à l’anxiété. Cependant, elles démontrent des déficits similaires dans la mémoire de travail et de reconnaissance sociale, suggérant que l’haploinsuffisance de Syngap1 restreinte aux interneurones GABAergiques dérivés de l’éminence ganglionnaire médiale récapitule en partie certains des phénotypes cognitifs observés chez la souris Syngap1+/-. Mes travaux de PhD établissent pour la première fois que les mutations humaines dans le gène SYNGAP1 associés à la déficience intellectuelle causent la perte de fonction de la protéine. Mes études dévoilent, également pour la première fois, l’influence significative de ce gène dans la régulation du développement et de la fonction des interneurones. D’admettre l’atteinte des cellules GABAergiques illustre plus réalistement la complexité de la déficience intellectuelle non syndromique causée par l’haploinsuffisance de SYNGAP1. Ainsi, seule une compréhension raffinée de cette condition neurodéveloppementale pourra mener à une approche thérapeutique adéquate.

Integron study, molecular typing and characterization of Salmonella serotypes isolated from seafood and poultry

The primary habitat of Salmonella is the gastrointestinal tract of animals and they are discharged into the water bodies through the feces. Aquatic animals act as asymptomatic reservoirs of a wide range of Salmonella serotypes. The inevitable delay in the detection of Salmonella contamination and the low sensitivity of the conventional methods is a serious issue in the seafood industry. Due to the indiscriminate use, the antibiotics are finally accumulated in the aquatic environment which provides the required antibiotic stress for the emergence of more and more antibiotic resistant phenotypes ofSalmonella. Several genetic determinants like integrons, genomic islands etc. play their role in acquisition and reshuffling of antibiotic resistance genes. A large number of virulence determinants are required for Salmonella pathogenicity. The virulence potential of Salmonella is determined, to some extent, by the presence of phages or phage mediated genes in the bacterial genome. There is much intra-serotype polymorphism in Salmonella and epidemiological studies rely on genetic resemblance of the isolated strains. Proper identification of the strain employing the traditional and molecular techniques is a prerequisite for accurate epidemiological studies (Soto et al., 2000). In this context, a study was undertaken to determine the prevalence of different Salmonella serotypes in seafood and to characterize them

Molecular studies on a Dictyostelium homolog of the tafazzin gene, the cause of Barth syndrome in humans

Der eukaryotische Mikroorganismus Dictyostelium discoideum lebt als einzellige Amöbe solange ausreichende Nahrungsressourcen zur Verfügung stehen. Sobald Nahrungsmangel eintritt, entwickeln sich die Zellen von einem einzelligen zu einem mehrzelligen Zustand, der mit einem multizellulären Fruchtkörper abschließt. Dieser Prozess wird durch eine Reihe aufeinanderfolgender Signale organisiert, die eine differentielle Genexpression regulieren. Die Gene der Discoidin I Familie gehören zu den Ersten, die im Laufe des Wachstums-Differenzierungs-Übergangs (engl. GDT) aktiviert werden. Sie eignen sich daher vorzüglich als Marker für den Beginn der Entwicklung. Mit Hilfe einer REMI-Mutagenese und Discoidin I als molekularem Marker sind verschiedene Komponenten des Wachstums-Differenzierungs-Übergangs in unserer Arbeitsgruppe identifiziert worden (Zeng et al., 2000 A und B; Riemann und Nellen, persönliche Mitteilung). Mit demselben Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit eine REMI-Mutante identifiziert, die eine Fehl-Expression von Discoidin zeigte und einen axenischen Wachstumsdefekt bei 15 °C aufwies. Das Gen wurde als Homolog zum humanen Tafazzin-Gen identifiziert. Dieses Gen wurde zur Rekonstruktion des Phänotyps über homologe Rekombination erneut disruptiert, was wie erwartet zu dem zuerst beschriebenen Phänotyp führte. Folgerichtig ergab eine Überexpression des Gens in den Mutanten eine Komplementation des Phänotyps. Immunfluoreszenz-Experimente zeigten eine mitochondriale Lokalisation des Dictyostelium discoideum Taffazzin Proteins. Dass ein mitochondriales Protein in Zusammenhang mit dem Wachstums-Differenzierungs-Übergang steht, ist ein unerwarteter Befund, der aber als Hinweis darauf gewertet werden kann, dass Mitochondrien einen direkten Einfluss auf die entwicklungsspezifische Signaltransduktion ausüben. Die Taffazzin Disruptions-Mutante in Dictyostelium führte zu einem abnormalen Cardiolipin Metabolismus. Dieses Phospholipid ist ein charakteristischer Bestandteil der inneren Mitochondrienmembran und für die Funktion verschiedener Enzyme erforderlich. Unsere vorläufigen Analysen des Phospholipid-Gehalts zeigten Übereinstimmung mit Daten von Patienten mit Barth-Syndrom, einer humanen Erkrankung, bei der das Taffazzin-Gen Mutationen aufweist, und mit Hefe-Mutanten dieses Gens. Dies zeigt den Wert von Dictyostelium discoideum als einen weiteren Modelorganismus zur Untersuchung des Barth-Syndroms und zur Erprobung möglicher Therapieansätze.

Biblische, mythische und fremde Frauen

In the texts and illustrations of medieval Mappae mundi, women are represented in three different roles: as biblical or Christian characters (such as Eve in the Garden of Eden, Lot's wife and female saints), as legendary or mythical figures (e.g. the Queen of Sheba, mermaids) and as 'other' creatures with a deviant behaviour from the European norm (e.g. Amazons). The principal goal of this study is to analyse the different strategies that were developed by male European observers to project a filtered image of woman in the selective medium of cartography from the tenth to the fifteenth century.

Heterochromatin und epigenetische Kontrolle der Centromere in Dictyostelium discoideum

Heterochromatin Protein 1 (HP1) is an evolutionarily conserved protein required for formation of a higher-order chromatin structures and epigenetic gene silencing. The objective of the present work was to functionally characterise HP1-like proteins in Dictyostelium discoideum, and to investigate their function in heterochromatin formation and transcriptional gene silencing. The Dictyostelium genome encodes three HP1-like proteins (hcpA, hcpB, hcpC), from which only two, hcpA and hcpB, but not hcpC were found to be expressed during vegetative growth and under developmental conditions. Therefore, hcpC, albeit no obvious pseudogene, was excluded from this study. Both HcpA and HcpB show the characteristic conserved domain structure of HP1 proteins, consisting of an N-terminal chromo domain and a C-terminal chromo shadow domain, which are separated by a hinge. Both proteins show all biochemical activities characteristic for HP1 proteins, such as homo- and heterodimerisation in vitro and in vivo, and DNA binding activtity. HcpA furthermore seems to bind to K9-methylated histone H3 in vitro. The proteins thus appear to be structurally and functionally conserved in Dictyostelium. The proteins display largely identical subnuclear distribution in several minor foci and concentration in one major cluster at the nuclear periphery. The localisation of this cluster adjacent to the nucleus-associated centrosome and its mitotic behaviour strongly suggest that it represents centromeric heterochromatin. Furthermore, it is characterised by histone H3 lysine-9 dimethylation (H3K9me2), which is another hallmark of Dictyostelium heterochromatin. Therefore, one important aspect of the work was to characterise the so-far largely unknown structural organisation of centromeric heterochromatin. The Dictyostelium homologue of inner centromere protein INCENP (DdINCENP), co-localized with both HcpA and H3K9me2 during metaphase, providing further evidence that H3K9me2 and HcpA/B localisation represent centromeric heterochromatin. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) showed that two types of high-copy number retrotransposons (DIRS-1 and skipper), which form large irregular arrays at the chromosome ends, which are thought to contain the Dictyostelium centromeres, are characterised by H3K9me2. Neither overexpression of full-length HcpA or HcpB, nor deletion of single Hcp isoforms resulted in changes in retrotransposon transcript levels. However, overexpression of a C-terminally truncated HcpA protein, assumed to display a dominant negative effect, lead to an increase in skipper retrotransposon transcript levels. Furthermore, overexpression of this protein lead to severe growth defects in axenic suspension culture and reduced cell viability. In order to elucidate the proteins functions in centromeric heterochromatin formation, gene knock-outs for both hcpA and hcpB were generated. Both genes could be successfully targeted and disrupted by homologous recombination. Surprisingly, the degree of functional redundancy of the two isoforms was, although not unexpected, very high. Both single knock-out mutants did not show any obvious phenotypes under standard laboratory conditions and only deletion of hcpA resulted in subtle growth phenotypes when grown at low temperature. All attempts to generate a double null mutant failed. However, both endogenous genes could be disrupted in cells in which a rescue construct that ectopically expressed one of the isoforms either with N-terminal 6xHis- or GFP-tag had been introduced. The data imply that the presence of at least one Hcp isoform is essential in Dictyostelium. The lethality of the hcpA/hcpB double mutant thus greatly hampered functional analysis of the two genes. However, the experiment provided genetic evidence that the GFP-HcpA fusion protein, because of its ability to compensate the loss of the endogenous HcpA protein, was a functional protein. The proteins displayed quantitative differences in dimerisation behaviour, which are conferred by the slightly different hinge and chromo shadow domains at the C-termini. Dimerisation preferences in increasing order were HcpA-HcpA << HcpA-HcpB << HcpB-HcpB. Overexpression of GFP-HcpA or a chimeric protein containing the HcpA C-terminus (GFP-HcpBNAC), but not overexpression of GFP-HcpB or GFP-HcpANBC, lead to increased frequencies of anaphase bridges in late mitotic cells, which are thought to be caused by telomere-telomere fusions. Chromatin targeting of the two proteins is achieved by at least two distinct mechanisms. The N-terminal chromo domain and hinge of the proteins are required for targeting to centromeric heterochromatin, while the C-terminal portion encoding the CSD is required for targeting to several other chromatin regions at the nuclear periphery that are characterised by H3K9me2. Targeting to centromeric heterochromatin likely involves direct binding to DNA. The Dictyostelium genome encodes for all subunits of the origin recognition complex (ORC), which is a possible upstream component of HP1 targeting to chromatin. Overexpression of GFP-tagged OrcB, the Dictyostelium Orc2 homologue, showed a distinct nuclear localisation that partially overlapped with the HcpA distribution. Furthermore, GFP-OrcB localized to the centrosome during the entire cell cycle, indicating an involvement in centrosome function. DnmA is the sole DNA methyltransferase in Dictyostelium required for all DNA(cytosine-)methylation. To test for its in vivo activity, two different cell lines were established that ectopically expressed DnmA-myc or DnmA-GFP. It was assumed that overexpression of these proteins might cause an increase in the 5-methyl-cytosine(5-mC)-levels in the genomic DNA due to genomic hypermethylation. Although DnmA-GFP showed preferential localisation in the nucleus, no changes in the 5-mC-levels in the genomic DNA could be detected by capillary electrophoresis.

Characterization of DnmA, the Dnmt2 homolog in Dictyostelium discoideum

Eukaryotic DNA m5C methyltransferases (MTases) play a major role in many epigenetic regulatory processes like genomic imprinting, X-chromosome inactivation, silencing of transposons and gene expression. Members of the two DNA m5C MTase families, Dnmt1 and Dnmt3, are relatively well studied and many details of their biological functions, biochemical properties as well as interaction partners are known. In contrast, the biological functions of the highly conserved Dnmt2 family, which appear to have non-canonical dual substrate specificity, remain enigmatic despite the efforts of many researchers. The genome of the social amoeba Dictyostelium encodes Dnmt2-homolog, the DnmA, as the only DNA m5C MTase which allowed us to study Dnmt2 function in this organism without interference by the other enzymes. The dnmA gene can be easily disrupted but the knock-out clones did not show obvious phenotypes under normal lab conditions, suggesting that the function of DnmA is not vital for the organism. It appears that the dnmA gene has a low expression profile during vegetative growth and is only 5-fold upregulated during development. Fluorescence microscopy indicated that DnmA-GFP fusions were distributed between both the nucleus and cytoplasm with some enrichment in nuclei. Interestingly, the experiments showed specific dynamics of DnmA-GFP distribution during the cell cycle. The proteins colocalized with DNA in the interphase and were mainly removed from nuclei during mitosis. DnmA functions as an active DNA m5C MTase in vivo and is responsible for weak but detectable DNA methylation of several regions in the Dictyostelium genome. Nevertheless, gel retardation assays showed only slightly higher affinity of the enzyme to dsDNA compared to ssDNA and no specificity towards various sequence contexts, although weak but detectable specificity towards AT-rich sequences was observed. This could be due to intrinsic curvature of such sequences. Furthermore, DnmA did not show denaturant-resistant covalent complexes with dsDNA in vitro, although it could form covalent adducts with ssDNA. Low binding and methyltransfer activity in vitro suggest the necessity of additional factor in DnmA function. Nevertheless, no candidates could be identified in affinity purification experiments with different tagged DnmA fusions. In this respect, it should be noted that tagged DnmA fusion preparations from Dictyostelium showed somewhat higher activity in both covalent adduct formation and methylation assays than DnmA expressed in E.coli. Thus, the presence of co-purified factors cannot be excluded. The low efficiency of complex formation by the recombinant enzyme and the failure to define interacting proteins that could be required for DNA methylation in vivo, brought up the assumption that post-translational modifications could influence target recognition and enzymatic activity. Indeed, sites of phosphorylation, methylation and acetylation were identified within the target recognition domain (TRD) of DnmA by mass spectrometry. For phosphorylation, the combination of MS data and bioinformatic analysis revealed that some of the sites could well be targets for specific kinases in vivo. Preliminary 3D modeling of DnmA protein based on homology with hDNMT2 allowed us to show that several identified phosphorylation sites located on the surface of the molecule, where they would be available for kinases. The presence of modifications almost solely within the TRD domain of DnmA could potentially modulate the mode of its interaction with the target nucleic acids. DnmA was able to form denaturant-resistant covalent intermediates with several Dictyostelium tRNAs, using as a target C38 in the anticodon loop. The formation of complexes not always correlated with the data from methylation assays, and seemed to be dependent on both sequence and structure of the tRNA substrate. The pattern, previously suggested by the Helm group for optimal methyltransferase activity of hDNMT2, appeared to contribute significantly in the formation of covalent adducts but was not the only feature of the substrate required for DnmA and hDNMT2 functions. Both enzymes required Mg2+ to form covalent complexes, which indicated that the specific structure of the target tRNA was indispensable. The dynamics of covalent adduct accumulation was different for DnmA and different tRNAs. Interestingly, the profiles of covalent adduct accumulation for different tRNAs were somewhat similar for DnmA and hDNMT2 enzymes. According to the proposed catalytic mechanism for DNA m5C MTases, the observed denaturant-resistant complexes corresponded to covalent enamine intermediates. The apparent discrepancies in the data from covalent complex formation and methylation assays may be interpreted by the possibility of alternative pathways of the catalytic mechanism, leading not to methylation but to exchange or demethylation reactions. The reversibility of enamine intermediate formation should also be considered. Curiously, native gel retardation assays showed no or little difference in binding affinities of DnmA to different RNA substrates and thus the absence of specificity in the initial enzyme binding. The meaning of the tRNA methylation as well as identification of novel RNA substrates in vivo should be the aim of further experiments.

Biologische Funktionsanalyse und Identifizierung neuer Substrate der Methyltransferase Dnmt2

Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie gehört, ist ihre biologische Funktion nach wie vor unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte, wurde vor einigen Jahren über geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der “Dnmt2-only”-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit später robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde zunächst eine Dualspezifität des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum 5mC-Status verschiedener „Dnmt2-only“-Organismen bilden Anlass für kontroverse Diskussionen über Ausmaß und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivität von Dnmt2 (Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011). Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC) MTase in vitro und in vivo. Zusätzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem Kooperationsprojekt wurde außerdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivität für das Dnmt2-Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen. Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen (RNA-CLIP) mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verstärkt angereichert. Inwiefern diese Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen, ist noch ungeklärt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas kürzer, jedoch exakt komplementär zu den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC) vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro Methylierungsstudien konnte ausschließlich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden. Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen können, wurde ein System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal häufiger genutzt als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Amöbe kodiert. Aus diesem Grund wurde zusätzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abhängige Methylierung dieser tRNA das „Wobbling“ beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und (GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in beiden Stämmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht erhöhte Translationseffizienz der Reportergene. Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war. Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erhöhten Transkription des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden. In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. Möglicherweise fällt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen vermutet wird, dass diese für die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivität als konservierte Dnmt2-Funktion. Darüber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Außerdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA Substrat vorgeschlagen. Zusätzlich geben neu entdeckte Phänotypen Hinweise auf vielfältige zelluläre Dnmt2-Funktionen.

Loss of Anticodon Wobble Uridine Modifications Affects tRNALys Function and Protein Levels in Saccharomyces cerevisiae

In eukaryotes, wobble uridines in the anticodons of tRNALysUUU, tRNAGluUUC and tRNAGlnUUG are modified to 5-methoxy-carbonyl-methyl-2-thio-uridine (mcm5s2U). While mutations in subunits of the Elongator complex (Elp1-Elp6), which disable mcm5 side chain formation, or removal of components of the thiolation pathway (Ncs2/Ncs6, Urm1, Uba4) are individually tolerated, the combination of both modification defects has been reported to have lethal effects on Saccharomyces cerevisiae. Contrary to such absolute requirement of mcm5s2U for viability, we demonstrate here that in the S. cerevisiae S288C-derived background, both pathways can be simultaneously inactivated, resulting in combined loss of tRNA anticodon modifications (mcm5U and s2U) without a lethal effect. However, an elp3 disruption strain displays synthetic sick interaction and synergistic temperature sensitivity when combined with either uba4 or urm1 mutations, suggesting major translational defects in the absence of mcm5s2U modifications. Consistent with this notion, we find cellular protein levels drastically decreased in an elp3uba4 double mutant and show that this effect as well as growth phenotypes can be partially rescued by excess of tRNALysUUU. These results may indicate a global translational or protein homeostasis defect in cells simultaneously lacking mcm5 and s2 wobble uridine modification that could account for growth impairment and mainly originates from tRNALysUUU hypomodification and malfunction.

El papel de la OEA en el proceso de desarme, desmovilización y reinserción de excombatientes en Colombia

Desde el año 2004 la Organización de Estados Americanos, a través de su Misión de Acompañamiento al Proceso de Paz –MAPP/OEA- en Colombia, estableció una cooperación técnica para hacer un seguimiento, acompañamiento y monitoreo al proceso de Desarme, Desmovilización y Reintegración –DDR- de los miembros de los grupos armados ilegales del país, en particular de las Autodefensas Unidas de Colombia (paramilitares) . Su trabajo ha permitido un conocimiento público del proceso con el grupo irregular y además está sirviendo como herramienta de aprendizaje para otros casos de DDR actuales y futuros.

Identificación y caracterización de las mutaciones en el gen GAA en pacientes colombianos afectados por la enfermedad de Pompe

La Enfermedad de Pompe (EP) es un desorden metabólico caracterizado por la deficiencia de alfa-glucosidasa acida (GAA), una enzima que cataliza la hidrolisis de las uniones glucosidicas α-1.4 y α-1,6 de glucógeno. Esta deficiencia resulta en acumulación de glucógeno en todos los tejidos, especialmente en musculo esquelético. Los pacientes con EP muestran un gran espectro de fenotipos con respecto a la edad de inicio, progresión de la enfermedad, severidad y tasa de progresión a muerte. El curso clínico de la enfermedad es principalmente determinado por la naturaleza de las variaciones genéticas de GAA quellevan a diferentes grados de deficiencia enzimática. Hasta la fecha alrededor de 400 distintas variaciones en la secuencia de GAA han sido descritas, y en algunos casos la correlación genotipo-fenotipo no es claramente evidente. En este estudio se describe el primer análisis genético y clínico de pacientes colombianos con EP en 13 individuos afectados. La secuenciación directa del gen GAA, revelo ocho distintas mutaciones relacionadas con la etiología de EP incluyendo dos nuevas mutaciones missense c.1106T>C (p.Leu369Pro) y c.2236T >C (p. Trp746Arg). Estudios funcionales in vitro mostraron que los cambios estructurales conferidos por ambas mutaciones no inhiben la síntesis del precursor de GAA de 110 KD pero afectan el procesamiento y el transporte intra-celular de la proteína.

Tolerancia de los estudiantes de Pregrado ante los comportamientos desviados en el aula de clase: un estudio comparativo

Los comportamientos desviados de los estudiantes a lo largo de su formación académica son más frecuentes de lo que se cree. Sin embargo, detrás del simple hecho de infringir una norma establecida por alguna Institución Educativa, hay una serie de construcciones sociales que se gestan alrededor de esta situación, y sobre esto es importante ahondar. En efecto, el enfoque del presente estudio es encontrar la postura y tolerancia que tienen los estudiantes de dos Facultades diferentes frente al fraude académico y tratar de encontrar las posibles causas a esa tolerancia ante las acciones desviadas. Además, se hará un énfasis especial en la Facultad de Administración, dado la importancia y relevancia que tienen los egresados de este programa académico en el desarrollo económico de un país.

Clasificación de la epilepsia

Clasificación de la epilepsia. Basada en la ILAE, descripción semiologica y hallazgos electroencefalograficos.

Functional studies of the deubiquitinating enzymes USP19, USP4 and UCH-L1

El marcaje de proteínas con ubiquitina, conocido como ubiquitinación, cumple diferentes funciones que incluyen la regulación de varios procesos celulares, tales como: la degradación de proteínas por medio del proteosoma, la reparación del ADN, la señalización mediada por receptores de membrana, y la endocitosis, entre otras (1). Las moléculas de ubiquitina pueden ser removidas de sus sustratos gracias a la acción de un gran grupo de proteasas, llamadas enzimas deubiquitinizantes (DUBs) (2). Las DUBs son esenciales para la manutención de la homeostasis de la ubiquitina y para la regulación del estado de ubiquitinación de diferentes sustratos. El gran número y la diversidad de DUBs descritas refleja tanto su especificidad como su utilización para regular un amplio espectro de sustratos y vías celulares. Aunque muchas DUBs han sido estudiadas a profundidad, actualmente se desconocen los sustratos y las funciones biológicas de la mayoría de ellas. En este trabajo se investigaron las funciones de las DUBs: USP19, USP4 y UCH-L1. Utilizando varias técnicas de biología molecular y celular se encontró que: i) USP19 es regulada por las ubiquitin ligasas SIAH1 y SIAH2 ii) USP19 es importante para regular HIF-1α, un factor de transcripción clave en la respuesta celular a hipoxia, iii) USP4 interactúa con el proteosoma, iv) La quimera mCherry-UCH-L1 reproduce parcialmente los fenotipos que nuestro grupo ha descrito previamente al usar otros constructos de la misma enzima, y v) UCH-L1 promueve la internalización de la bacteria Yersinia pseudotuberculosis.

Genomic architecture of adaptive color pattern divergence and convergence in Heliconius butterflies

Identifying the genetic changes driving adaptive variation in natural populations is key to understanding the origins of biodiversity. The mosaic of mimetic wing patterns in Heliconius butterflies makes an excellent system for exploring adaptive variation using next-generation sequencing. In this study, we use a combination of techniques to annotate the genomic interval modulating red color pattern variation, identify a narrow region responsible for adaptive divergence and convergence in Heliconius wing color patterns, and explore the evolutionary history of these adaptive alleles. We use whole genome resequencing from four hybrid zones between divergent color pattern races of Heliconius erato and two hybrid zones of the co-mimic Heliconius melpomene to examine genetic variation across 2.2 Mb of a partial reference sequence. In the intergenic region near optix, the gene previously shown to be responsible for the complex red pattern variation in Heliconius, population genetic analyses identify a shared 65-kb region of divergence that includes several sites perfectly associated with phenotype within each species. This region likely contains multiple cis-regulatory elements that control discrete expression domains of optix. The parallel signatures of genetic differentiation in H. erato and H. melpomene support a shared genetic architecture between the two distantly related co-mimics; however, phylogenetic analysis suggests mimetic patterns in each species evolved independently. Using a combination of next-generation sequencing analyses, we have refined our understanding of the genetic architecture of wing pattern variation in Heliconius and gained important insights into the evolution of novel adaptive phenotypes in natural populations.

What is next after the genes for autoimmunity?

Clinical pathologies draw us to envisage disease as either an independent entity or a diverse set of traits governed by common physiopathological mechanisms, prompted by environmental assaults throughout life. Autoimmune diseases are not an exception, given they represent a diverse collection of diseases in terms of their demographic profile and primary clinical manifestations. Although they are pleiotropic outcomes of non-specific disease genes underlying similar immunogenetic mechanisms, research generally focuses on a single disease. Drastic technologic advances are leading research to organize clinical genomic multidisciplinary approaches to decipher the nature of human biological systems. Once the currently costly omic-based technologies become universally accessible, the way will be paved for a cleaner picture to risk quantification, prevention, prognosis and diagnosis, allowing us to clearly define better phenotypes always ensuring the integrity of the individuals studied. However, making accurate predictions for most autoimmune diseases is an ambitious challenge, since the understanding of these pathologies is far from complete. Herein, some pitfalls and challenges of the genetics of autoimmune diseases are reviewed, and an approximation to the future of research in this field is presented.