Electrogenic proton/L-glutamate symport in isolated asparagus sprengeri mesophyll cell

Medium' alkaliniiation occurred -lipon the addition of L-Glu to mechanically isolated Asparagus sprenger-i mesophyll cells suspended in 1 mM CaS04. Alkalinization resulted from the coupled entry of H+ and L-Glu anion into the cells. This H+ IL-Glu symport did not stimulate K+ efflux. K+ efflux has been observed during H~ lamino acid symport in other systems. The stimulation of K+ efflux by proton coupled symport is regarded as an indicator of a plasma membrane depolarizing electrogenic symport process. H+ IL-Glu symport in Asparagus sprengerimesophyl1 cells was investigated to determine whether or not the process was electrogenic. The rate of uptake of 0.25 11M 3H-MTPP+ ( Methyltriphenylphosphonium, methyl-3H ) is a probe for monitoring changes in the membrane potential. 3HMTPP+ uptake was reduced by K+ or CCCP, agents known to depolarize the membrane potential. Uptake of 3H-MTPP+ was also inhibited by L-Glu but not by D-Glu. Conversely, 10 mM external MTPP+ inhibited the uptake of 14C-U-LGlu. Simultaneous measurements of the rates of 14C-U-L-Glu uptake and L-Glu dependent H+ influx showed that the molar stoichiometry of H+ IL-Glu symport was 2 to 1. K+ or Na+ stimulated H+ efflux was completely inhibited by DCCD, DES, oligomycin and antimycin reagents which inhibit ATP driven H+ efflux. The H+ efflux \Vas also stimulate.d by the weak acids, butyric acid and acetic acid, which are known fo-aCidify the cytoplasm. This weak acid stimulated H+ efflux was also completely inhibited by oligomycin. It was calculated that net L-Glu dependent H+ influx increased by 100% in the presence of oligomycin and that despite net medium alkalinization H+ IL-Glu symport stimulates ATP dependent H+ efflux. 11 The data presented in this study indicate that H+ IL-Glu symport is electrogenic. The data also show that ATP dependent Ht efflux rather than K+ efflux is the- process compensating for thi~ electrogenic H+ IL-Glu symport.

Heterogeneity of photosystem II as it occurs in domain specific regions of the thylakoid membrane of spinach (spinacia oleracia L.)

Thylakoid membrane fractions were prepared from specific regions of thylakoid membranes of spinach (Spinacia oleracea). These fractions, which include grana (83), stroma (T3), grana core (8S), margins (Ma) and purified stroma (Y100) were prepared using a non-detergent method including a mild sonication and aqueous two-phase partitioning. The significance of PSlla and PSII~ centres have been described extensively in the literature. Previous work has characterized two types of PSII centres which are proposed to exist in different regions of the thylakoid membrane. a-centres are suggested to aggregate in stacked regions of grana whereas ~-centres are located in unstacked regions of stroma lamellae. The goal of this study is to characterize photosystem II from the isolated membrane vesicles representing different regions of the higher plant thylakoid membrane. The low temperature absorption spectra have been deconvoluted via Gaussian decomposition to estimate the relative sub-components that contribute to each fractions signature absorption spectrum. The relative sizes of the functional PSII antenna and the fluorescence induction kinetics were measured and used to determine the relative contributions of PSlla and PSII~ to each fraction. Picosecond chlorophyll fluorescence decay kinetics were collected for each fraction to characterize and gain insight into excitation energy transfer and primary electron transport in PSlla and PSII~ centres. The results presented here clearly illustrate the widely held notions of PSII/PS·I and PSlIa/PSII~ spatial separation. This study suggests that chlorophyll fluorescence decay lifetimes of PSII~ centres are shorter than those of PSlIa centres and, at FM, the longer lived of the two PSII components renders a larger yield in PSlIa-rich fractions, but smaller in PSIlr3-rich fractions.

Isolation and partial characterization of host cell wall surface glycoproteins: their involvement in agglutination, attachment and appressorium formation by piptocephalis virginiana

Cell surface proteins obtained by alkaline extraction from isolated cell walls of Mortierella pusilla and M. candelabrum, host and nonhost, respectively, to the mycoparasite, Piptocephalis virginiana, were tested for their ability to agglutinate mycoparasite spores. The host cell wall protein extract had a high agglutinating activity (788 a.u. mg- t ) as compared with the nonhost extract (21 a.li. mg- t ). SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the cell wall proteins revealed four protein bands, a, b, c, and d (Mr 117, 100, 85 and 64 kd, respectively) at the host surface, but not at the nonhost surface, except for the faint band c. Deletion of proteins b or c from the host cell wall protein extract significantly reduced its agglutinating activity. Proteins band c, obtained as purified preparations by a series of procedures, were shown to be two glycoproteins. Carbohydrate analysis by gas chromatography demonstrated that glucose and Nacetylglucosamine were the major carbohydrate components of the glycoproteins. It was further shown that the agglutinating activity of the pure preparation containing both band c was 500-850 times that of the single glycoproteins, suggesting the involvement of both glycoproteins in agglutination. The results suggest that the glycoproteins band c are the two subunits of agglutinin present at the host cell surface. The two glycoproteins band c purified from the host cell wall protein extract were further examined after various treatments for their possible role in agglutination, attachment and appressorium formation by the mycoparasite. Results obtained by agglutination and attachment tests showed: (1) the two glycoprotein-s are not only an agglutinin responsible for the mycoparasite spore agglutination, but may also serve as a receptor for the specific recognition, attachment and appressorium formation by the mycoparasite; (2) treatment of the rnycoparasite spores with various sugars revealed that arabinose, glucose and N-acetylglucosamine inhibited the agglutination and attachment activity of the glycoproteins, however, the relative percentage of appressorium formation was not affected by the above sugars; (3) the two glycoproteins are relatively stable with respect to their agglutinin and receptor functions. The present results suggest that the agglutination and attachment may be mediated directly by certain sugars present at the host and mycoparasite cell surfaces while the appressorlum formation may be the response of complementary combinations of both sugar and protein, the two parts of the glycoproteins at the interacting surfaces of two fungi.

Pigment orientation changes detected by low temperature linear dichroism spectroscopy: cold-hardening transition in phycobilisome-containing organisms

Low temperature (77K) linear dichroism spectroscopy was used to characterize pigment orientation changes accompanying the light state transition in the cyanobacterium, Synechococcus sp. pee 6301, and cold-hardening in winter rye (Secale cereale L. cv. Puma). Samples were oriented for spectroscopy using the gel squeezing method (Abdourakhmanov et aI., 1979) and brought to 77K in liquid nitrogen. The linear dichroism (LD) spectra of Synechococcus 6301 phycobilisome/thylakoid membrane fragments cross-linked in light state 1 and light state 2 with glutaraldehyde showed differences in both chlorophyll a and phycobilin orientation. A decrease in the relative amplitude of the 681nm chlorophyll a positive LD peak was observed in membrane fragments in state 2. Reorientation of the phycobilisome (PBS) during the transition to state 2 resulted in an increase in core allophycocyanin absorption parallel to the membrane, and a decrease in rod phycocyanin parallel absorption. This result supports the "spillover" and "PBS detachment" models of the light state transition in PBS-containing organisms, but not the "mobile PBS" model. A model was proposed for PBS reorientation upon transition to state 2, consisting of a tilt in the antenna complex with respect to the membrane plane. Linear dichroism spectra of PBS/thylakoid fragments from the red alga, Porphyridium cruentum, grown in green light (containing relatively more PSI) and red light (containing relatively more PSll) were compared to identify chlorophyll a absorption bands associated with each photosystem. Spectra from red light - grown samples had a larger positive LD signal on the short wavelength side of the 686nm chlorophyll a peak than those from green light - grown fragments. These results support the identification of the difference in linear dichroism seen at 681nm in Synechococcus spectra as a reorientation of PSll chromophores. Linear dichroism spectra were taken of thylakoid membranes isolated from winter rye grown at 20°C (non-hardened) and 5°C (cold-hardened). Differences were seen in the orientation of chlorophyll b relative to chlorophyll a. An increase in parallel absorption was identified at the long-wavelength chlorophyll a absorption peak, along with a decrease in parallel absorption from chlorophyll b chromophores. The same changes in relative pigment orientation were seen in the LD of isolated hardened and non-hardened light-harvesting antenna complexes (LHCII). It was concluded that orientational differences in LHCII pigments were responsible for thylakoid LD differences. Changes in pigment orientation, along with differences observed in long-wavelength absorption and in the overall magnitude of LD in hardened and non-hardened complexes, could be explained by the higher LHCII monomer:oligomer ratio in hardened rye (Huner et ai., 1987) if differences in this ratio affect differential light scattering properties, or fluctuation of chromophore orientation in the isolated LHCII sample.

The effect of lysobisphosphatidic acid (LBPA) on α-tocopherol transfer protein (α-TTP) binding to lipid membranes

The a-tocopherol transfer protein (a-TTP) is responsible for the retention of the atocopherol form of vitamin E in living organisms. The detailed ligand transfer mechanism by a-TTP is still yet to be fully elucidated. To date, studies show that a-TTP transfers a-tocopherol from late endosomes in liver cells to the plasma membrane where it is repackaged into very low density lipoprotein (VLDL) and released into the circulation. Late endosomes have been shown to contain a lipid known as lysobisphosphatidic acid (LBP A) that is unique to this cellular compartment. LBPA plays a role in intracellular trafficking and controlling membrane curvature. Taking these observations into account plus the fact that certain proteins are recruited to membranes based on membrane curvature, the specific aim of this project was to examine the effect of LBP A on a-TTP binding to lipid membranes. To achieve this objective, dual polarization interferometry (DPI) and a vesicle binding assay were employed. Whilst DPI allows protein binding affinity to be measured on a flat lipid surface, the vesicle binding assay determines protein binding affinity to lipid vesicles mimicking curved membranes. DPI analysis revealed that the amount of a-TTP bound to lipid membranes is higher when LBPA is present. Using the vesicle binding assay, a similar result was seen where a greater amount of protein is bound to large unilamellar vesicles (LUV s) containing LBP A. However, the effect of LBP A was attenuated when small unilamellar vesicles (SUVs) were replaced with LUVs. The outcome of this project suggests that aTTP binding to membranes is influenced by membrane curvature, which in turn is induced by the presence of LBP A.

Caractérisation du co-transporteur Na+/myo-inositol SMIT2 dans les membranes en bordure en brosse de rein de lapin et d’intestin de rat

Le myo-inositol (MI) est un soluté organique impliqué dans diverses fonctions physiologiques de la cellule dont la signalisation cellulaire. Il est également un osmolyte compatible reconnu. Trois co-transporteurs de type actif secondaire responsables de son absorption ont été identifiés. Deux d’entre eux sont couplés au transport du sodium (SMIT1 et SMIT2) et le troisième est couplé au transport de protons (HMIT). L’objectif de cette étude a été la caractérisation du transport du MI par SMIT2 dans des membranes en bordure en brosse (BBMv) issues du rein de lapin et de l’intestin de rat ainsi qu’après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis. La quantification de l’ARNm de SMIT1 et de SMIT2 dans le rein nous a appris que SMIT1 est majoritairement présent dans la médullaire alors que SMIT2 est principalement localisé dans le cortex. Ces résultats ont été confirmés par immunobuvardage en utilisant un anticorps dirigé contre SMIT2. Grâce à l’inhibition sélective de SMIT1 par le L-Fucose et de SMIT2 par le D-chiro-inositol (DCI), nous avons démontré que SMIT2 semble le seul responsable du transport luminal de MI dans le tubule contourné proximal avec un Km de 57 ± 14 µM. Pour ce qui est de l’intestin, des études de transport de MI radioactif ont démontré une absence de transport de MI chez le lapin alors que l’intestin de rat présente un transport de MI très actif. Une quantification par qRT-PCR nous a permis de constater que l’intestin de lapin ne semble pas posséder les transporteurs de MI nécessaires. Comme pour le rein, SMIT2 semble le seul transporteur de MI présent au niveau du pôle apical des entérocytes intestinaux chez le rat. Il est chargé du prélèvement du MI de l'alimentation avec un Km de 150 ± 40 µM. Les analyses fonctionnelles exécutées sur SMIT2 de rat en électrophysiologie après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis donnent sensiblement les mêmes résultats que pour les BBMv de rein de lapin et d’intestin de rat. Dans les ovocytes, SMIT2 présente une grande affinité pour le MI (270 ± 19 µM) et le DCI (310 ± 60 µM) et aucune affinité pour le L-fucose. Il est ii également très sensible à la phlorizine (16 ± 7 µM). Une seule exception persiste : la constante d’affinité pour le glucose dans les BBMv d’intestin de rat est 40 fois plus petite que celle observée sur les ovocytes de Xenopus laevis. Nous avons également testé la capacité de certains transporteurs de sucre présents à la surface des membranes apicales des entérocytes à prélever le MI. Vu que l'inhibition de ces transporteurs (SGLT1 et GLUT5) ne changeait rien au taux de MI radioactif transporté, nous en avons conclu qu'ils ne sont pas impliqués dans son transport. Finalement, l’efflux de MI à partir du pôle basolatéral des entérocytes n’est pas effectué par GLUT2 puisque ce dernier lorsqu'il est exprimé dans des ovocytes, est incapable de transporter le MI.

The role of EphB6 and ephrinbs in blood pressure regulation

L’hypertension artérielle est le facteur de risque le plus important dans les maladies cardiovasculaires (MCV) et les accidents vasculaires cérébraux (AVC). L’hypertension artérielle essentielle est une maladie complexe, multifactorielle et polygénique. Même si on a identifié de nombreux facteurs de risque de l’hypertension artérielle, on ne comprend pas encore clairement les mécanismes qui la régissent. Les kinases hépatocytes produisant l’érythropoïétine (Eph) constituent la plus grande famille des récepteurs tyrosine kinase qui se lient à des ligands de surface cellulaire appelés éphrines sur les cellules avoisinantes. On sait que les interactions de Eph et des éphrines sont essentielles aussi bien dans les processus de développement que dans le fonctionnement des organes et des tissus adultes. Cependant on n’a pas encore étudié la relation entre Eph/éphrines et l’hypertension artérielle. Nous avons créé des modèles de souris knockout (K.O.) Ephb6-/-, Efnb1-/- et Efnb3-/- pour cette étude. Dans le modèle EphB6-/-, nous avons observé que les souris K.O. Ephb6 castrées, mais pas les femelles, ainsi que les souris mâles non castrées présentaient une tension artérielle élevée (TA) par rapport à leurs homologues de type sauvage (TS). Ceci suggère que Ephb6 doit agir de concert avec l’hormone sexuelle mâle pour réguler la TA. Les petites artères des mâles castrés Ephb6-/- présentaient une augmentation de la contractilité, une activation de RhoA et une phosphorylation constitutive de la chaîne légère de la myosine (CLM) lorsque comparées à celles de leurs homologues TS. Ces deux derniers résultats indiquent que la phosphorylation de CLM et de RhoA passe par la voie de signalisation de Ephb6 dans les cellules du muscle lisse de la paroi vasculaire (CMLV). Nous avons démontré que la réticulation de Efnbs mais non celle de Ephb6 aboutit à une réduction de la contractilité des CMLV. Ceci montre que l’effet de Ephb6 passe par la signalisation inversée à travers Efnb. Dans le modèle Efnb1-/- conditionnel spécifique au muscle lisse, nous n’avons observé aucune différence entre Efnb1-/- et les souris de TS concernant la mesure de la TA dans des conditions normales. Cependant, la TA des souris K.O. Efnb1 lors d’un stress d’immobilisation est supérieure à celle des souris de TS. Dans les petites artères des souris K.O. Efnb1, le rétrécissement et la phosphorylation de CLM étaient élevés. In vitro, la contractilité et l’activation RhoA de la CMLV des souris TS étaient augmentées quand leur Efnb1 était réticulé. Ces résultats corroborent ceux des souris KO Ephb6 et prouvent que l’effet de Ephb6 dans le contrôle de la TA se produit au moins par l’intermédiaire d’un de ses ligands Efnb1 dans les CMLV. Dans le modèle Efnb3-/-, on a observé une augmentation de la TA et du rétrécissement des vaisseaux chez les femelles Efnb3-/-, mais non chez les mâles; l’échographie a aussi révélé une résistance accrue au débit sanguin des souris K.O. femelles. Cependant la mutation de Efnb3 ne modifie pas la phosphorylation de la CLM ou l’activation de RhoA in vivo. Dans l’expérience in vitro, les CMLV des souris femelles Efnb3-/- ont présenté une augmentation de la contractilité mais pas celle des souris mâles Efnb3-/-. La réticulation des CMLV chez les mâles ou les femelles de TS avec solide anti-Efnb3 Ab peut réduire leur contractilité. Notre étude est la première à évaluer le rôle de Eph/éphrines dans la régulation de la TA. Elle montre que les signalisations Eph/éphrines sont impliquées dans le contrôle de la TA. La signalisation inverse est principalement responsable du phénotype élevé de la TA. Bien que les Efnb1, Efnb3 appartiennent à la même famille, leur fonction et leur efficacité dans la régulation de la TA pourraient être différentes. La découverte de Eph/Efnb nous permet d’explorer plus avant les mécanismes qui gouvernent la TA.

Functional Analysis of Nuclear beta-Adrenergic Receptors in the Myocardium

Récemment plusieurs récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) ont été caractérisés au niveau des membranes intracellulaires, dont la membrane nucléaire. Notre objectif était de déterminer si les sous-types de récepteurs β-adrénergiques (βAR) et leurs machineries de signalisation étaient fonctionnels et localisés à la membrane nucléaire des cardiomyocytes. Nous avons démontré la présence des β1AR et β3AR, mais pas du β2AR à la membrane nucléaire de myocytes ventriculaires adultes par immunobuvardage, par microscopie confocale, et par des essais fonctionnels. De plus, certains partenaires de signalisation comme les protéines GαS, Gαi, l’adénylate cyclase II, et V/VI y étaient également localisés. Les sous-types de βAR nucléaires étaient fonctionnels puisqu'ils pouvaient lier leurs ligands et activer leurs effecteurs. En utilisant des noyaux isolés, nous avons observé que l'agoniste non-sélectif isoprotérénol (ISO), et que le BRL37344, un ligand sélectif du β3AR, stimulaient l'initiation de la synthèse de l’ARN, contrairement à l'agoniste sélectif du β1AR, le xamotérol. Cette synthèse était abolie par la toxine pertussique (PTX). Cependant, la stimulation des récepteurs nucléaires de type B de l’endothéline (ETB) causaient une réduction de l'initiation de la synthèse d’ARN. Les voies de signalisations impliquées dans la régulation de la synthèse d’ARN par les RCPGs ont ensuite été étudiées en utilisant des noyaux isolés stimulés par des agonistes en présence ou absence de différents inhibiteurs des voies MAP Kinases (proteines kinases activées par mitogènes) et de la voie PI3K/PKB. Les protéines impliquées dans les voies de signalisation de p38, JNK, ERK MAP Kinase et PKB étaient présents dans les noyaux isolés. L'inhibition de PKB par la triciribine, inhibait la synthèse d’ARN. Nous avons ensuite pu mettre en évidence par qPCR que la stimulation par l’ISO entrainait une augmentation du niveau d'ARNr 18S ainsi qu’une diminution de l'expression d’ARNm de NFκB. En contraste, l’ET-1 n’avait aucun effet sur le niveau d’expression de l’ARNr 18S. Nous avons ensuite montré que la stimulation par l’ISO réduisait l’expression de plusieurs gènes impliqués dans l'activation de NFκB, tandis que l’inhibition de ERK1/2 et PKB renversait cet effet. Un microarray global nous a ensuite permis de démontrer que les βARs et les ETRs nucléaires régulaient un grand nombre de gènes distincts. Finalement, les βARs et ETRs nucléaires augmentaient aussi une production de NO de noyaux isolés, ce qui pouvait être inhibée par le LNAME. Ces résultats ont été confirmés dans des cardiomyocytes intacts en utilisant des analogues cagés et perméables d’ISO et de l'ET-1: l'augmentation de NO nucléaire détectée par DAF2-DA, causée par l'ET-1 et l'ISO, pouvait être prévenue par le LNAME. Finalement, l’augmentation de l’initiation de la transcription induite par l'ISO était aussi bloquée par le L-NAME ou par un inbitheur de PKG, le KT5823, suggérant que la voie NO-GC-PKG est impliquée dans la régulation de la transcription par les βAR. En conclusion, les βARs et les ETRs nucléaires utilisent des voies de signalisation différentes et exercent ainsi des effets distincts sur l’expression des gènes cardiaques. Ils représentent donc une avenue intéressante pour le développement de drogues pharmacologiques.

A study of chymotrypsin immobilization conditions for improved peptide mapping

La cartographie peptidique est une technique de grande importance utilisée lors de l’identification des protéines et la caractérisation des modifications post-traductionnelles des protéines. Deux méthodes sont utilisées afin de couper les protéines en peptides pour la cartographie : les méthodes chimiques et les méthodes enzymatiques. Dans ce projet, l’enzyme chymotrypsine a été utilisée pour l’hydrolyse (la digestion) des liens peptidiques. Cependant, l’autoprotéolyse des enzymes peut augmenter la complexité des échantillons, rendant ainsi ardue l’obtention de pics résolus suite à l’apparition de pics non-désirés dans la carte peptidique. Par conséquent, nous avons utilisé la réticulation des enzymes protéolytiques par réaction avec le glutaraldéhyde (GA) donnant une enzyme insoluble afin de réduire l’autoprotéolyse. L’immobilisation de la chymotrypsine par GA a été effectuée selon une méthode rapportée précédemment par le groupe Waldron. L’électrophorèse capillaire (CE) couplée à l’absorption UV-visible a été utilisée pour la séparation et la détection de peptides et pour obtenir ainsi une cartographie peptidique. Deux tampons différents ont été évalués afin d’obtenir les meilleures conditions pour la digestion de substrats protéiques par la chymotrypsine libre (soluble) ou la GAchymotrypsine et l’analyse par CE. Les cartes des peptides autoprotéolytiques ont été comparées entre les deux formats de chymotrypsine. Afin d’améliorer la cartographie peptidique, nous avons évalué trois méthodes de conditionnement du capillaire CE et deux méthodes pour stopper la digestion. Le bicarbonate d’ammonium s’est avéré être le tampon optimal pour la digestion en solution et l’utilisation d’un bain d’acétone et de glace sèche s’est avérée être la méthode optimale pour stopper la digestion. Une solution de SDS, 25 mM, dans l’étape de rinçage a été utilisée après chaque analyse CE et a permis d’améliorer la résolution des cartes peptidiques. La comparaison entre l’autoprotéolyse de la chymotrypsine libre et de celle immobilisé par GA a été effectuée par des tests utilisant une gamme de six différentes combinaisons de conditions afin d’évaluer le temps (30 et 240 min) et la température de digestion (4, 24 et 37°C). Dans ces conditions, nos résultats ont confirmé que le GA-chymotrypsine réduit l’autoprotéolyse par rapport à l’enzyme libre. La digestion (à 37°C/240 min) de deux substrats modèles par la chymotrypsine libre et immobilisée en fonction de la température de dénaturation du substrat a été étudiée. iii Avant la digestion, les substrats (l’albumine de sérum bovine, BSA, et la myoglobine) ont été dénaturés par chauffage pendant 45 min à trois températures différentes (60, 75 et 90°C). Les résultats ont démontré que la dénaturation par chauffage du BSA et de la myoglobine n’a pas amélioré la cartographie peptidique pour la GA-chymotrypsine, tandis que la digestion de ceux-ci en présence de la chymotrypsine libre a amélioré de façon quantifiable à des températures élevées. Ainsi, le chauffage du substrat à 90°C avec l’enzyme soluble facilite le dépliement partiel du substrat et sa digestion limitée, ce qui a été mieux pour la myoglobine que pour la BSA.

Searching for novel gene functions in yeast : identification of thousands of novel molecular interactions by protein-fragment complementation assay followed by automated gene function prediction and high-throughput lipidomics

La compréhension de processus biologiques complexes requiert des approches expérimentales et informatiques sophistiquées. Les récents progrès dans le domaine des stratégies génomiques fonctionnelles mettent dorénavant à notre disposition de puissants outils de collecte de données sur l’interconnectivité des gènes, des protéines et des petites molécules, dans le but d’étudier les principes organisationnels de leurs réseaux cellulaires. L’intégration de ces connaissances au sein d’un cadre de référence en biologie systémique permettrait la prédiction de nouvelles fonctions de gènes qui demeurent non caractérisées à ce jour. Afin de réaliser de telles prédictions à l’échelle génomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons développé une stratégie innovatrice qui combine le criblage interactomique à haut débit des interactions protéines-protéines, la prédiction de la fonction des gènes in silico ainsi que la validation de ces prédictions avec la lipidomique à haut débit. D’abord, nous avons exécuté un dépistage à grande échelle des interactions protéines-protéines à l’aide de la complémentation de fragments protéiques. Cette méthode a permis de déceler des interactions in vivo entre les protéines exprimées par leurs promoteurs naturels. De plus, aucun biais lié aux interactions des membranes n’a pu être mis en évidence avec cette méthode, comparativement aux autres techniques existantes qui décèlent les interactions protéines-protéines. Conséquemment, nous avons découvert plusieurs nouvelles interactions et nous avons augmenté la couverture d’un interactome d’homéostasie lipidique dont la compréhension demeure encore incomplète à ce jour. Par la suite, nous avons appliqué un algorithme d’apprentissage afin d’identifier huit gènes non caractérisés ayant un rôle potentiel dans le métabolisme des lipides. Finalement, nous avons étudié si ces gènes et un groupe de régulateurs transcriptionnels distincts, non préalablement impliqués avec les lipides, avaient un rôle dans l’homéostasie des lipides. Dans ce but, nous avons analysé les lipidomes des délétions mutantes de gènes sélectionnés. Afin d’examiner une grande quantité de souches, nous avons développé une plateforme à haut débit pour le criblage lipidomique à contenu élevé des bibliothèques de levures mutantes. Cette plateforme consiste en la spectrométrie de masse à haute resolution Orbitrap et en un cadre de traitement des données dédié et supportant le phénotypage des lipides de centaines de mutations de Saccharomyces cerevisiae. Les méthodes expérimentales en lipidomiques ont confirmé les prédictions fonctionnelles en démontrant certaines différences au sein des phénotypes métaboliques lipidiques des délétions mutantes ayant une absence des gènes YBR141C et YJR015W, connus pour leur implication dans le métabolisme des lipides. Une altération du phénotype lipidique a également été observé pour une délétion mutante du facteur de transcription KAR4 qui n’avait pas été auparavant lié au métabolisme lipidique. Tous ces résultats démontrent qu’un processus qui intègre l’acquisition de nouvelles interactions moléculaires, la prédiction informatique des fonctions des gènes et une plateforme lipidomique innovatrice à haut débit , constitue un ajout important aux méthodologies existantes en biologie systémique. Les développements en méthodologies génomiques fonctionnelles et en technologies lipidomiques fournissent donc de nouveaux moyens pour étudier les réseaux biologiques des eucaryotes supérieurs, incluant les mammifères. Par conséquent, le stratégie présenté ici détient un potentiel d’application au sein d’organismes plus complexes.

Role of Nuclear Angiotensin-II Receptor Mediated Signalling in Cardiovascular Remodelling

Le remodelage cardiaque est le processus par lequel la structure ou la fonction cardiaque change en réponse à un déséquilibre pathophysiologique tel qu'une maladie cardiaque, un contexte d'arythmie prolongée ou une modification de l'équilibre hormonal. Le système rénine-angiotensine (SRA) est un système hormonal largement étudié et il est impliqué dans de nombreuses activités associées au remodelage cardiovasculaire. L’existence d'un système circulatoire couplé à un système de tissus locaux est une représentation classique, cependant de nouvelles données suggèrent un SRA indépendant et fonctionnellement actif à l'échelle cellulaire. La compréhension de l'activité intracellulaire du SRA pourrait mener à de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourraient prévenir un remodelage cardiovasculaire défavorable. L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle du SRA intracellulaire dans les cellules cardiaques. Récemment, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les protéines G et leurs effecteurs ont été détectés sur des membranes intracellulaires, y compris sur la membrane nucléaire, et les concepts de RCPG intracellulaires fonctionnels sont en voie d'être acceptés comme une réalité. Nous avons dès lors fait l'hypothèse que la signalisation du SRA délimitant le noyau était impliquée dans le contrôle de l'expression des gènes cardiaques. Nous avons démontré la présence de récepteurs d'angiotensine de type-1 (AT1R) et de type-2 (AT2R) nucléaires dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes et dans une fraction nucléaire purifiée de tissu cardiaque. Des quantités d'Ang II ont été détectées dans du lysat de cardiomyocytes et des microinjections d'Ang-II-FITC ont donné lieu à des liaisons préférentielles aux sites nucléaires. L'analyse transcriptionnelle prouve que la synthèse d'ARN de novo dans des noyaux isolés stimulés à l'Ang-II, et l'expression des ARNm de NF-κB étaient beaucoup plus importants lorsque les noyaux étaient exposés à de l'Ang II par rapport aux cardiomyocytes intacts. La stimulation des AT1R nucléaires a engendré une mobilisation de Ca2+ via les récepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3R), et le blocage des IP3R a diminué la réponse transcriptionnelle. Les méthodes disponibles actuellement pour l'étude de la signalisation intracrine sont limitées aux méthodes indirectes. L'un des objectifs de cette thèse était de synthétiser et caractériser des analogues d'Ang-II cellule-perméants afin d’étudier spécifiquement dans les cellules intactes l'activité intracellulaire du SRA. Nous avons synthétisé et caractérisé pharmacologiquement des analogues photosensibles Ang-II encapsulée en incorporant un groupement 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) photoclivable sur les sites actifs identifiés du peptide. Chacun des trois analogues d'Ang II encapsulée synthétisés et purifiés: [Tyr(DMNB)4]Ang-II, Ang-II-ODMNB et [Tyr(DMNB)4]Ang-II-ODMNB a montré une réduction par un facteur deux ou trois de l'affinité de liaison envers AT1R et AT2R dans les dosages par liaison compétitive et une activité réduite dans la contraction de l'aorte thoracique. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans des cellules HEK a augmenté la phosphorylation d'ERK1/2 (via AT1R) et la production de cGMP (via AT2R) alors que dans les cardiomyocytes isolés elle générait une augmentation de Ca2+ nucléoplasmique et initiait la synthèse d'ARNr 18S et d'ARNm du NF-κB. Les fibroblastes sont les principaux générateurs de remodelage cardiaque structurel, et les fibroblastes auriculaires sont plus réactifs aux stimuli profibrotiques que les fibroblastes ventriculaires. Nous avons émis l'hypothèse que l’Ang-II intracellulaire et l'activation des AT1R et AT2R nucléaires associés contrôlaient les profils d'expression des gènes des fibroblastes via des systèmes de signalisation distincts et de ce fait jouaient un rôle majeur dans le développement de la fibrose cardiaque. Nous avons remarqué que les fibroblastes auriculaires expriment l’AT1R et l’AT2R nucléaire et l'Ang-II au niveau intracellulaire. L’expression d'AT1R nucléaire a été régulés positivement dans les cas d’insuffisance cardiaque (IC), tandis que l'AT2R nucléaire a été glycosylé post-traductionnellement. La machinerie protéique des protéines G, y compris Gαq/11, Gαi/3, et Gβ, a été observée dans des noyaux isolés de fibroblastes. AT1R et AT2R régulent l'initiation de la transcription du fibroblaste via les voies de transduction de signal d'IP3R et du NO. La photostimulation de [Tyr(DMNB)4]Ang-II dans une culture de fibroblastes auriculaire déclenche la libération de Ca2+ nucléoplasmique, la prolifération, et la synthèse et sécrétion de collagène qui ne sont pas inhibées par les bloqueurs d'AT1R et/ou AT2R extracellulaires.