A study of chymotrypsin immobilization conditions for improved peptide mapping

La cartographie peptidique est une technique de grande importance utilisée lors de l’identification des protéines et la caractérisation des modifications post-traductionnelles des protéines. Deux méthodes sont utilisées afin de couper les protéines en peptides pour la cartographie : les méthodes chimiques et les méthodes enzymatiques. Dans ce projet, l’enzyme chymotrypsine a été utilisée pour l’hydrolyse (la digestion) des liens peptidiques. Cependant, l’autoprotéolyse des enzymes peut augmenter la complexité des échantillons, rendant ainsi ardue l’obtention de pics résolus suite à l’apparition de pics non-désirés dans la carte peptidique. Par conséquent, nous avons utilisé la réticulation des enzymes protéolytiques par réaction avec le glutaraldéhyde (GA) donnant une enzyme insoluble afin de réduire l’autoprotéolyse. L’immobilisation de la chymotrypsine par GA a été effectuée selon une méthode rapportée précédemment par le groupe Waldron. L’électrophorèse capillaire (CE) couplée à l’absorption UV-visible a été utilisée pour la séparation et la détection de peptides et pour obtenir ainsi une cartographie peptidique. Deux tampons différents ont été évalués afin d’obtenir les meilleures conditions pour la digestion de substrats protéiques par la chymotrypsine libre (soluble) ou la GAchymotrypsine et l’analyse par CE. Les cartes des peptides autoprotéolytiques ont été comparées entre les deux formats de chymotrypsine. Afin d’améliorer la cartographie peptidique, nous avons évalué trois méthodes de conditionnement du capillaire CE et deux méthodes pour stopper la digestion. Le bicarbonate d’ammonium s’est avéré être le tampon optimal pour la digestion en solution et l’utilisation d’un bain d’acétone et de glace sèche s’est avérée être la méthode optimale pour stopper la digestion. Une solution de SDS, 25 mM, dans l’étape de rinçage a été utilisée après chaque analyse CE et a permis d’améliorer la résolution des cartes peptidiques. La comparaison entre l’autoprotéolyse de la chymotrypsine libre et de celle immobilisé par GA a été effectuée par des tests utilisant une gamme de six différentes combinaisons de conditions afin d’évaluer le temps (30 et 240 min) et la température de digestion (4, 24 et 37°C). Dans ces conditions, nos résultats ont confirmé que le GA-chymotrypsine réduit l’autoprotéolyse par rapport à l’enzyme libre. La digestion (à 37°C/240 min) de deux substrats modèles par la chymotrypsine libre et immobilisée en fonction de la température de dénaturation du substrat a été étudiée. iii Avant la digestion, les substrats (l’albumine de sérum bovine, BSA, et la myoglobine) ont été dénaturés par chauffage pendant 45 min à trois températures différentes (60, 75 et 90°C). Les résultats ont démontré que la dénaturation par chauffage du BSA et de la myoglobine n’a pas amélioré la cartographie peptidique pour la GA-chymotrypsine, tandis que la digestion de ceux-ci en présence de la chymotrypsine libre a amélioré de façon quantifiable à des températures élevées. Ainsi, le chauffage du substrat à 90°C avec l’enzyme soluble facilite le dépliement partiel du substrat et sa digestion limitée, ce qui a été mieux pour la myoglobine que pour la BSA.

Peptide mapping is an important technique used in conjunction with other methods to identify proteins and characterize post-translational modifications. To cleave proteins into small peptides for mapping, chemical and/or enzymatic methods are used. In the present study, the enzyme chymotrypsin was used for hydrolysis (digestion) of peptide bonds. A drawback of using soluble enzyme is autoproteolysis, the formation of peptides coming from chymotrypsin, giving unwanted peaks in the peptide map of the protein substrate. Therefore, making chymotrypsin immobile by cross-linking it with glutaraldehyde (GA) to avoid unwanted autoproteolysis peaks has been used in the present work. GA cross-linking for enzyme immobilization was carried out based on a method described previously in the Waldron group. Capillary electrophoresis (CE) was used for separation of the peptides (i.e., peptide mapping) as a way to evaluate digestion efficiency of soluble versus immobilized chymotrypsin. To investigate the best conditions for digestion of protein substrate by free (soluble) versus GA-cross-linked chymotrypsin prior to analysis by CE, two different buffers were evaluated (ammonium bicarbonate and Tris-HCl). The maps of autoproteolysis peptides were compared between the two chymotrypsin formats. To improve the peptide maps obtained by CE, again using autoproteolysis of chymotrypsin without substrate present, three methods for capillary conditioning and two methods for terminating the digestion were investigated. Ammonium bicarbonate was found to be the best digestion buffer and a dry ice/acetone bath was the best method for stopping the digestion, with both of these giving better CE-based peptide maps. Adding 25 mM SDS in the post-conditioning capillary rinse was demonstrated to further improve peptide mapping. The autoproteolysis of soluble and GA-chymotrypsin were compared under 6 different conditions of digestion time (30 and 240 min) and temperature (4, 24 and 37ºC). Under these conditions, our results confirmed that the GA-cross-linking reduces chymotrypsin autoproteolysis compared to the free enzyme. Digestion (at 37ºC/240 min) of two model substrates with free or immobilized chymotrypsin as a function of heat-induced denaturation of substrate was studied. Prior to digestion, the substrates (bovine serum albumin, BSA, and myoglobin) were denatured by v heating for 45 min at three different temperatures (60, 75, and 90ºC). The results showed heat-induced denaturation of BSA and myoglobin did not improve peptide maps when using GA-chymotrypsin digestion compared to using free chymotrypsin, although the latter improved with heat-induced denaturation at higher temperatures. Therefore, heating the substrate to 90ºC and using soluble enzyme provided some unfolding of substrate and limited digestion, which was better for myoglobin than for BSA.